Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
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この作品はカーン ニューロ開発賞受賞 (の OC) と国家機関の健康/国立研究所の神経疾患脳卒中 (NIH/NINDS) 部分で資金が供給された (R01 NS085011 の OC に)。

1. システム設計・ ウイルス制作
<ol><li>プラスミド設計・施工 注:生産を使用して、すべての 1 つの LV-gRNA-dCas9-DNMT3A ベクターの構築を実行- と Ortinski ら30刊式最適化式カセット。ベクトル カセット運ぶ転写因子 Sp1 と最新の削除、無変換内の認識サイトの繰り返し (U3') 3'-長いターミナルの繰り返し (LTR) (図 2 a)30...

LVs は、遺伝性疾患の中で特に、エピゲノムの編集のための最適な手段として浮上し始めている、主に能力 (i) に対応するため大規模な DNA ペイロード、および (ii) 効率的に変換分割の広い範囲と非分裂細胞。LVs の大型包装効果が特大 CRISPR/dCas9 システムのパッケージを含むアプリケーションは特に有益です。このような観点からは、LVs は、オール イン ワン CRISPR/Cas9 システムの配信のための?...

複数のエピゲノム編集プラットフォームは、最近遺伝子式1,2を制御する領域の任意の DNA シーケンスをターゲットとして開発されたが。作成したエピゲノム編集ツールは、(i) の転写を調節する、(ii) 変更ヒストン翻訳後修飾、(iii) DNA のメチル化の変更、(iv) 規制要素の相互作用を調節するのに設計されています。非アクティブ化された (死んで) Cas9 に転写・ クロマチン修飾子をアンカーへのアプローチ (dCas9) 発生以前から亜鉛などの先進のエピゲノム編集プラットフォーム指蛋白質 (ZFPs) と転写活性化因子のようなエフェクタ (テイルズ)強力な転写エフェクター ドメインをかくまっている (ED) の設計の DNA 結合ドメイン (DBD)3を融合しました。活性化や抑圧など所望の表現型の結果は、内在性の遺伝子座 (図 1) に固定されてエフェクター分子によって定義されます。プログラム可能な転写活性化因子を作成するには、dCas9/gRNA モジュールは VP164,5,6 (図 1 a)、Pol II と一般転写機械をリクルートするウイルス活性化ドメインにリンクされます。このシステムの変更は、VP64、VP16 ドメインの四量体よりも強力な活性化率5,6を提供する含まれています。システムは、正常にプロモーターと規制要素をターゲットしてコーディングおよび非翻訳領域をアクティブに採用されています。重要なは、にもかかわらず、VP64 分子は、ターゲット領域のクロマチン構造を直接変更しないでください、それはクロマチンの修飾子は H3 ・ H4 アセチル化と H3 K4 di としてを含むアクティブ (ユークロマチン) マークの沈着の結果をバインドを募集/tri-メチル化5,6。VP64、に加えて人間の NF-κ B の複合体の p65 サブユニットを dCas9/gRNA モジュール7に繋留されています。興味深いことに、強い遺伝子発現誘導の結果地域上流転写開始部位 (TSSs) とプロモーター内にこれらのエフェクターのテザリングします。それにもかかわらず、VP64、p65 のエフェクタにリンクされている遠位エンハンサー7、8TSSs の下流側にある地域も賦活効果を発揮できます。堅牢な転写応答を引き出す複数の dCas9 VP64 または dCas9 p65 の融合が単一ターゲットの軌跡9,10に募集する必要があります。DCas9 VP64 融合対応11比較活性化強力な機能で単一 dCas9 gRNA 複合体、SunTag などによって複数のエフェクター ドメインを採用する次世代の活性剤の最近の開発をもたらしたなど,12. 転写制御の改善、VP64、p65、Rta (VPR)、dCas913 (図 1 a) の C 末端に γ-ヘルペス ウイルスの転写活性化ドメインの融合によって取得されました。同様の CRISPR/dCas9 システムは、ターゲット固有の抑圧 (図 1 b) に開発されています。
内因性遺伝子の抑圧は、さまざまなメカニズム (図 1 b) を人工リプレッサーの融合で実現できます。(なくてもエフェクター ドメイン/s) は、リプレッサー DBD にリンク CRISPR/dCas9 システムが遺伝子発現プロモーターや上流/下流 TSS 地域3,6 につながれたときに沈黙が効率的にそれが実証されています、14。転写に及ぼす影響は、転写因子結合と RNA ポリメラーゼ加工立体干渉が原因です。それにもかかわらず、単独で立体障害によって遺伝子発現抑制が頻繁に堅牢な沈黙のために十分より包括的なアプローチが必要です。転写リプレッサー ドメイン (Trd) ヒストン修飾子を運ぶ CRISPR/dCas9 システムに基づくサイレンサーの次世代の最近の開発 (H3 K9 ディ-/トリ メチル化、H3 K27 ディ-/tri-メチル化;H3-K36 ・ ディ ・-/トリ メチル化、脱アセチル化 H3 ・ H4)、およびエピジェネティックなサイレンシング効果4,5,15,16より堅牢なツールの建設につながった (CpG) DNA メチル化 17,18,19,20。それは、DNA にこれらのエピジェネティックな修飾子の募集は通常より強力なサイレンシング結果21,22に生成より閉鎖と凝縮したクロマチンの形成につながることを実証されています。つながれてで使用される最も一般的サイレンシング ドメインは Krüppel 関連付けられているボックス (ボブ)4,5です。要因の採用は、クロマチンの変化に対応する実証されています。それにもかかわらず、これらの変更のメカニズムはまだ解明16,17,18をします。最近では、それは DNA に KRAB の局在化はヒストン メチルトランスフェラーゼ SETDB1 のヒストンの脱アセチル化 (HDAC) NuRD 複合体で、これらの相互作用の形成を仲介する可能性が示唆されたアセンブリを促進することが示されています。chromatin の凝縮が、転写のサイレンシング3,13。別のアプローチとしてエフェクター ドメインはつながれてカスタム エピジェネティックなサイレンシング蛋白質を作成するために融合されます。このシステムは、抑圧的な DNA のマークやヒストンの修正に直接触媒します。
最近、DNMT3A 酵素につながれた合成の CRISPR/dCas9 システムの使用用途が変更されて転写不活性化のため。DNMT3A 内因性遺伝子プロモーターと他の規制地域 (図 1 b)18,20異質染色質の形成を通して転写抑制を発揮する DNA のメチル化を触媒します。マクドナルドら18とボイタら20エピゲノム遺伝子サイレンシングまたはプラスミド配信 dCas9 DNMT3A の融合システムが高めることができる強力デモ抑圧用 DNA のメチル化することができますを報告する最初の作家であったTSS18,20前後のシトシンのメチル化。マクドナルドと同僚戦略の雇用により、大幅に低減 (約 40%) されることを示した腫瘍抑制遺伝子CDKN2A mRNA レベル18です。同様に、バッハやIL6ST遺伝子の非メチル化プロモーター領域をターゲット遺伝子発現20二重減少と相関している増加の CpG メチル化を示しています。私たちの研究室は最近SNCA過剰発現 (図 2)23の病理結果を減衰のため DNA のメチル化の使用を再利用します。戦略に基づくSNCAイントロン 1 領域内での DNA メチル化の選択的強化以前 PD と痴呆 Lewy ボディ (DLB) 脳24,25、hypomethylated に報告されました。 26。この低いメチル化は、 SNCAの過剰発現は、治療的介入24,27,28にとって魅力的なターゲットを提供していますにリンクされています。我々 は最近、 SNCAイントロン 1 のSNCA 3 倍23PD 患者から得られたこと由来ドーパミン Npc の領域 DNA のメチル化の低レベルを示した。この実験モデルの利点は、Npc の文化で確実伝達またはさらに酸化を含む細胞の表現型を仲介する遺伝的要因を識別するために有効なスクリーニングを可能に成熟したニューロンに区別できることストレス、アポトーシス29。さらに、このモデル システムにより患者の症状発現前に生じた発達のイベントを要約する科学者です。さらに、Npc のこと由来は遺伝子発現に関連する細胞・分子経路をテストするための素晴らしいツールを表します。重要なは、CRISPR/Cas9-エピゲノム技術と組み合わせること由来の Npc では、多くの神経変性疾患の「次世代治療薬」の開発が非常に容易します。
SNCA 式の病理組織学的レベルを減らすためには、最近 dCas9 DNMT3A 融合タンパク質と具体的ターゲット CpG のメチル化SNCAイントロン 1 (図 2 a) 内に gRNA を運ぶレンチ ベースのシステムを開発した23。このプロトコルは、レンチウイルスベクター (LV) の設計・製作の詳細について説明します。LVs を表す CRISPR/dCas9 コンポーネントを提供するいくつかの理由のための効果的な手段、すなわち (i) かさばる DNA を運ぶ能力を挿入します、(ii)30 分割と非分裂細胞を含む細胞の広い範囲の高効率、および (iii) 最小限の細胞毒性や免疫反応を誘導する能力を。最近、 SNCA遺伝子座の 3 倍の患者から LV システムをによる由来ドーパミン作動性ニューロンに適用してエピゲノム編集の配信の LVs の治療の可能性を示すメチル化ツール23 (図 2B)。確かに、LV gRNA/dCas9 DNMT3A システムSNCAイントロン 1 領域における DNA メチル化の大幅な増加が発生します。この増加は、 SNCA mRNA および蛋白質23のレベルの減少で対応しています。また、 SNCAダウンレギュレーションSNCA 3 倍/による由来ドーパミン作動性ニューロン (例えば、ミトコンドリア ROS 生産と細胞生存率)23で PD に関連した表現を救出します。重要なは、我々 は実証 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A システムによるSNCA発現の減少は、を行った PD 患者からによる由来ドーパミン作動性ニューロンの特徴である表現型を反転が可能SNCA 3 倍に、ミトコンドリア ROS 生産と細胞生存率23など。このプロトコルの目的は、生産のプロトコルおよび濃度ウイルス製剤の高 tittered を生成するための最適化された LV プラットフォームの概要を説明するには 1) と 2) hiPSCs の成熟したドーパミンになるパターンの Npc への分化を説明するにはニューロン31,32とSNCAイントロン 1 内の対象領域のメチル化レベルの評価。
レンチ ウイルス プラットフォームすなわちアデノ随伴ベクトル (通気)、大きい遺伝的挿入33,34に対応する元の能力である最も人気のあるベクトル プラットフォーム上の大きな利点があります。通気は有意に高い利回りで生成することができますが、低包装容量を所有 (< 4.8 kb)、オール イン ワン CRISPR/Cas9 システムを提供するための使用を損なうこと。したがって、それは LVs の CRISPR/dCas9 ツールの配信に関連するアプリケーションのプラットフォームの選択になるようです。したがって、ここで説明したプロトコルは細胞や臓器にエピゲノム編集コンポーネントを効果的に配信することを望む研究者にとって貴重なツールになります。プロトコルをさらにベクトル式カセット30,35内の要素の cis 諸国における変更を介してベクトルの生産と表現能力を増すための戦略の概要を説明します。戦略は基づいています小説にシステム開発し私たちの研究室で勉強し、1010ウイルス ユニット (VU)/mL30,35の範囲でウイルス粒子を生成する能力を強調表示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

による細胞の使用は、人間の神経変性疾患の研究に貴重なアプローチを表します。ここでは、α-シヌクレイン遺伝子 (SNCA) 座の 3 倍にパーキンソン病 (PD) 患者由来 hiPSCs の差別化のための最適化されたプロトコルについて述べる-関連するドーパミン作動性ニューロン集団。SNCAの高レベルが特にこれらのSNCA表現の規制をターゲット、PD の新規治療法を確立する必要は満たされていない討認識の開発の原因となることを示している証拠の蓄積我々最近 epigenetically SNCAイントロン 1 規制地域でメチル化レベルを富ませることによってSNCAの転写を調節する CRISPR/dCas9-DNA メチル化-ベースのシステムを開発しました。死んでから成るシステムを提供する Cas9 の (非アクティブ) バージョン (dCas9) は、DNA メチル基転移酵素酵素 3 a の触媒ドメインと融合 (DNMT3A)、レンチ ウイルスのベクトルを使用しています。このシステムは、 SNCA遺伝子座の 3 倍のセルに適用されます、 SNCAmRNA および蛋白質レベルSNCAイントロン 1 のターゲット DNA のメチル化を約 30% 削減します。SNCA レベルの微調整のダウンレギュレーションは、病気に関連した細胞表現を救出します。現在のプロトコルの神経前駆細胞 (Npc) と確立とSNCAのメチル化プロファイルの評価ピロシーケンス法の検証 hiPSCs を区別するための手順を説明を目指しますイントロン 1.詳細にこれらの実験で使用するレンチ-CRISPR/dCas9 システムのアウトラインを作成するには、このプロトコル記述を生成し、浄化、レンチウイルスベクターを集中およびエピゲノムとゲノムの編集アプリケーションを使用して自分の適性を強調表示する方法hiPSCs と Npc。プロトコルは、容易に適応可能であるし、in vitro および in vivo のアプリケーションのための高価レンチを生成する使用ことができます。

比べて、素朴な GFP、LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro ベクトルの生産キャプションの検証
P24ギャグ素朴な GFP/プーロのカウンター パートと LV-dCas9-DNMT3A-GFP/プーロの物理的な抗体価を比較する ELISA を行った。ここに概説されたプロトコルを使用して生成されたベクトルの物理的な利回り匹敵する代表的な結果は、<str...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン レンチウイルスベクターの濃度について説明します-ニューロンを派生しました。

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

レンチウイルスベクタープラットフォームは、特にレンチウイルスベクターが大きな遺伝的挿入物に対応する能力のために、最も一般的なベクタープラットフォームよりも大きな利点を有する。したがって、レンチウイルスベクターは、アプリケーションで選択のプラットフォームになるだろうが、CRISPR / Casツールの配信を伴う。この技術は、障害が発生した場合に疾患に関連するα-シヌクレイン発現の自然調節機構を模倣する。遺伝子発現の発現レベルと堅牢な変化を微調整することができます。私は、スクリーニングのために複数のガイドRNAを使用して、このまたは同様のアプローチを検証することを強くお勧めします。ガイドRNAの効力には大きなばらつきがあります。それを決定する唯一の方法は、堅牢で包括的なスクリーニングと検証です。開発したシステムは、げっ歯類や非ヒト霊長類を含む動物モデルなどの他のモデルシステムに容易に適応することができる。これらのフォローアップ実験は、将来の臨床研究のための概念実証として役立つ可能性があります。この手順を実証するのは、私の研究室の上級スタッフであるエカテリーナ・イリッヒ博士で、このプロジェクトに関連するレンチウイルスベクタープラスミドを作成するための分子クローニング手順の実行に焦点を当てます。彼女はまた、レンチウイルスベクター産生に関与する重要なステップを実証する。また、この手順を実証するのは、ヒトiPS細胞の病理学的関連細胞への分化に焦点を当てた私の研究室のポスドクであるリディア・タリアフィエロ博士です。シヌクレインintron1のメチル化プロファイルを評価するためのアッセイの確立に関する重要なステップを実証します。私の研究室では、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞の培養に焦点を当てたスタッフのアヒラ・スリスマンダ氏。まず、D-Cas9-DNMT3A-GFPから、ベクトルのDNMT3A部分を増幅して、DNMT3A触媒ドメインを開発する。BAMH1制限酵素を用いてDNMT3A断片を消化した後。d-Cas9を運ぶ修飾PBK-301ベクターのBamH1サイトにクローニングし、直接サンガーシーケンシングによって検証し、純粋なマイセンレポーター遺伝子と得られたプラスミドをGFPダイジェストd-Cas9-DNMT3A-P2A純粋なマイセンおよびFSC1を有するプラスミドに置き換える。ゲル精製法を用いてベクター断片を精製する。FSC-1でPBK-201を消化して挿入物を準備します。FSC 1 フラグメントをベクターに複製して、d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP を作成します。トランスフェクションのために0.2%ゼラチンで15センチメートルプレートをコーティングし、10分待ちます。次にゼラチンを吸引し、22.5ミリリットルの高グルコース培地と2.5ミリリットルの以前培養したHEK-293T細胞懸濁液を加える。70~80%合流するまで5%CO2で37°Cでプレートをインキュベートします。115センチメートルのプレートに十分なプラスミド混合を調製するために、原稿に記載された4つのプラスミドを用いた。プラスミドと同じ15ミリリットルチューブに塩化モル1モルの312.5マイクロリットルを加え、滅菌二重蒸留水を使用して最終体積を1.25ミリリットルにします。渦を出しながら、2つのX BBM溶液の1.25ミリリットルをチューブに軽く加えます。室温で30分間インキュベートします。細胞から培地を吸引し、血清なしで調製した高グルコースDMEMの22.5ミリリットルを加える。各プレートに2.5ミリリットルのトランスフェクション混合物を加え、下地にドロップします。プレートを旋回し、インキュベーション後2〜3時間5%CO2で摂氏37度でインキュベートし、1皿あたり2.5ミリリットルの血清を加えて10%希釈を達成し、5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベートします。ウイルスを収穫するには、すべてのトランスフェクトされた細胞から上清を収集し、50ミリリットルの円錐管でそれらを引っ張ります。400~450gの遠心分離機を室温で10分間、上清を0.45マイクロメートル真空フィルターユニットで濾過します。次に、円錐状の超遠分管を準備してスクロース勾配を作成します。各チューブの少なくとも4分の3を充填する各超遠心チューブの間でウイルス上清を均等に分配することにより、慎重に勾配に濾過上清を追加します。70000 g で摂氏17度で 2 時間遠心分離します。30%から60%のショ糖分をクリーンチューブに静かに集めると、冷たい1X PBSが100ミリリットルの総体積とピペットを複数回混ぜ合わせます。各チューブに1X PBSに20%スクロースの4ミリリットルを慎重に加え、各チューブあたり約20〜25ミリリットルのウイルス溶液をピペット化してウイルス製剤を続ける層化する。慎重にチューブのバランスをとり、70000gで摂氏17度で2時間遠心分離します。残りの液体を慎重に吸引し、小さな半透明の斑点としてほとんど見えないペレットを含むウイルスを残してすべての液体を完全に除去する。上清を空にした後、ペーパータオルのチューブを反転させて残りの液体を排出させます。1つ目のチューブに70マイクロリットルの1X PBSを加え、ピペットを十分に加え、ペレットを再懸濁します。サスペンションを次のチューブに移し、すべてのペレットが再懸濁されるまでピペット処理と移送を繰り返します。1つ目のチューブに50マイクロリットルの1X PBSを加え、混ぜて洗浄します。次いで、懸濁液を第2のチューブに移し、洗浄を続け、洗浄を進め、以前のように移し、わずかに乳白色の最終懸濁液の約120マイクロリットルを得る。10000 gで60秒間遠心分離機を使用して、上澄み液を新しいチューブに移し、5マイクロリットルのアリコートを作り、MD NPCのクライオビアルを37°Cのヒートブロックに2分間置き、解凍した細胞を10ミリリットルのDME-F12で15ミリリットルの円錐形チューブに移します。5分間300gで遠心分離機。上清を吸引し、2ミリリットルの完全なN2B2培地を温めた2ミリリットルで再懸濁する。N2B27の2ミリリットルを細胞懸濁液に加え、以前に調製した6つのウェルプレートをコード化したBMMの各ウェルに2ミリリットルの細胞をプレートする。一晩で5%のCO2で摂氏37度で細胞をインキュベートします。MD NPCが70%合流している場合、レンチウイルスガイドRNA d-Cas9-DNMT3Aベクターを2マイクロリットル加えて、プレートをそっと旋回してトランスデューシングします。細胞を以前と同じ条件で16時間インキュベートした後、N2B27培地を48時間後に交換する。M2B27を純マイセンのミリリットル当たり5マイクログラムで添加して安定したMD NPCラインを得て、N2B27+純粋マイセンで3週間細胞を増殖させ、SNCAイントロン1のメチル化プロファイルを特徴付ける。まず、DNA抽出キットを用いて各安定型トランスデューサ細胞株からDNAを抽出し、次に800ナノグラムのDNAを使用して市販キットでバイスルフィド変換を行い、次いでバイスルフィドを1マイクロリットル当たり20ナノグラムに変換した。パイロシーケンシング解析では、反応プレートをサーモサイクラーに転写し、PCRを開始する核フリーチューブでPCRマスターミックスを調製します。アガロースゲル電気泳動に続く30と臭化物染色を用いて、2マイクロリットルのPCR産物を用いてアンプリコンを可視化します。パイロシーケンシングアッセイでは、原稿に記載されている硫化変換されたDNAおよびパイロシーケンシング試薬によってメチル化およびメチル化されていない混合物を使用した。レンチウイルスd-Cas9-DMMT3A-GFPベクターの物理的収量とこのプロトコルを使用して生成されたNaive GFPベクターの熱シーケンスソフトウェアを使用して、各CPGサイトのメチル化値を計算します。これは、最適化されたベクターバックボーンと最適化された生産プロトコルを組み合わせることで、レンチウイルスd-Cas9-DNMT3 GFPベクターのCRISPR-dCas9ベクターのトランスダクション率がCRISPR d-Cas9-RNAの包装効率が低下したことを示唆する4倍の高い収率をもたらすことを示唆している。Naive PUROベクターのトランスダクション率は、d-Cas9-DNMT3Aベクターと比較して5倍高かった。これらの結果は、ナイーブGFPおよびd-Cas9-DNMT3A-GFPを用いてさらに確認された。ここで説明する EB ベースのプロトコルは、MD NPC の差別化を可能にします。SNCAイントロン1におけるメチル化状態の定量化のために、7つのパイロシーケンシングアッセイが設計され、検証されました。7つのアッセイはすべて検証され、線形相関を示し、検証されたアッセイを使用して、SNCA intron 1の23 CPGでメチル化レベルを決定することが可能であった1この手順に出席するよりも覚えておくべきことは、実験全体の一貫性を確保するために適切な成長と健康を示す細胞と協力することです。このプレゼンテーションで強調されたレンズ豆ベクターの生産は、インテグラル欠乏アンチウイルスの生産に容易に採用することができ、それはまた、より多くの量またはより濃縮されたベクターを生成するために簡単にスケールアップすることができます。この技術は、アルツハイマー病や関連する認知症を含む年齢関連や発生疾患に対する遺伝子調節解除の病原性影響を探求する道を開くことができる。レンティルベクターがここで開発する利点は、それが危険ではないか、感染性レンズ豆ベクターは、彼らが遺伝子治療アプリケーションのための安全で信頼性の高い配信プラットフォームである細胞周期に最小限の効果しか持っていないということです。

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

アレイ ・ ベース比較 Genomic 交配用高速中性子誘起ウマゴヤシ分子変異体のコピー数変化の効率的な検出

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...