Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

이 작품은 칸 Neurotechnology 개발 상 (O.C.)을 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 일부 자금 O.C. (R01 NS085011).

1. 시스템 설계 및 바이러스 생산
<ol><li>플라스 미드 설계 및 건설 참고: 모든-에-하나의 LV-gRNA-dCas9-DNMT3A 벡터의 건축 생산을 사용 하 여 수행 됩니다-및 Ortinski 외30여 출판 식 최적화 식 카세트. 벡터 카세트 녹음 방송 요인 s p 1와-의 상태--예술 삭제는 번역에서 인식 사이트의 반복 수행 (U3')는 터미널 3'-긴 반복 (LTR) (그림 2A)<sup c...

LVs 유전 질병의 맥락에서 특히 epigenome 편집을 위한 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다, (i) 수용 하기 위해 그들의 능력 때문에 주로 큰 DNA 페이로드 및 (ii) 효율적으로 transduce 다양 한 분할 및 nondividing 셀. 정 맥 주사의 큰 포장 효능은 특히 대형은 CRISPR/dCas9 시스템의 포장을 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 유용 합니다. 이 관점에서 정 맥 주사 모두 한 CRISPR/Cas9 시스템의 배달에 대 한 선?...

여러 epigenome 편집 플랫폼 최근 유전자 식1,2를 제어 하는 지역에서 어떤 DNA 시퀀스를 대상으로 개발 되었습니다. 만든된 epigenome 편집 도구는 (i) 전사 조절, (ii) 변경 posttranslational 히스톤 수정, (iii) 수정 DNA 메 틸 화, (iv) 규제 요소 상호 작용을 조절 하는 설계 되었습니다. 비활성화 (죽은) Cas9에 전사/chromatin 한정자를 접근 (dCas9) 발생 이전에서 아연 등 개발된 epigenome 편집 플랫폼, 단백질 (ZFPs) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 (이야기), 손가락 은닉 강력한 transcriptional 이펙터 도메인 (ED) 디자인 DNA 바인딩 도메인 (DBD)3융합. 활성화 또는 억제 등 원하는 표현 형의 결과 생 loci (그림 1)에 고정 효과 기 분자에 의해 정의 됩니다. 프로그래밍 가능한 transcriptional 활성 제를 만들려면 dCas9/gRNA 모듈은 VP164,,56 (그림 1A), 폴 II 및 일반 전사 기계 신병 바이러스 활성화 도메인에 연결 됩니다. 이 시스템의 수정 VP64, VP16 도메인의 tetramer 제공 하는 더욱 강력한 활성화 속도5,6을 포함 했다. 시스템은 발기인 및 규정 요소를 대상으로 코딩 noncoding 지역 활성화를 성공적으로 고용 되었다. 중요 한 것은, VP64 분자 대상 지역에 염색 질 구조를 직접 수정 하지 않습니다, 비록 그것은 chromatin 한정자 액티브 (euchromatin) 마크, H3/H4 acetylation와 H3-K4 디 등의 증 착에 결과 묶는 신병 / 트라이-메 틸 화5,6. VP64, 뿐만 아니라 인간의 NF κB 복잡 한 p65 소 단위 dCas9/gRNA 모듈7에 닿는 되었습니다. 흥미롭게도, 상류 녹음 방송 시작 위치 (TSSs)과 발기인 내의 지역에 이러한 이펙터의 tethering 강한 유전자 유도 결과. 그럼에도 불구 하 고, VP64 및 p65 이펙터 있으며 하류 TSSs의 원심 강화7,8시 지역에 연결 되는 동안 activatory 효과 발휘 또한 수 있습니다. 더 강력한 transcriptional 응답을 유도, 여러 dCas9 VP64 또는 dCas9-p65 융해 단일 대상 로커 스9,10에 채용 될 필요가 있다. 따라서, 다음-세대 활성 제, 노, 등 단일 dCas9 gRNA 복잡 한에 의해 여러 이펙터 도메인 모집의 최근 개발 귀착되는 강한 활성화 기능 비교 dCas9 VP64 융합 대응11 , 12. 향상 된 transcriptional 활성화 VP64, p65, 및 Rta (VPR), 감마-herpesviruses에서 dCas913 (그림 1A)의 C-말단의 transactivation 도메인의 융합을 통해 얻은 되었습니다. 유사한 CRISPR/dCas9 시스템 대상별 억압 (그림 1B)에 대 한 개발 되었습니다.
내 생 유전자 억압 메커니즘 (그림 1B)의 다양 한 설계 진압 융해와 함께 얻을 수 있습니다. CRISPR/dCas9 시스템, (effector 도메인/s), 없이 진압 DBD에 연결 된 유전자 발현 발기인 또는 업스트림/다운스트림-TSS 지역3,6 에 곁에 하는 동안 침묵 효율적으로 수 있습니다 입증 되었습니다. 14. 녹음 방송에 영향 전사 인자 바인딩 및 RNA 중 합 효소 처리의 입체 장애에 의해 발생 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보다 포괄적인 접근 필요, 입체 방해 혼자 여 진 억압은 종종 강력한 입을 위한 충분 합니다. CRISPR/dCas9 시스템 transcriptional 진압 도메인 (TRDs), 히스톤 한정자를 기반으로 하는 달 았 죠의 다음 세대의 최근 개발 (H3-K9 디-/ 트라이-메 틸 화, H3 K27 디-/ 트라이-메 틸 화; H3-K36 디-/ 트라이-메 틸 화, H3/H4 deacetylation), 그리고 DNA (CpG) 메 틸 보다 강력한 효과4,5,,1516, 입을 수 있도록 하는 후 성적인 도구 건설에 17,18,,1920. 그것은 DNA에 이러한 epigenetic 한정자의 모집 일반적으로는 더 강력한 입을 결과21,22를 생성 하는 더 많은 폐쇄 하 고 압축 된 chromatin의 형성으로 이어질 수 있습니다 입증 되었습니다. DBDs와 함께 사용 하는 가장 일반적으로 입을 도메인 Krüppel 관련 상자 (리아)4,5입니다. 요인의 모집 chromatin 변경; 해당 입증 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 개조의 메커니즘은 아직 해명된16,,1718수 있습니다. 최근에, 그것은 보였다 DNA에 리아의 지역화가 이러한 상호 작용 중재의 형성 가능성을 제안 하는 히스톤 methyltransferase SETDB1 및 히스톤 deacetylation (HDAC) NuRD 단지의 어셈블리를 홍보할 수 있습니다. chromatin 응축 그리고 transcriptional 입을3,13. 다른 접근 방법으로 이펙터 도메인 사용자 지정 후 입을 단백질을 만드는 DBDs에 융합 수 있습니다. 이 시스템은 직접 억압 적인 DNA 부호 또는 히스톤 수정 catalyzes.
최근, 곁에 DNMT3A 효소 합성 CRISPR/dCas9 시스템의 사용 transcriptional 비활성화 용도가 변경 했습니다. DNMT3A catalyzes DNA 메 틸 화 내 생 유전자 발기인 및 다른 규제 영역 (그림 1B)18,20에 섬으로의 형성을 통해 transcriptional 억제 한다. 맥도날드 외.18 Vojta 외20 했다 보고 epigenome 유전자 침묵 또는 억압, 플라스 미드 배달 dCas9-DNMT3A 퓨전 시스템 향상 potently 수 보여주는 DNA 메 틸 화를 사용할 수 있는 첫 번째 저자 TSS18,20주위 시 토 신 메 틸 화. 맥도날드와 동료 증명 고용 전략의 중요 한 감소 (약 40%)에서 발생할 수 있습니다. 종양 억제기 유전자에서 CDKN2A mRNA 레벨18. 마찬가지로, 바흐 또는 IL6ST 유전자의 unmethylated 발기인 지역 타겟팅 증가 CpG 메 틸을 유전자 식20두 감소와 상관 관계를 보여줍니다. 우리 연구소는 최근 약하게 SNCA overexpression (그림 2)23의 병 적인 결과 대 한 DNA 메 틸 화를 사용 하 여 다른 용도로. SNCA intron 1 지역 내에서 DNA 메 틸 화에 선택적 향상 전략 기반으로 그것은 이전 PD와 치 매 Lewy 몸 (DLB) 두뇌24,25, hypomethylated 이기 위하여 보고 되었다 26. 이 hypomethylation SNCA overexpression, 따라서 제공 하는 치료 적 개입24,,2728에 대 한 매력적인 대상에 연결 되었습니다. 우리가 최근에 보여주었다 DNA 메 틸 화의 저수준 SNCA intron 1에서에서 hiPSC 파생 dopaminergic NPCs에 지역 SNCA triplication23PD 환자에서 얻은. 이 실험적인 모델의 장점은 NPCs 튼튼하게 문화에서 전파 하 또는 더 성숙한 뉴런으로 분화 세포 고기, 산화 등을 중재 하는 유전 요인 식별 하는 효율적인 심사를 사용 수 있다 스트레스와 apoptosis29. 또한,이 모델 시스템 환자에서 증상 발병 전에 발생 하는 개발 이벤트를 정리 하는 과학자를 수 있습니다. 또한, hiPSC에서 파생 된 NPCs 유전자 발현과 관련 된 세포 및 분자 경로 테스트 하는 훌륭한 도구를 나타냅니다. 중요 한 것은, 최신의 CRISPR/Cas9-epigenome 기술과 결합 하는 hiPSC 파생 NPCs 많은 신경 퇴행 성 질환에 대 한 "다음-세대 약물" 개발 용이 하 게 크게 수 있습니다.
SNCA 식의 병 적인 수준을 줄이기 위해, 우리는 최근 dCas9 DNMT3A 융해 단백질과 특별히 대상 CpG 메 틸 화 SNCA intron 1 (그림 2A) 내에 gRNA lentivirus 기반 시스템을 개발23. 이 프로토콜은 lentiviral 벡터 (LV) 설계 및 생산 세부 사항에 설명 합니다. LVs 나타내는 여러 가지 이유로 CRISPR/dCas9 구성 요소를 제공 하는 효과적인 수단, 즉 (i) 자신의 능력을 부피가 큰 DNA를 수행 삽입, (ii)30 셀을 나누어 및 nondividing를 포함 하 여 셀의 광범위 한 범위를 시험의 고효율 , 그리고 (iii) 최소한의 세포 독성 및 면역성 응답을 유도 하는 능력. 최근, 우리 SNCA 로커 스의 triplication 가진 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 LV 시스템을 적용 하 고 epigenome 편집의 배달에 대 한 정 맥 주사의 치료 잠재력을 시연 메 틸 화23 ( 도구 그림 2B). 실제로, LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 시스템 SNCA intron 1 지역에서 DNA 메 틸 화에 상당한 증가 발생합니다. 이 증가 SNCA mRNA와 단백질23의 수준에 있는 감소와 일치합니다. 또한, SNCA downregulation PD 관련 고기 SNCA triplication/hiPSC-파생 dopaminergic 신경 (예, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존)23에 구출. 중요 한 것은, 우리 SNCA 식 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A 시스템에서에서 감소는 고기는 누가 실시는 PD 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 대 한 특성이 있다 반전의 능력을 증명 SNCA triplication, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존23등. 이 프로토콜의 목표 이며 1) 생산의 프로토콜와 높은 tittered 바이러스 준비를 생성 하기 위한 최적화 된 LV 플랫폼의 농도 2) 성숙한 dopaminergic 될 꽃무늬 NPCs에 hiPSCs의 차별화를 설명 하기 위해 신경31,32 그리고 SNCA intron 1에서 대상 영역의 메 틸 화 수준의 특성화.
Lentiviral 플랫폼 주요 이점을 가장 인기 있는 벡터 플랫폼, 즉 adeno 관련 벡터 (AAVs), 큰 유전자 삽입33,34에 맞게 전 능력은 있다. AAVs 상당히 높은 수익률에 생성 될 수 있습니다 하지만 낮은 포장 용량을 보유 (< 4.8 kb), 모든-에-하나의 CRISPR/Cas9 시스템을 제공 하기 위한 그들의 사용을 타협. 따라서, 그것은 정 맥 주사의 플랫폼 제공된 CRISPR/dCas9 도구를 응용 프로그램에서 선택 될 것 이라고 보인다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 효과적으로 세포와 장기에 epigenome 편집 구성 요소를 제공 하는 연구를 위한 유용한 도구가 됩니다. 프로토콜 추가 벡터 식 카세트30,35내 요소의 cis에 수정 통해 벡터의 생산 및 표현 기능을 증가 하기 위하여 전략을 설명 합니다. 전략을 기반으로 소설에 시스템 개발 및 연구소에서 공부 하 고 1010 바이러스 성 단위 (VU) /mL30,35의 범위에서 바이러스 성 입자를 생산 하는 능력을 강조.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

HiPSC에서 파생 된 세포를 사용 하 여 인간의 신경 퇴행 성 질환을 연구 하는 귀중 한 접근 방식을 나타냅니다. 여기, 우리는 환자와 파 킨 슨 병 (PD)으로 알파 synuclein 유전자 (SNCA) 로커 스의 triplication에서에서 파생 된 hiPSCs의 분화에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명-관련 dopaminergic 신경 인구. 증거를 축적으로 나타났습니다 SNCA 의 상부는 충족 SNCA 표현의 규제 대상으로 하는 특히 그 PD를 위한 소설 치료 접근을 설치할 필요가 PD. Recognizing의 개발에 대 한 원인이 되는 우리 최근 epigenetically SNCA intron 1 규제 지역에서 메 틸 화 수준의 풍요로운 여 SNCA 전사를 조절 하는 CRISPR/dCas9-DNA 메 틸 화-기반 시스템 개발. 죽은의 구성 된 시스템을 제공 (비활성화) 버전 Cas9의 DNA methyltransferase 효소 3A의 촉매 도메인 (dCas9) 융합 (DNMT3A), lentiviral 벡터 사용 됩니다. 이 시스템 SNCA 로커 스의 triplication와 셀에 적용 되 고 SNCAmRNA와 단백질 수준 SNCA intron 1의 타겟된 DNA 메 틸 화를 통해 약 30% 감소 시킨다. SNCA 레벨의 미세 downregulation 질환 관련 세포 고기를 구출 하 고 현재 프로토콜에서 우리 hiPSCs 신경 조상 세포 (Npc)와 설립 SNCA 에서 메 틸 프로필의 평가 대 한 pyrosequencing 분석 실험의 유효성 검사로 차별화에 대 한 단계별 절차를 설명 하고자 intron 1. 좀 더 자세하게에서이 실험에서 사용 된 lentivirus-CRISPR/dCas9 시스템 개요,이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, lentiviral 벡터를 집중 하 고 epigenome 게놈 편집 응용 프로그램을 사용 하 여 그들의 적합성을 강조 하는 방법을 hiPSCs 및 Npc입니다. 프로토콜은 쉽게 적응 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 높은 titer lentiviruses를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다.

순진한 GFP 대응에 비해 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아 벡터의 생산 titers의 유효성 검사
우리 p24개 그 ELISA 순진한 GFP/순수 하지 않아 대조 물과 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아의 물리적 titers 사이 비교를 수행 합니다. 그림 5A에 대표 결과 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 된 ?...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral 벡터 플랫폼은 가장 인기있는 벡터 플랫폼에 비해 주요 이점이 있으며, 특히 더 큰 유전 삽입을 수용 할 수있는 렌티 바이러스 벡터의 능력 때문입니다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는 CRISPR/Cas 도구의 납품을 포함하는 응용 프로그램에서 선택의 플랫폼이 될 것으로 보인다. 이 기술은 손상될 때 질병과 연관되는 알파-시뉴클레인 발현의 자연적인 조절 메커니즘을 모방합니다.그것은 유전자 발현에 있는 강력한 변화 대 발현 수준의 미세 조정을 허용합니다. 나는 강력하게 스크리닝을 위해 여러 가이드 RNA를 사용하여이 또는 유사한 접근 방식을 검증하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 효능에는 큰 변동성이 있습니다.그것을 결정하는 유일한 방법은 강력하고 포괄적 인 검사 및 검증이 있습니다. 개발된 시스템은 설치류 및 비인간 영장류를 포함한 동물 모델과 같은 다른 모델 시스템에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이러한 후속 실험은 미래의 임상 연구를 위한 개념의 증거로 작용할 수 있었습니다.절차를 시연하는 것은 이 프로젝트와 관련된 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 만들기 위한 분자 복제 절차의 실행에 초점을 맞추고, 내 실험실의 선임 직원 인 Ekaterina Ilich 박사가 될 것입니다. 그녀는 또한 렌티바이러스 벡터 생산과 관련된 주요 단계를 시연할 것입니다. 또한 절차를 시연하는 것은 병리학적 관련 세포로 인간 iPS 세포의 분화에 초점을 맞춘 내 실험실에서 포스트 닥인 Lidia Tagliafierro 박사가 될 것입니다.그녀는 synuclein intron1의 메틸화 프로파일을 평가하기 위해 에세이 의 설립에 중요한 단계를 시연 할 것입니다. Ahila Sriskanda, 인간 iPS 세포 유래 신경 전구 세포의 문화에 초점을 맞춘 내 실험실에 있는 직원. 먼저 벡터의 DNMT3A 부분을 증폭하여 D-Cas9-DNMT3A-GFP로부터 DNMT3A 촉매 도메인을 개발한다.BamH1 제한 효소를 사용하여 DNMT3A 단편을 소화한 후. D-Cas9를 운반하는 수정된 PBK-301 벡터의 BamH1 부위로 클로트하고 직접 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되며, 순수한 마이센 기자 유전자와 그 결과 플라스미드를 GFP 다이제스트 d-Cas9-DNMT3A-P2A 순수 마이센및 플라스미드FSC 1로 대체한다. 겔 정화 방법을 사용하여 벡터 조각을 정화합니다.FSC-1로 PBK-201을 소화하여 인서트를 준비합니다. FSC 1 조각을 벡터로 복제하여 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP를 만듭니다. 15센티미터 플레이트에 0.2%의 젤라틴을 코팅하고 10분 동안 기다립니다.그런 다음 젤라틴을 흡인하고 고포도당 배지의 22.5 밀리리터와 이전에 배양된 HEK-293T 세포 현탁액의 2.5 밀리리터를 추가한다. 70~80%에 도달할 때까지 5%의 CO2로 37°C에서 플레이트를 배양합니다. 115센티미터 플레이트에 충분한 플라스미드 믹스를 준비하려면 원고에 기재된 4개의 플라스미드를 사용한다.플라스미드와 동일한 15 밀리리터 튜브에 1개의 어금니 칼슘 염화물 312.5 마이크로 리터를 추가하고 멸균 이중 증류수를 사용하여 최종 부피를 1.25 밀리리터에 넣습니다. 부드럽게 두 개의 X BBM 솔루션의 1.25 밀리리터를 튜브에 현명하게 떨어뜨리면서 튜브에 떨어뜨립니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요.세포에서 배지를 흡인하고 혈청없이 갓 준비 된 높은 포도당 DMEM의 22.5 밀리리터를 추가합니다. 각 플레이트에 현명하게 떨어지는 형질 전환 혼합물의 2.5 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이치고 37도에서 5%CO2로 5%의 CO2를 배양하여 배양 후 2~3시간 동안 플레이트당 2.5밀리리터의 세럼을 첨가하여 10%의 희석을 달성하고 5%CO2의 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.바이러스를 수확하기 위하여는 모든 전과 된 세포에서 상체를 수집하고 50 밀리리터 원추형 관에서 그(것)들을 당깁니다. 원심분리기는 400 내지 450g에서 실온에서 10분 동안 10분 간 원심분리기를 한 다음 0.45 마이크로미터 진공 필터 장치를 통해 상전자를 필터링합니다. 다음으로 원추형 극심분리관을 준비하여 자당그라데이션을 만듭니다.각 튜브의 적어도 3/4를 채우는 각 초원심분리관 중 바이러스 성 상체를 동등하게 분배하여 필터링된 상체를 그라데이션에 신중하게 추가합니다. 17°C에서 2시간 동안 70000g의 샘플을 원심분리합니다. 30%에서 60%의 자당 분획을 깨끗한 튜브에 부드럽게 수집하여 감기 1X PBS를 최대 100밀리리터까지 추가하고 파이펫을 여러 번 섞습니다.각 튜브에 1X PBS에 20%의 자당 4밀리리터를 조심스럽게 추가하여 각 튜브당 바이러스 용액의 약 20~25밀리리터를 파이프팅하여 바이러스 제제를 계속 계층화합니다. 튜브와 원심분리기의 균형을 70000g에서 섭씨 17도에서 2시간 동안 조심스럽게 균형을 잡을 수 있습니다. 나머지 액체를 조심스럽게 흡인하여 작은 반투명 반점으로 거의 보이지 않는 펠릿을 함유한 바이러스를 완전히 제거합니다.상체를 비우고 남은 액체가 배수되도록 종이 타월에 튜브를 반전시면 됩니다. 첫 번째 튜브에 1X PBS 70 마이크로 리터를 추가하고 철저하게 파이펫을 추가하여 펠릿을 다시 중단합니다. 서스펜션을 다음 튜브로 옮기고 모든 펠릿이 다시 중단될 때까지 파이펫팅 및 이송으로 반복합니다.첫 번째 튜브에 1X PBS의 50 마이크로 리터를 추가하고 혼합하여 세척합니다. 그런 다음 서스펜션을 제2 튜브로 이송하여 세척하고 이전과 같이 계속하여 약간 유백색 최종 서스펜션의 약 120 마이크로 리터를 산출합니다. 10000g에서 60초 동안 10000g의 원심분리기는 새로운 튜브로 상류제를 투명하게 전송하여 5마이크로 리터 알리쿼트로 만들고 마이너스 80도에 저장하여 MD NPC를 37도의 섭씨 열 블록으로 2분 동안 냉동 된 세포를 15 밀리리터 원전 튜브로 전송합니다.원심 분리기 300g에서 5분간. 슈퍼네티드를 흡인시키고 전동 된 완전한 N2B2 배지의 두 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. N2B27의 밀리리터 2개를 세포 현탁액에 넣고 이전에 준비된 BMM 코딩 된 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2 밀리리터의 셀을 플레이트.하룻밤 사이에 5%의 CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다. MD NPC가 70%의 합류에 있을 때, 렌티바이러스 가이드 RNA d-Cas9-DNMT3A 벡터의 2개의 마이크로 리터를 추가하여 그들을 변환하고 부드럽게 플레이트를 소용돌이시다. 16시간 동안 이전과 동일한 조건에서 세포를 배양한 후 N2B27 배지를 트랜스포팅 후 48시간 교체한다.N2B27을 순수 마이센 밀리리터당 5마이크로그램으로 추가하여 안정적인 MD NPC 라인을 확보하고, N2B27과 순수 마이센에서 3주 동안 세포를 성장하여 SNCA 인트론 1의 메틸화 프로파일을 특성화한다. 먼저 DNA 추출 키트를 사용하여 각 안정적인 트랜스듀서 세포주에서 DNA를 추출한 다음 800나노그램의 DNA를 사용하여 시판되는 키트로 양성환변환을 수행한 다음, 이설화증이 마이크로 리터당 20나노그램으로 DNA를 변환한 후 양성화증을 변환합니다. 파이로 시퀀싱 분석을 위해 핵 자유 튜브에서 PCR 마스터 믹스를 준비하여 반응 플레이트를 열 사이클러로 옮기고 PCR을 시작합니다.아가로즈 젤 전기포에 이어 30및 브로마이드 염색을 통해 PCR 제품의 2마이크로 리터를 사용하여 앰플리컨을 시각화합니다. 파이로 시퀀싱 분석법의 경우, 원고에 설명된 바와 같이 황화물 변환DN및 파이로 시퀀싱 시약에 의해 메틸화되지 않은 혼합물을 사용했다. 렌티바이러스 d-Cas9-DMMT3A-GFP 벡터및 이 프로토콜을 사용하여 생성된 순진한 GFP 벡터의 파이로 시퀀싱 소프트웨어 물리적 수율을 사용하여 각 CPG 사이트에 대한 메틸화 값을 계산하는 것은 비슷하다.이는 최적화된 벡터 백본과 최적화된 생산 프로토콜의 유용성이 렌티바이러스 d-Cas9-DNMT3 GFP 벡터의 CRISPR-dCas9 벡터 의 고수율 더 타이트한 결과 CRISPR d-Cas9-RNA의 포장 효율이 감소했음을 시사하는 순진한 GFP 벡터보다 4배 낮았다는 것을 시사한다. 순진한 PURO 벡터의 트랜스유도율은 d-Cas9-DNMT3A 벡터에 비해 5배 높았다. 이러한 결과는 순진한 GFP 및 D-Cas9-DNMT3A-GFP를 사용하여 더 확인되었다.여기에 설명된 EB 기반 프로토콜은 MD NPC의 분화를 허용합니다. 7개의 파이로 시퀀싱 분석서는 SNCA 인트론 1에서 메틸화 상태의 정량화를 위해 설계 및 검증되었다.모든 7개의 분석이 검증되고 선형 상관관계를 보였으며, 검증된 분석서를 사용하여 SNCA intron 1에서 23개의 CPG에서 메틸화 수준을 결정할 수 있었으며, 이 절차에 참석하는 것보다 기억해야 할 가장 중요한 것은 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하기 위해 적절한 성장과 건강을 보여주는 세포와 함께 작업하는 것입니다. 이 프레젠테이션에서 강조 표시된 렌즈콩 벡터의 생산은 더 많은 양 또는 더 많은 농축 벡터를 생성하기 위해 쉽게 확장 될 수 있습니다 통합 부족 안티 바이러스의 생산에 채택 될 수있다. 이 기술은 나이 관련 또는 알츠하이머 병 및 관련 치매를 포함하여 생성 무질서에 유전자 de-regulation의 병원성 충격을 탐구하는 쪽을 포장할 수 있습니다.여기에서 개발되는 렌즈콩 벡터의 장점은 감염성 렌즈콩 벡터가 유전자 치료 응용 프로그램을 위한 안전하고 신뢰할 수 있는 전달 플랫폼인 세포 주기에 최소한의 영향을 미치지 않는다는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

연구

유전학

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...