Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert delvis av Kahn Neurotechnology Development Award (å OC) og nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) (R01 NS085011 å OC).

1. system Design- og Virus
<ol><li>Plasmider design og konstruksjon Merk: Byggingen av en alt-i-ett LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektor utføres ved hjelp av en produksjon- og uttrykk-optimalisert uttrykk kassett publisert av Ortinski et al.30. Vector kassetten bærer en gjentakelse av webområdet anerkjennelse av transkripsjon faktor Sp1 og en state-of-the-art sletting i den uoversatt (U3 ") en terminal 3-lang gjenta (VTH) (figur 2A)<su...

LVs har begynt å dukke opp som bilen av valget for epigenome redigering, spesielt i sammenheng med genetiske sykdommer, hovedsakelig på grunn av deres evne til å (i) tilpasse store DNA nyttelast og (ii) effektivt transduce en rekke dele og nondividing celler. Store emballasje effekten av LVs er spesielt gunstig for programmene som involverer emballasje av CRISPR/dCas9 som er for store. Fra dette perspektivet representerer LVs det plattform av valget for levering av alt-i-ett CRISPR/Cas9 systemer. Faktisk er AAV plattf...

Flere epigenome-redigering plattformer er nylig utviklet for å målrette noen DNA-sekvenser i regioner som kontrollerer gene expression1,2. De opprettede epigenome-redigeringsverktøy er utformet for å (i) regulere transkripsjon, (ii) endre posttranslational histone modifikasjoner, (iii) endre DNA metylering og (iv) modulerer regulatorisk element interaksjoner. Tilnærming til anker transkripsjon/chromatin modifiseringen til en deaktivert (død) Cas9 (dCas9) hevet fra tidligere utviklet epigenome-redigering plattformer, for eksempel sink finger proteiner (ZFPs) og transkripsjon aktivator som effektor (eventyr), skjuler et potent transcriptional effektor domene smeltet (ED) designet DNA-bindende domenet (DBD)3. Resultatene av ønsket fenotypen som aktivisering eller undertrykkelse er definert av effektor molekylet forankret til de endogene loci (figur 1). Hvis du vil opprette programmerbare transcriptional aktivator, er dCas9/gRNA moduler knyttet til VP164,5,6 (figur 1A), en viral aktivisering domene som rekrutterer Pol II og generell transkripsjon maskiner. Endring av dette systemet har inkludert VP64, en tetramer av VP16 domener, gir en enda mer robust aktivisering rate5,6. Systemet har vært vellykket ansatt å aktivere koding og noncoding av målretting arrangører og regulatoriske elementer. Viktigere, selv om VP64 molekyler ikke direkte endre chromatin strukturen i regionen mål, det rekrutter chromatin modifikatorer som binder resultater i deponering av aktiv (euchromatin) merker, inkludert som H3/H4 acetylation og H3-K4 di / Tri-metylering5,6. I tillegg til VP64, har p65 delenhet i menneskelig NF-κB komplekset blitt bundet til dCas9/gRNA modul7. Interessant, deling av disse effektor til regionene oppstrøms transkripsjon start områder (TSSs) og arrangører resulterer i en sterk genet induksjon. Likevel, VP64 og p65 effektor kan også utøve activatory effekten mens knyttet til regionene ligger nedstrøms TSSs og distale enhancers7,8. For å lokke fram en mer robust transcriptional reaksjon, trenger flere dCas9-VP64 eller dCas9-p65 fusjoner å bli rekruttert til en enkelt mål locus9,10. Som sådan, har den siste utviklingen av neste generasjons aktivator, som rekrutterer effektor domenene av en enkelt dCas9-gRNA-komplekset, som SunTag, resultert i en sterkere aktivisering funksjonen sammenligne dCas9-VP64 fusion kolleger11 , 12. en forbedret transcriptional aktivisering er innhentet gjennom fusjon av VP64, p65 og Rta (VPR), et transactivation-domene fra gamma-herpesviruses, til C-terminus dCas913 (figur 1A). Lignende CRISPR/dCas9-systemer har blitt utviklet for mål-spesifikke undertrykkelse (figur 1B).
Endogene genet undertrykkelse kan oppnås med utviklet repressor fusjoner gjennom en rekke mekanismer (figur 1B). Det har vist at CRISPR/dCas9 systemer, knyttet til repressor DBD (selv uten en effektor domene/s), kan effektivt slå genuttrykk mens bundet til en formidler eller oppstrøms/nedstrøms-TSS regioner3,6 ,14. Virkningene på transkripsjon er forårsaket av steric forstyrrelser av transkripsjon faktor bindende og RNA polymerase behandling. Likevel er mer omfattende tilnærminger nødvendig, som gene undertrykkelse av steric hindring alene er ofte ikke tilstrekkelig for robust stanse. Den siste utviklingen av den neste generasjonen av lyddempere basert på CRISPR/dCas9 systemer bærer transcriptional repressor domener (TRDs), histone modifikatorer (H3-K9 di-/ tri-metylering, H3-K27 di-/ tri-metylering; H3-K36 di-/ tri-metylering, H3/H4 deacetylation), og DNA (CpG) metylering førte til byggingen epigenetic verktøyer som mer robust stanse effekter4,5,15,16, 17,18,19,20. Det har blitt demonstrert at rekruttering av disse epigenetic modifikatorer til DNA kan føre til dannelse av mer lukket og kondensert chromatin, som vanligvis genererer en mer potent stanse utfallet21,22. Oftest stanse domenet brukes med DBDs er Krüppel-assosiert boks (KRAB)4,5. Rekruttering av faktor har vist tilsvarer chromatin endringer; Likevel er mekanismer for disse endringene ennå å bli belyst16,17,18. Nylig har det vært vist at lokaliseringen av KRAB DNA kan fremme montering av histone methyltransferase SETDB1 og histone deacetylation (HDAC) NuRD komplekser, antyder muligheten for at disse interaksjoner megle dannelsen av chromatin kondens og transcriptional stanse3,13. Som en alternativ tilnærming, kan effektor domener være smeltet å DBDs å opprette en egendefinert epigenetic stanse protein. Dette systemet gir direkte undertrykkende DNA merker eller histone modifikasjoner.
Bruk av syntetiske CRISPR/dCas9 systemer bundet til DNMT3A enzymet har nylig blitt repurposed for transcriptional deaktivering. DNMT3A gir DNA metylering som utøver transcriptional undertrykkelse gjennom dannelsen av heterochromatin på endogene genet arrangører og andre juridiske områder (figur 1B)18,20. McDonald et al.18 og Vojta et al.20 var første forfatterne rapporterer at DNA metylering kan brukes for epigenome-genet stanse eller undertrykkelse, demonstrere at plasmider levert dCas9-DNMT3A fusion systemet kan potently forbedre cytosine metylering rundt TSS18,20. McDonald og kolleger vist at bruken av strategien kan medføre en betydelig reduksjon (ca 40%) i en tumor suppressor genet nivåer CDKN2A mRNA18. Tilsvarende viser målretting regionen unmethylated promoter av BACH eller IL6ST genene økt CpG metylering som er forbundet med en todelt reduksjon i gene expression20. Våre lab har nylig tatt i bruk bruk av DNA metylering for demping patologisk utfallet av SNCA overuttrykte (figur 2)23. Strategien er basert på selektiv ekstrautstyr i DNA metylering i regionen SNCA intron 1 som det tidligere rapportert å være hypomethylated i PD og demens med Lewy organer (DLB) hjerner24,25, 26. Denne hypomethylation har vært knyttet til SNCA overuttrykte, dermed tilby en attraktiv mål for terapeutisk intervensjon24,27,28. Vi har nylig viste et lavt nivå av DNA metylering i SNCA intron 1 regionen i hiPSC-avledet dopaminergic NPCer innhentet fra en PD-pasient med SNCA triplication23. Fordelen med denne eksperimentelle modellen er at NPCer kan være robust overført i kultur eller videre differensiert i modne nerveceller, muliggjør en effektiv screening å identifisere genetiske faktorer som megle mobilnettet fenotyper, inkludert oksidativt stress og apoptose29. Videre, denne modellen gjør forskere til recapitulate utviklingsmessige hendelsene som oppstod før symptomdebut hos pasienter. I tillegg representerer hiPSC-avledet NPCer en stor verktøyet å teste cellulære og molekylære veier tilknyttet genuttrykk. Viktigere, kan hiPSC-avledet NPCer kombinert med state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome teknologi forenkle utvikling av "neste generasjon narkotika" for mange nevrodegenerative sykdommer.
For å redusere patologisk nivåer av SNCA uttrykk, vi nylig utviklet et lentivirus-basert system med en dCas9-DNMT3A fusion protein og gRNA til spesifikt mål CpG metylering i SNCA intron 1 (figur 2A)23. Denne protokollen vil beskrive lentiviral vektor (LV) design og produksjon i detalj. LVs representerer et effektivt middel for å levere CRISPR/dCas9 komponenter av flere grunner, nemlig (i) deres evne til å bære store DNA setter, (ii) en høy effektivitet av transducing et bredt spekter av cellene, inkludert både dele og nondividing celler30 , og (iii) evnen til å indusere minimal cytotoksiske og immunogenic svar. Nylig vi brukt LV systemet på hiPSC-avledet dopaminergic neurons fra en pasient med triplication av SNCA locus og bevist terapeutisk potensialet i LVs for levering av epigenome-redigering metylering verktøy23 ( Finne 2B). Faktisk forårsaker en LV-gRNA/dCas9-DNMT3A systemet en betydelig økning i DNA metylering i regionen SNCA intron 1. Denne økningen tilsvarer reduksjon i nivåene av SNCA mRNA og protein23. Videre redder SNCA downregulation PD-relaterte fenotyper i SNCA triplication/hiPSC-avledet dopaminergic neurons (f.eks mitokondrie ROS produksjon og celle levedyktighet)23. Viktigere, viste vi at reduksjonen i SNCA uttrykk av LV-gRNA-dCas9-DMNT3A systemet er i stand til å reversere av fenotyper som er karakteristisk for hiPSC-avledet dopaminergic neurons fra en PD pasient som bar i SNCA triplication, som mitokondrie ROS produksjon og celle levedyktighet23. Målet med denne protokollen er 1) å skissere protokollen for produksjon og konsentrasjonen av en optimalisert LV plattform for å generere høy-tittered viral forberedelser og 2) for å beskrive differensiering av hiPSCs i NPCer mønster for å bli moden dopaminergic neurons31,32 og karakterisering av metylering målrettingsområde innen SNCA intron 1.
Lentiviral plattformer har en stor fordel over de mest populære vektor plattform, nemlig adeno-assosiert vektorer (AAVs), som har evnen til å imøtekomme større genetisk innsettinger33,34. AAVs kan genereres ved betydelig høyere avkastning, men har en lav emballasje kapasitet (< 4.8 kb), at deres bruk for å levere alt-i-ett CRISPR/Cas9 systemer. Dermed virker det som LVs ville være det plattform av valget i programmer som er involvert i gjennomføringen av CRISPR/dCas9 verktøy. Protokollen skissert her vil derfor være et verdifullt verktøy for forskere ønsker å effektivt levere epigenome-redigering komponenter til cellene og organene. Protokollen ytterligere skisserer strategi for å øke produksjonen og uttrykk evnene av vektorer via en endring i cis elementer innen vektor uttrykk kassett30,35. Strategien er basert på romanen system utviklet og studerte i vår lab og fremhever dens evne å tilvirke virus partikler i området 1010 viral enheter (VU) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Bruk av hiPSC-avledet celler representerer en verdifull tilnærming å studere human nevrodegenerative sykdommer. Her beskriver vi en optimalisert protokoll for differensiering av hiPSCs avledet fra en pasient med triplication av alpha-synuclein genet (SNCA) locus i Parkinsons sykdom (PD)-relevante dopaminergic neuronal populasjoner. Samler bevis har vist at høye nivåer av SNCA er forårsaker for utvikling av PD. gjenkjenne den udekket må etablere nye behandlingsmetoder for PD, særlig de målretting regulering av SNCA uttrykk, vi nylig utviklet en CRISPR/dCas9-DNA-metylering-basert system for å epigenetically modulerer SNCA transkripsjon av berikende metylering nivåene på SNCA intron 1 regulatoriske regionen. Å levere systemet, som består av en død (deaktivert) versjon av Cas9 (dCas9) smeltet sammen med katalytisk domenet til DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), en lentiviral vektor brukes. Dette systemet er brukt på celler med triplication av SNCA locus og reduserer SNCA-mRNA og protein nivå ved ca 30% gjennom de målrettede DNA-metylering av SNCA intron 1. Den finjusterte downregulation av SNCA redder sykdom-relaterte mobilnettet fenotyper. I gjeldende protokollen, vi tar sikte på å beskrive en fremgangsmåte for å skille hiPSCs i nevrale stamceller (NPC) og etablering og validering av pyrosequencing analyser for evaluering av metylering profilen i SNCA intron 1. Hvis du vil disponere nærmere lentivirus-CRISPR/dCas9 systemet brukes i disse eksperimentene, beskriver denne protokollen hvordan å produsere, rense og konsentrere lentiviral vektorer og markere deres egnethet for epigenome - og genomet-redigering programmer som bruker hiPSCs og NPCer. Protokollen er lett tilpasses og kan brukes til å produsere høy titer lentiviruses for i vitro og in vivo programmer.

Validering av produksjon titers av LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektorer sammenlignet naive GFP motpart
Vi utførte p24kneble ELISA sammenligne mellom fysiske titers i LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro med de naive GFP/Puro kolleger. Representant resultater, presentert i figur 5A, viser at fysisk avkastning av vektorer, generert ved hjelp av protokollen her skissert, er sammenlignbare...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Målrettet DNA epigenome redigering representerer en effektiv terapeutisk tilnærming. Denne protokollen beskriver produksjon, rensing og konsentrasjonen av alt-i-ett lentiviral vektorer skjuler CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgene for epigenome-redigering programmer i menneskelig indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons.

Lentiviral Vector plattform for effektiv levering av Epigenome-redigeringsverktøy i Human indusert Pluripotent Stamcelle-avledet sykdom modeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral vektor plattform har en stor fordel over den mest populære vektor plattform, spesielt på grunn av evnen til lentiviral vektorer for å imøtekomme større genetisk innsats. Dermed ser det ut til at lentiviral vektor ville være den plattformen for valg i søknaden innebære levering av CRISPR / Cas verktøy. Denne teknikken etterligner den naturlige regulatoriske mekanismen for alfa-synuclein uttrykk som når svekket er forbundet med sykdom.Det tillater finjustering av uttrykksnivået versus robuste endringer i genuttrykk. Jeg vil sterkt anbefale å validere dette eller lignende tilnærminger ved hjelp av flere guide RNA for screening. Det er stor variasjon i guide RNA styrke.Den eneste måten å fastslå det på er det robust og omfattende screening og validering. Det utviklede systemet kan enkelt tilpasses andre modellsystemer som dyremodeller, inkludert gnager og ikke-menneskelig primat. Dette oppfølgingseksperimentet kan tjene som et konseptbevis for fremtidige kliniske studier.Demonstrere prosedyren vil være Dr.Ekaterina Ilich, en senior medarbeider i laboratoriet mitt, med fokus på gjennomføring av molekylær kloning prosedyre for å skape Lentiviral Vector Plasmids knyttet til dette prosjektet. Hun vil også demonstrere de viktigste trinnene involvert i Lentiviral Vector produksjon. Også demonstrere prosedyren vil være Dr.Lidia Tagliafierro, en postdoc fra laboratoriet mitt med fokus på differensiering av menneskelige iPS-celler i patologiske relevante celler.Hun vil demonstrere de viktigste trinnene i etableringen av analyser for å evaluere metyleringsprofilene til synuclein intron1. Ahila Sriskanda, en ansatt i laboratoriet mitt med fokus på kulturen til menneskelige iPS-celleavledede nevrale stamceller. Til å begynne med kan du utvikle DNMT3A katalytisk domene fra d-Cas9-DNMT3A-GFP ved å forsterke DNMT3A-delen av vektoren.Etter å ha fordøyd DNMT3A fragment ved hjelp av en BamH1 begrensning enzymet. Kloner den inn i BamH1-stedet til den modifiserte PBK-301 vektoren som bærer d-Cas9 og bekreftet ved direkte Sanger-sekvensering, for å erstatte det rene Meissen-reportergenet og den resulterende plasmiden med GFP fordøye d-Cas9-DNMT3A-P2A ren Meissen og plasmid med FSC 1. Rens vektorfragmentet ved hjelp av en gelrensemetode.Forbered innsatsen ved å fordøye PBK-201 med FSC-1. Klone FSC 1 fragmentet i vektoren for å lage d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Coat 15 centimeter plater med 0,2% gelatin for transfection og vent i 10 minutter.Deretter aspirerer gelatinen og tilsett 22,5 milliliter høy glukosemedium og 2,5 milliliter tidligere kultivert HEK-293T cellesuspensjon. Inkuber platene ved 37 grader Celsius med 5% CO2 til de når 70 til 80% samløpet. For å forberede plasmidblandingen tilstrekkelig for 115 centimeter plate, bruk de fire plasmidene som er beskrevet i manuskriptet.Tilsett 312,5 mikro liter ett molarkalsiumklorid til samme 15 milliliter rør med plasmidene og bring det endelige volumet til 1,25 milliliter ved hjelp av sterilt dobbelt destillert vann. tilsett forsiktig 1,25 milliliter to X BBM-løsningsfall klokt til røret mens du virvler. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.Aspirer mediet fra cellene og tilsett 22,5 milliliter nylaget høyt glukose DMEM uten serum. Tilsett 2,5 milliliter av transfeksjonsblandingen dråpe klokt til hver plate. Virvle platene og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% CO2 i to til tre timer etter inkubasjon legge til 2,5 milliliter serum per plate for å oppnå 10% fortynning og inkubere over natten ved 37 grader Celsius med 5%CO2.For å høste viruset samle supernatant fra alle de trans infiserte cellene og trekke dem i 50 milliliter koniske rør. Sentrifuge ved 400 til 450 g i 10 minutter ved romtemperatur og filtrer deretter supernatanten gjennom 0,45 mikrometervakuumfilterenhet. Deretter oppretter du en sukrosegradient ved å forberede koniske ultra sentrifugeringsrør.Tilsett forsiktig den filtrerte supernatanten til gradienten ved å fordele den virale supernatanten blant hvert ultra sentrifugeringsrør som fyller minst tre fjerdedeler av hvert rør. Sentrifuger prøvene ved 70000 g i to timer ved 17 grader Celsius. Samle forsiktig 30% til 60% sukrosefraksjoner i rene rør legger til kalde 1X PBS opptil 100 milliliter totalt volum og pipette flere ganger for å blande.Tilsett nøye fire milliliter med 20 % sukrose i 1X PBS til hvert rør for å stratifisere det virale preparatet fortsette ved å pipettere ca. 20 til 25 milliliter av virusløsningen per hvert rør. Balansere rørene forsiktig og deretter sentrifuge ved 70000 g i to timer ved 17 grader Celsius. Aspirer forsiktig den gjenværende væsken for å fjerne all væsken som helt forlater viruset som inneholder pellets som knapt er synlige som små gjennomsiktige flekker.Etter tømming av overnaturlige inverter rørene på papirhåndklær for å la den gjenværende væsken renne. Tilsett 70 mikro liter 1X PBS til det første røret og rør røret grundig for å suspendere pelleten på igjen. Overfør suspensjonen til neste rør og gjenta med pipettering og overføring til alle pellets er suspendert på nytt.Tilsett ytterligere 50 mikro liter 1X PBS til det første røret og bland for å vaske det. Overfør deretter suspensjonen til det andre røret for å vaske og fortsette med vasking og overføring som tidligere, noe som gir ca 120 mikro liter av den litt melkeaktig endelige suspensjonen. Sentrifuge på 10000 g i 60 sekunder for å få en klar suspensjon overføre supernatant til et nytt rør og gjøre fem mikro liter aliquot og lagre dem på negative 80 grader Celsius plassere en Cryovial med MD NPC i 37 grader Celsius varmeblokk i to minutter og overføre de tinte cellene til en 15 milliliter konisk rør med 10 milliliter varm DMEM-F12.Sentrifuge ved 300 g i fem minutter. Aspirer de overnaturante og re-suspendere cellene i to milliliter av pre oppvarmet komplett N2B2 medium. Tilsett to milliliter N2B27 til cellesuspensjonen og plate to milliliter celler i hver brønn av den tidligere tilberedte BMM kodet seks brønnplate.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% CO2 over natten. Når MD NPCer er på 70% samløpet, transduser dem ved å legge til to mikro liter lentivirus guide RNA d-Cas9-DNMT3A vektorer og forsiktig virvle platen. Etter inkubering av cellene ved samme forhold som tidligere i 16 timer, erstatt N2B27 medium 48 timer etter transduksjonen.Legg til N2B27 med fem mikrogram per milliliter ren Meissen for å oppnå stabile MD NPC-linjer, vokse cellene i tre uker i N2B27 pluss ren Meissen for å karakterisere metyleringsprofilen til SNCA intron 1. Først trekke DNA fra hver stabil transduser celle linje ved hjelp av et DNA ekstraksjon kit, deretter bruke 800 nanograms av DNA for å utføre en bisulfid konvertering med en kommersielt tilgjengelig kit og deretter en bisulfid konvertert DNA til 20 nanogram per mikro liter. For pyro-sekvensering analyse forberede PCR master mix i en kjernefri rør overføre reaksjonsplaten til en termo-cycler og starte PCR.Visualiser ampliklonene ved hjelp av to mikro liter PCR-produkt med en 30- og bromidfarging etter Agarose gelelektroforese. For pyro-sekvensering analyser brukt blandinger av un-metylert og metylert av sulfid konvertert DNAs og pyro-sekvensering reagenser som beskrevet i manuskriptet. Beregn metyleringsverdiene for hvert CPG-nettsted ved hjelp av pyro-sekvenseringsprogramvare fysiske utbytter av Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vektor og Naive GFP vektor generert ved hjelp av denne protokollen er sammenlignbare.Dette tyder på at nytten av den optimaliserte vektorryggraden kombinert med den optimaliserte produksjonsprotokollen resulterer i høy avkastning strammere av CRISPR-dCas9 vektorer transduksjonshastigheten til Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-vektoren var fire ganger lavere enn naive GFP-vektoren som tyder på at emballasjeeffektiviteten til CRISPR d-Cas9-RNA reduseres. Transduksjonshastighetene til naive PURO-vektoren var fem ganger høyere sammenlignet med d-Cas9-DNMT3A-vektoren. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av Naive GFP og d-Cas9-DNMT3A-GFP.Den EB-baserte protokollen som er beskrevet her tillater differensiering av MD NPCer. hiPSCs uttrykt glede styrke markør Oct4 mens MD NPC uttrykkes både Nestin og FoxA2. Syv pyro-sekvenseringsanalyser ble designet og validert for kvantifisering av metyleringsstatusen i Kystverket intron 1.Alle 7 analysene ble validert og viste lineær korrelasjon, ved hjelp av de validerte analysene var det mulig å bestemme metyleringsnivåene ved 23 CPGs i SNCA intron 1 Det viktigste å huske enn å delta på denne prosedyren er å arbeide med celler som viser riktig vekst og helse for å sikre konsistens på tvers av eksperimenter. Produksjonen av linsevektorer uthevet i denne presentasjonen kan enkelt vedtas til produksjon av integraler mangelfull anti-virus det er også kan enkelt skaleres opp for å generere større mengder eller mer konsentrertvektorer. Denne teknikken kan bane vei for å utforske den patogene virkningen av gener deregulering på aldersrelatert eller generative lidelser, inkludert Alzheimers sykdom og relaterte demens.Fordelen med linsevektorer utvikler seg her er at det ikke er fare eller ikke smittsomme linsevektorer har bare minimal effekt på cellesyklus de er sikker og pålitelig leveringsplattform for genterapi applikasjoner.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En matrise-basert sammenlignende Genomic hybridisering plattform for effektiv påvisning av kopi nummer variasjoner i rask Neutron-indusert Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Fosteret Microinjection og transplantasjon teknikk for Nasonia vitripennis genomet manipulasjon

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral formidlet produksjon av transgene mus: en enkel og svært effektiv metode for direkte av grunnleggerne

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering og karakterisering MicroRNA-baserte genetisk modifisering av menneskelig Dental hårsekken stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolere, sekvensering og analysere ekstracellulære MicroRNAs fra menneskelige stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral mediert gen demping i Human Pseudoislet forberedt på lav Vedleggs plater

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...