Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Este trabalho foi financiado em parte pelo prêmio de desenvolvimento de Neurotecnologia Kahn (de The O.C.) e o nacional institutos de saúde nacionais Instituto de doenças neurológicas e Stroke (NINDS/NIH) (R01 NS085011 de O.C.).

1. sistema Design e produção de vírus
<ol><li>Construção e design de plasmídeo Nota: A construção de um vetor de LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one é realizada por meio de uma produção- e otimizados para expressão expressão cassette, publicado por Ortinski et al.30. A gaveta de vetor carrega uma repetição do site reconhecimento do fator de transcrição Sp1 e uma estado-da-arte exclusão dentro o untranslated (U3') região de um terminal 3'-longa ...

VLS começaram a emergir como o veículo de escolha para edição Epigenoma, especialmente no contexto de doenças genéticas, principalmente devido à sua capacidade de (i) acomodar grandes cargas de DNA e (ii) transduce eficientemente uma grande variedade de dividir e células nondividing. A eficácia de grandes embalagens dos VLS é especialmente benéfica para as aplicações que envolvem embalagens dos sistemas CRISPR/dCas9 que são de grandes dimensões. Nesta perspectiva, LVs representam a plataforma de escolha pa...

Múltiplas plataformas Epigenoma-edição foram recentemente desenvolvidas para direcionar as sequências de DNA nas regiões que controlam a expressão de gene1,2. As ferramentas de edição Epigenoma criadas destinam-se a (i) regulam a transcrição, (ii) alterar modificações do histone posttranslational, (iii) modificar a metilação do DNA e (iv) modular interações elemento regulamentar. A abordagem para ancorar os modificadores de transcrição/cromatina para um Cas9 (morto) desativado (dCas9) ressuscitou anteriormente desenvolvidas Epigenoma-edição plataformas, tais como zinco dedo proteínas (ZFPs) e efetores, como ativador de transcrição (contos), abrigando um domínio efetor transcriptional potente (ED) fundido ao domínio de ligação a DNA projetado (DBD)3. Os resultados do fenótipo desejado como ativação ou repressão é definida pela molécula efetora ancorada ao Locus endógenos (Figura 1). Para criar ativadores transcricionais programáveis, dCas9/gRNA módulos estão ligados à VP164,5,6 (figura 1A), um domínio de ativação viral que recrutas Pol II e a maquinaria de transcrição geral. A modificação deste sistema incluiu VP64, um tetrâmero de domínios VP16, fornecendo um ainda mais robusta5,taxa de ativação6. O sistema tem sido empregado com sucesso para ativar regiões não-codificadoras e codificação, orientando os promotores e dos elementos reguladores. Importante, mesmo que VP64 moléculas diretamente não modifique a estrutura da cromatina na região de destino, ele recruta modificadores de cromatina, que se ligam os resultados no depoimento das marcas ativo (eucromatina), incluindo como acetilação H3/H4 e H3-K4 di / Tri-metilação5,6. Além de VP64, a subunidade p65 do NF-κB humano complexo tem sido amarrada ao dCas9/gRNA módulo7. Curiosamente, o tethering desses efetores às regiões montante dos locais de início da transcrição (TSSs) e dentro de promotores resulta em uma indução do gene forte. No entanto, VP64 e p65 efetores também podem exercer os efeitos activatory enquanto ser linkadas para as regiões situadas a jusante de TSSs e no distal potenciadores de7,8. Para eliciar uma resposta transcricional mais robusta, várias fusões de dCas9-VP64 ou dCas9-p65 deveriam ser recrutados para um destino único locus9,10. Como tal, o desenvolvimento recente de ativadores de próxima geração, que recrutar vários domínios efetoras por um complexo único dCas9-gRNA, tais como SunTag, resultou em uma capacidade de ativação mais forte comparando com dCas9-VP64 fusão homólogos11 , 12. uma ativação transcricional melhorada foi obtida através da fusão de VP64, p65 e Rta (VPR), um domínio do transactivation do gama-herpesviruses, para o C-terminal da dCas913 (figura 1A). Desenvolveram-se sistemas semelhantes de CRISPR/dCas9 para a repressão de destino específico (figura 1B).
Repressão do gene endógeno pode ser conseguido com fusões repressor projetadas através de uma variedade de mecanismos (figura 1B). Foi demonstrado que sistemas CRISPR/dCas9, ligados ao repressor DBD (mesmo sem um domínio efetor/s), com eficiência podem silenciar a expressão de gene, enquanto amarrados a um promotor ou montante/jusante-TSS regiões3,6 ,14. Os efeitos na transcrição é causado por interferência estérica de ligação do fator de transcrição e processamento de RNA polimerase. No entanto, são necessárias abordagens mais abrangentes, como repressão do gene por estérico sozinho muitas vezes não é suficiente para silenciar robusto. O recente desenvolvimento da próxima geração de silenciadores baseado em sistemas CRISPR/dCas9 carregando domínios transcricional repressor (TRDs), modificadores de histona (H3-K9 di-/ tri-metilação, H3-K27 di-/ tri-metilação; H3-K36 di-/ tri-metilação, deacetilação de histona H3/H4) e metilação de DNA (CpG), levado à construção de ferramentas epigenéticas, permitindo mais robusto silenciar efeitos4,5,15,16, 17,18,19,20. Foi demonstrado que o recrutamento desses modificadores epigenéticas ao DNA pode levar à formação de cromatina mais condensada e fechada, que normalmente geram um mais potente silencioso resultado21,22. O domínio de silenciar mais comumente usado com DBDs é o caixa Krüppel-associado (CASCUDO)4,5. O recrutamento do fator foi demonstrado para corresponder com as alterações da cromatina; no entanto, os mecanismos destas modificações são ainda ser elucidado16,17,18. Recentemente, tem sido demonstrado que a localização do Siri CASCUDO para DNA pode promover a montagem do methyltransferase do histone SETDB1 e os complexos de NuRD histona deacetilação (HDAC), sugerindo a possibilidade de que estas interações mediam a formação de condensação da cromatina e transcriptional silencioso3,13. Como uma abordagem alternativa, domínios effector podem ser fundidos a DBDs para criar uma proteína de silenciamento epigenética personalizada. Este sistema diretamente catalisa repressivas marcas de DNA ou modificações do histone.
Recentemente, a utilização de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos amarrados à enzima DNMT3A tem foi realocada para desativação transcricional. Dnmt3a catalisa a metilação do DNA que exerce repressão transcriptional em toda a formação de heterocromatina em promotores de genes endógenos e outras regiões reguladoras (figura 1B)18,20. McDonald et al.18 e Vojta et al20 foram os primeiros autores para relatar que a metilação do DNA pode ser usada para Epigenoma-silenciamento ou repressão, demonstrando que o sistema de fusão de dCas9-DNMT3A entregue em plasmídeo potente pode melhorar metilação de citosina em torno do TSS18,20. McDonald ' s e colegas demonstraram que o emprego da estratégia pode resultar em uma redução significativa (cerca de 40%) em um gene supressor de tumor, os níveis de mRNA de CDKN2A 18. Da mesma forma, visando a região unmethylated promotor dos genes BACH ou IL6ST mostra aumentada metilação de CpG que tem sido correlacionada com a expressão de gene20redução dupla. Nosso laboratório tem recentemente realocado o uso de metilação do DNA para atenuar os resultados patológicos de SNCA superexpressão (Figura 2)23. A estratégia baseia-se na seletiva do realce na metilação do DNA dentro da região de intron 1 SNCA , como anteriormente foi relatado para ser hypomethylated em PD e demência com Lewy (DLB) de corpos cérebros24,25, 26. Esta hypomethylation tem sido associada a SNCA superexpressão, oferecendo assim um alvo atraente para a intervenção terapêutica de27,24,28. Recentemente mostramos um baixo nível de metilação do DNA na SNCA intron 1 na região de hiPSC-derivado dopaminérgico NPCs obtidos de um paciente de PD com o SNCA triplicação23. A vantagem deste modelo experimental é que os NPCs podem ser robustamente propagados na cultura ou ainda mais diferenciados em neurônios maduros, permitindo uma triagem eficiente identificar fatores genéticos que medeiam fenótipos celulares, incluindo oxidativo stress e apoptose29. Além disso, este modelo sistema permite aos cientistas recapitular os eventos do desenvolvimento que ocorreram antes do aparecimento de sintomas em pacientes. Além disso, hiPSC-derivado de NPCs representam uma ótima ferramenta para testar as vias celulares e moleculares associadas a expressão gênica. Importante, NPCs derivado de hiPSC, combinados com estado-da-arte tecnologia CRISPR/Cas9-Epigenoma podem facilitar muito o desenvolvimento de "drogas de última geração" para muitas doenças neurodegenerativas.
Para reduzir níveis patológicos de expressão SNCA, recentemente desenvolvemos um sistema baseado em lentivirus carregando uma proteína de fusão de dCas9-DNMT3A e gRNA para especificamente alvo CpG do methylation dentro o SNCA intron 1 (Figura 2A)23. Este protocolo irá descrever design vetor de Lentivirus (LV) e produção em detalhe. VLS representam um meio eficaz de fornecer componentes CRISPR/dCas9 por várias razões, nomeadamente (i) sua capacidade de transportar DNA volumoso insere, (ii) uma alta eficiência de transducing uma ampla variedade de células, incluindo células de divisão e nondividing30 e (iii) sua habilidade de induzir respostas imunogênicas e citotóxicas mínimas. Recentemente, aplicamos o sistema LV para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente com a triplicação do locus a SNCA e demonstrou o potencial terapêutico de LVs para a entrega da edição de Epigenoma metilação ferramentas23 ( Figura 2B). Com efeito, um sistema de LV-gRNA/dCas9-DNMT3A ocasiona um aumento significativo na metilação do DNA na região do intron 1 SNCA . Este aumento corresponde com a redução dos níveis de SNCA mRNA e proteína23. Além disso, a SNCA downregulation resgata fenótipos relacionados com PD na SNCA triplicação/hiPSC-derivado dopaminérgico neurônios (por exemplo, mitocondrial ROS produção e célula viabilidade)23. Importante, temos demonstrado que a redução na expressão SNCA pelo sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A é capaz de reverter os fenótipos que são característicos para os neurônios dopaminérgicos hiPSC-derivado de um paciente de PD que carregava a SNCA triplicação, tais como mitocondrial ROS produção e célula viabilidade23. O objetivo do presente protocolo é 1) para delinear o protocolo de produção e concentração de uma plataforma otimizada de LV para gerar alta-tittered virais preparações e 2) para descrever a diferenciação de hiPSCs em NPCs padronizada para tornar-se maduro dopaminergic os neurônios31,32 e a caracterização dos níveis de metilação da região alvo dentro SNCA intron 1.
Particulas de Lentivirus plataformas tem uma grande vantagem sobre a plataforma mais popular do vetor, ou seja adeno-associado vetores (AAVs), que é capacidade a ex de acomodar maior inserções genética33,34. AAVs podem ser gerados em rendimentos significativamente mais elevados, mas possuem uma capacidade baixa de empacotamento (< 4,8 kb), comprometer a sua utilização para fornecimento de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Assim, parece que o LVs seria a plataforma de escolha nas aplicações envolvidas no fornecimento de ferramentas CRISPR/dCas9. Portanto, o protocolo descrito aqui vai ser uma ferramenta valiosa para pesquisadores desejando entregar efetivamente Epigenoma-editando componentes para as células e órgãos. O protocolo mais descreve a estratégia para aumentar as capacidades de produção e expressão dos vetores através de uma modificação na CEI dos elementos dentro do vetor expressão gaveta30,35. A estratégia é baseada no romance o sistema desenvolvido e estudado em nosso laboratório e destaca sua capacidade de produzir partículas virais no intervalo de 1010 unidades virais (VU) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

O uso de derivados de hiPSC células representa uma abordagem valiosa para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a diferenciação de hiPSCs derivado de um paciente com a triplicação do locus de gene (SNCA) alfa-synuclein para a doença de Parkinson (PD)-populações neuronal dopaminergic relevantes. Acumular provas demonstrou-se que altos níveis de SNCA são causais para o desenvolvimento de PD reconhecer o insatisfeitas precisam estabelecer novas abordagens terapêuticas para a polícia, especialmente os alvos a regulação da expressão SNCA , nós recentemente desenvolveu um sistema CRISPR/dCas9-metilação-baseado no ADN para modular epigenetically transcrição SNCA enriquecendo os níveis de metilação na região reguladora SNCA intron 1. Para entregar o sistema, consistindo de um morto (desativado) versão do Cas9 (dCas9) fundiu-se com o domínio catalítico do DNA metiltransferase enzima 3A (DNMT3A), um vetor de Lentivirus é usado. Este sistema é aplicado às células com a triplicação do locus a SNCA e reduz os níveis de proteína e SNCA-mRNA por cerca de 30% através da metilação do DNA alvo da SNCA intron 1. A aperfeiçoá-lo downregulation dos níveis SNCA resgata doença relacionada com fenótipos celulares. O protocolo atual, nosso objetivo é descrever um procedimento passo a passo para diferenciar hiPSCs em células progenitoras neurais (NPCs) e a criação e a validação dos ensaios pyrosequencing para a avaliação do perfil de metilação na SNCA intron 1. Para descrever mais detalhadamente o sistema de lentivirus-CRISPR/dCas9 usado nesses experimentos, este protocolo descreve como produzir, purificar e concentrar Lentivirus vetores e para destacar a sua adequação para Epigenoma e genoma-edição de aplicações usando hiPSCs e NPCs. O protocolo é facilmente adaptável e pode ser usado para produzir lentivírus de alta concentração para aplicações in vitro e in vivo.

Validação dos títulos de produção dos vetores LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro em comparação com a contrapartida GFP ingênuo
Realizamos p24amordaçar ELISA para comparar entre uma concentração física de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro com as contrapartes GFP/Puro ingênuo. Resultados representativos, apresentados na Figura 5A, demonstram que o rendimento físico dos vetores, ...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

A plataforma vetorial lentiviral tem uma grande vantagem sobre a plataforma vetorial mais popular, especificamente devido à capacidade dos vetores lentivirais de acomodar inserções genéticas maiores. Assim, parece que o vetor lentiviral seria a plataforma de escolha no aplicativo envolver a entrega de ferramentas CRISPR/Cas. Esta técnica imita o mecanismo regulatório natural da expressão alfa-sinucleína que quando prejudicada está associada à doença.Permite ajuste fino do nível de expressão versus mudanças robustas na expressão genética. Recomendo fortemente a validação desta ou abordagens similares usando RNAs guia múltiplos para triagem. Há grande variabilidade na potência guia RNA.A única maneira de determiná-lo é lá uma triagem e validação robustas e abrangentes. O sistema desenvolvido pode ser facilmente adaptado a outros sistemas de modelo, como modelos animais, incluindo roedores e primatas não humanos. Esses experimentos de acompanhamento podem servir como prova de conceito para futuros estudos clínicos.Demonstrando o procedimento estará a Dra. Ela também demonstrará os principais passos envolvidos na produção do Vetor Lentiviral. Também demonstrando o procedimento será a Dra.Ela demonstrará os principais passos no estabelecimento de ensaios para avaliar os perfis de metilação da sinucleína intron1. Ahila Sriskanda, uma funcionária do meu laboratório focada na cultura das células progenitoras neurais derivadas de células iPS humanas. Para começar, desenvolva o domínio catalítico DNMT3A a partir do d-Cas9-DNMT3A-GFP ampliando a porção DNMT3A do vetor.Depois de digerir o fragmento DNMT3A usando uma enzima de restrição BamH1. Cloat-lo no local BamH1 do vetor PBK-301 modificado carregando d-Cas9 e verificado por sequenciamento Sanger direto, para substituir o gene puro meissen repórter e o plasmídeo resultante com GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A puro Meissen e plasmid com FSC 1. Purifique o fragmento vetorial usando um método de purificação de gel.Prepare a inserção digerindo PBK-201 com FSC-1. Clone o fragmento FSC 1 no vetor para criar d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Cubra placas de 15 centímetros com gelatina de 0,2% para a transfecção e espere 10 minutos.Em seguida, aspire a gelatina e adicione 22,5 mililitros de médio glicose alto e 2,5 mililitros de suspensão celular HEK-293T previamente cultivada. Incubar as placas a 37 graus Celsius com 5% de CO2 até atingir 70 a 80% de confluência. Para preparar a mistura plasmida suficiente para placa de 115 centímetros use os quatro plasmídeos descritos no manuscrito.Adicione 312,5 micro litros de um cloreto de cálcio molar ao mesmo tubo de 15 mililitros com os plasmídeos e leve o volume final a 1,25 mililitros usando água dupla estéril destilada. adicione suavemente 1,25 mililitros de duas soluções X BBM que caem rapidamente ao tubo enquanto o vórtice. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.Aspire o meio das células e adicione 22,5 mililitros de DMEM de alta glicose recém-preparada sem soro. Adicione 2,5 mililitros da mistura de transfecção para cada placa. Gire as placas e incubar a 37 graus Celsius com 5%CO2 por duas a três horas após a incubação adicione 2,5 mililitros de soro por placa para alcançar 10% de diluição e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5%de CO2.Para colher o vírus coletar o supernaente de todas as células transfeinadas e puxá-las em tubos cônicos de 50 mililitros. Centrifugar a 400 a 450 g por 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, filtrar o supernascer através de 0,45 unidade de filtro de vácuo de 0,45 micrômetro. Em seguida, crie um gradiente de sacarose preparando tubos cônicos de ultra centrifugação.Adicione cuidadosamente o supernaente filtrado ao gradiente, distribuindo igualmente o supernatante viral entre cada tubo de ultra centrifugação preenchendo pelo menos três quartos de cada tubo. Centrifugar as amostras a 70000 g por duas horas a 17 graus Celsius. Colete suavemente frações de sacarose de 30% a 60% em tubos limpos adicione PBS frio de 1X até 100 mililitros de volume total e pipeta várias vezes para misturar.Adicione cuidadosamente quatro mililitros de 20% de sacarose em 1X PBS a cada tubo para estratificar a preparação viral continuar tubondo aproximadamente 20 a 25 mililitros da solução viral por cada tubo. Equilibre cuidadosamente os tubos e, em seguida, centrífuga a 70000 g por duas horas a 17 graus Celsius. Aspire cuidadosamente o líquido restante para remover completamente todo o líquido deixando o vírus contendo pelotas que mal são visíveis como pequenos pontos translúcidos.Depois de esvaziar o supernatante inverta os tubos em toalhas de papel para permitir que o líquido restante escorra. Adicione 70 micro litros de 1X PBS ao primeiro tubo e pipeta minuciosamente para suspender a pelota. Transfira a suspensão para o próximo tubo e repita com a tubulação e transferência até que todas as pelotas sejam restuadas.Adicione mais 50 micro litros de 1X PBS ao primeiro tubo e misture para lavá-lo. Em seguida, transfira a suspensão para o segundo tubo para lavar e continuar com a lavagem e transferência como anteriormente, rendendo aproximadamente 120 micro litros da suspensão final ligeiramente leitosa. Centrífuga a 10000 g por 60 segundos para obter uma suspensão clara transferir o supernante para um novo tubo e fazer cinco alíquotas de micro litro e armazená-los a 80 graus Celsius negativos colocar um Cryovial com MD NPC em bloco de calor de 37 graus Celsius por dois minutos e transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de DMEM-F12 quente.Centrífuga a 300 g por cinco minutos. Aspire o supernasce e suspenda as células em dois mililitros de meio N2B2 completo pré-aquecido. Adicione dois mililitros de N2B27 à suspensão da célula e placa dois mililitros de células em cada poço da placa de seis poços previamente preparada.Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2 durante a noite. Quando os NPCs MD estiverem em 70% de confluência, transduzi-los adicionando dois micro litros de vetores RNA d-Cas9-DNMT3A e gire suavemente a placa. Depois de incubar as células nas mesmas condições anteriormente durante 16 horas substitua o n2B27 médio 48 horas após a transdução.Adicione N2B27 com cinco microgramas por mililitro de Meissen puro para obter as linhas estáveis de MD NPC, cresça as células por três semanas em N2B27 mais meissen puro para caracterizar o perfil de metilação de SNCA intron 1. Primeiro extrair DNA de cada linha de células transdutoras estáveis usando um kit de extração de DNA, em seguida, usar 800 nanogramas de DNA para realizar uma conversão de bisulfeto com um kit comercialmente disponível e, em seguida, um bisulfeto converteu DNA em 20 nanogramas por micro litro. Para a análise de piro-sequenciamento, prepare a mistura mestre pcr em um tubo livre de núcleo transfira a placa de reação para um termociclador e inicie o PCR.Visualize os amplicons utilizando dois micro litros de produto PCR com uma coloração de 30 e brometo após a eletroforese do gel agarose. Para ensaios de piro-sequenciamento usaram misturas de não-metilados e metilados por DNAs convertidos de sulfeto e reagentes piro-sequenciamento, conforme descrito no manuscrito. Calcule os valores de metilação para cada site cpg usando os rendimentos físicos do software piro-sequenciável do vetor Lentivírus d-Cas9-DMMT3A-GFP e o vetor ingênuo gerado pelo GFP usando este protocolo são comparáveis.Isso sugere que a utilidade da espinha dorsal do vetorial otimizado combinada com o protocolo de produção otimizado resulta em altos rendimentos mais apertados das taxas de transdução de vetores CRISPR-dCas9 do vetor Lentivírus d-Cas9-DNMT3 GFP foi quatro vezes menor do que o vetor Gengitivo GFP sugerindo que a eficiência da embalagem do CRISPR d-Cas9-RNA seja reduzida. As taxas de transdução do vetor Puro Ingênuo foram cinco vezes maiores em comparação com o vetor d-Cas9-DNMT3A. Esses resultados foram confirmados ainda pelo uso do GFP ingênuo e d-Cas9-DNMT3A-GFP.O protocolo baseado em EB descrito aqui permite a diferenciação de MD NPCs. hiPSCs expressaram marcador de potência de prazer Oct4 enquanto o MD NPC é expresso tanto Nestin quanto FoxA2. Sete ensaios de sequenciamento piro-sequenciamento foram projetados e validados para a quantificação do status de metilação no intron 1 SNCA.Todos os 7 ensaios foram validados e mostraram correlação linear, utilizando os ensaios validados foi possível determinar os níveis de metilação nos 23 CPGs no SNCA intron 1 O mais importante a ser lembrado do que participar deste procedimento é trabalhar com células que mostram crescimento e saúde adequados para garantir consistência entre os experimentos. A produção de vetores de lentilha destacados nesta apresentação pode ser facilmente adotada para a produção de antivírus deficientes integrais que também pode ser facilmente dimensionada para gerar quantidades maiores ou vetores mais concentrados. Essa técnica pode abrir caminho para explorar o impacto patogênico da desregulação dos genes sobre a idade relacionada nem os transtornos generativos, incluindo a Doença de Alzheimer e demências relacionadas.A vantagem dos vetores de lentilha se desenvolverem aqui é que não é perigo ou não vetores infecciosos de lentilha têm apenas efeito mínimo no ciclo celular eles são plataforma de entrega seguras e confiáveis para aplicações de terapia genética.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Genética

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...