Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Эта работа частично финансируется Кан нейротехнология развития премию (O.C.) и национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) (R01 NS085011 для O.C.).

1. системы проектирования и производства вирус
<ol><li>Плазмиды проектирование и строительство Примечание: Строительство вектор LV-gRNA-dCas9-DNMT3A все-в-одном осуществляется с помощью производства- и оптимизированный выражение выражение кассеты, опубликованные Ортинский et...

LVs начали появляться как транспортное средство выбора для редактирования epigenome, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом из-за их способности (i) размещения больших нагрузок ДНК и (ii) эффективно передают широкий спектр деления и nondividing клетки. Крупногабаритная тара...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Использование производных hiPSC клеток представляет собой ценный подход к изучению человека нейродегенеративных заболеваний. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для дифференциации hiPSCs, производного от пациента с постулатов Локус гена (SNCA) альфа synuclein в болезнь Паркинсона (PD)-отношение дофаминергической нейрональных популяций. Накопление доказательств показывает, что высокий уровень SNCA каузативных для развития PD. Признавая неудовлетворенных необходимо создать новые терапевтические подходы для PD, особенно направленными на регуляцию экспрессии SNCA , мы недавно разработанных ТРИФОСФАТЫ/dCas9-ДНК Метилировани-на базе системы эпигеномно модулировать транскрипции SNCA , обогащая уровень метилирования в регионе нормативных Интрон 1 SNCA . Чтобы доставить система, состоящая из мертвых (отключен) версия Cas9 (dCas9) сливается с каталитического домен 3A фермента ДНК метилтрансфераза (DNMT3A), используется лентивирусные вектор. Эта система применяется к ячейкам с постулатов Локус SNCA и уменьшает SNCA-мРНК и уровни белка, около 30% через целевые метилирования Интрон SNCA 1. Доработаны Даунрегуляция SNCA уровней спасает сотовой фенотипов, связанных с болезнью. В текущем протоколе мы стремимся описать пошаговую процедуру для дифференциации hiPSCs в нейронных прогениторных клеток (НПС) и создание и проверка пиросеквенирования анализов для оценки профиля метилирования в SNCA Интрон 1. Более подробно изложить человека ТРИФОСФАТЫ/dCas9 система, используемая в этих экспериментах, этот протокол описывает, как производить, очищают и сконцентрировать лентивирусные векторы и подчеркнуть их пригодности для epigenome - и -изменения генома приложений, использующих hiPSCs и НПС. Протокол может быть легко адаптирована и могут быть использованы для производства высокого титра lentiviruses для приложений в vitro и in vivo.

Проверка производства титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro векторов, по сравнению с коллегой GFP наивно
Мы исполняли p24gag ELISA для сравнения между физической титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro с коллегами GFP/Puro наивными. Представитель результаты, представл...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Целевые epigenome ДНК, редактирования представляет собой мощный терапевтический подход. Этот протокол описывает производства, очищения и концентрации все-в-одном лентивирусные векторы, укрывательство трансген ТРИФОСФАТЫ dCas9-DNMT3A для epigenome редактирование приложений в человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)-производных нейронов.

Лентивирусные вектор платформа для эффективной доставки Epigenome-инструменты для редактирования в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток болезни моделей

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Лентивирусная векторная платформа имеет большое преимущество перед самой популярной векторной платформой, в частности из-за способности лентивирусных векторов вместить более крупные генетические вставки. Таким образом, кажется, что лентивирусный вектор будет платформой выбора в приложении, связанной с поставкой инструментов CRISPR/Cas. Этот метод имитирует естественный регулирующий механизм экспрессии альфа-синуклеина, который при нарушении связан с болезнью.Это позволяет тонкой настройки уровня экспрессии по сравнению с надежными изменениями в экспрессии генов. Я настоятельно рекомендую проверить этот или аналогичные подходы с использованием нескольких руководств RNAs для скрининга. Существует большая изменчивость в руководстве РНК потенции.Единственный способ определить это есть надежный и всеобъемлющий скрининг и проверка. Разработанная система может быть легко адаптирована к другим модельным системам, таким как модели животных, включая грызунов и нечеловеческих приматов. Эти последующие эксперименты могут служить доказательством концепции будущих клинических исследований.Демонстрация процедуры будет д-р Екатерина Ильич, старший сотрудник в моей лаборатории, упором на выполнение молекулярной процедуры клонирования для создания лентивирусных плазмидов вектор, связанных с этим проектом. Она также продемонстрирует ключевые шаги, связанные с производством Lentiviral Vector. Кроме того, демонстрируя процедуру будет Dr.Lidia Tagliafierro, postdoc из моей лаборатории упором на дифференциацию клеток iPS человека в патологических соответствующих клеток.Она продемонстрирует ключевые шаги в создании анализов для оценки профилей метилирования синуклеина intron1. Ахила Срисканда, сотрудник моей лаборатории, сосредоточенная на культуре клеток человека, полученных из клеток iPS, нейронных клеток-предшественников. Для начала разработайте каталитический домен DNMT3A из d-Cas9-DNMT3A-GFP, усилив часть вектора DNMT3A.После переваривания фрагмента DNMT3A с помощью фермента ограничения BamH1. Cloat его в BamH1 сайт модифицированного PBK-301 вектор проведения d-Cas9 и проверены прямым секвенирования Сэнгер, чтобы заменить чистый ген репортера Мейссен и в результате плазмид с GFP дайджест d-Cas9-DNMT3A-P2A чистый Мейссен и плазмид с FSC 1. Очистить фрагмент вектора методом очистки геля.Подготовьте вставку, переварив ПБК-201 с FSC-1. Клонировать фрагмент FSC 1 в вектор для создания d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Пальто 15 сантиметров пластин с 0,2% желатина для трансфекции и ждать 10 минут.Затем аспирировать желатин и добавить 22,5 миллилитров высокой глюкозы среды и 2,5 миллилитров ранее культурных HEK-293T клеточной подвески. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 до достижения 70 до 80% слияния. Для приготовления плазмидной смеси, достаточной для 115-сантиметровой пластины, используйте четыре плазмиды, описанные в рукописи.Добавьте 312,5 микролитров одного хлорида молярного кальция в ту же 15 миллилитровую трубку с плазмидами и довнесите конечный объем до 1,25 миллилитров с использованием стерильной двойной дистиллированной воды. аккуратно добавьте 1,25 миллилитров двух X BBM раствор падение мудрым в трубку во время вихря. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.Аспирировать среду из клеток и добавить 22,5 миллилитров свежеприготовленной высокой глюкозы DMEM без сыворотки. Добавить 2,5 миллилитров трансфекции смеси падение мудрым к каждой пластине. Закружить пластины и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в течение двух-трех часов после инкубации добавить 2,5 миллилитров сыворотки на тарелку для достижения 10%разбавления и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.Для сбора вируса собирать супернатант из всех трансфицированных клеток и тянуть их в 50 миллилитров конических труб. Центрифуга при температуре от 400 до 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем фильтровать супернатант через 0,45 микрометровый вакуумный фильтр. Далее создать градиент сахарозы, подготовив конические ультра центрифугации труб.Аккуратно добавьте отфильтрованное супернатант к градиенту, в равной степени распределяя вирусный супернатант среди каждой ультра центрифугации трубки заполнения по крайней мере три четверти каждой трубки. Центрифуга образцов на 70000 г в течение двух часов при 17 градусах по Цельсию. Аккуратно соберите от 30%до 60% фракций сахарозы в чистые трубки добавить холодный 1X PBS до 100 миллилитров общего объема и пипетки несколько раз, чтобы смешать.Аккуратно добавьте четыре миллилитров 20% сахарозы в 1X PBS к каждой трубке, чтобы стратифицировать вирусный препарат продолжается путем трубопроводов примерно от 20 до 25 миллилитров вирусного раствора на каждую трубку. Тщательно сбалансировать трубки, а затем центрифугу на 70000 г в течение двух часов при 17 градусах по Цельсию. Тщательно аспирировать оставшуюся жидкость, чтобы полностью удалить всю жидкость, оставляя вирус, содержащий гранулы, которые едва видны как небольшие полупрозрачные пятна.После опорожнения супернатант инвертировать трубки на бумажных полотенцах, чтобы остаться жидкость для слива. Добавьте 70 микролитров 1X PBS в первую трубку и тщательно пипетку, чтобы повторно приостановить гранулы. Перенесите подвеску в следующую трубку и повторите с пипетки и передачи до тех пор, пока все гранулы повторно приостановлено.Добавьте еще 50 микролитров 1X PBS в первую трубку и перемешайте, чтобы вымыть ее. Затем перенесите подвеску на вторую трубку для мытья и продолжить стирку и передачу, как и раньше, что дает около 120 микролитров слегка молочной окончательной подвески. Центрифуга на 10000 г в течение 60 секунд, чтобы получить четкую суспензию передачи супернатанта в новую трубку и сделать пять микролитров алицита и хранить их при отрицательных 80 градусов по Цельсию место Cryovial с MD NPC в 37 градусов по Цельсию тепловой блок в течение двух минут и передачи оттаящих клеток в 15 миллилитров конической трубки с 10 миллилитров теплого DMEM-F12.Центрифуга при 300 г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить клетки в двух миллилитров предварительно нагревается полный N2B2 среды. Добавьте два миллилитров N2B27 к клеточной подвеске и пластину два миллилитров клеток в каждом колодец ранее подготовленной BMM закодированной шести пластины хорошо.Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2 в одночасье. Когда MD NPCs находятся на 70% слияния, трансдуцатор их, добавив два микро-литра лентивирусного руководства РНК d-Cas9-DNMT3A векторов и осторожно вихрем пластины. После инкубации клетки в тех же условиях, что и ранее в течение 16 часов, заменяют N2B27 средней через 48 часов после трансдукции.Добавить N2B27 с пятью микрограммами на миллилитр чистого Мейссена, чтобы получить стабильные линии MD NPC, выращивать клетки в течение трех недель в N2B27 плюс чистый Мейссен, чтобы охарактеризовать метилирование профиля SNCA intron 1. Сначала извлечь ДНК из каждой стабильной линии клетки трансдуцера с помощью набора для извлечения ДНК, затем использовать 800 нанограммов ДНК для выполнения преобразования бисульфида с коммерчески доступным комплектом, а затем бисульфид преобразуется ДНК до 20 нанограмм на микро-литр. Для пиро-секвенирования анализа подготовьйте мастер-микс ПЦР в ядре свободной трубки, перенесите реакционной пластины на термо-циклер и запустите ПЦР.Визуализуйте ампликоны с использованием двух микролитров ПЦР-продукта с окрашиванием 30 и бромистого окрашивания после электрофорезы агарозового геля. Для пиро-секвенирования анализов использовались смеси не метилированных и метилированных сульфидными преобразуется ДНК и пиро-секвенирования реагентов, как описано в рукописи. Рассчитать значения метилирования для каждого сайта CPG с помощью пиро-секвенирования программного обеспечения физических урожаев Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP вектор и наивный вектор GFP порожденных с помощью этого протокола сопоставимы.Это говорит о том, что полезность оптимизированной векторной магистрали в сочетании с оптимизированным протоколом производства приводит к более высоким урожаям более жестких векторов CRISPR-dCas9, трансдукционных показателей lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP вектор был в четыре раза ниже, чем у наивного вектора GFP, что свидетельствует о снижении эффективности упаковки CRISPR d-Cas9-RNA. Скорость трансдукции вектора Naive PURO была в пять раз выше по сравнению с вектором d-Cas9-DNMT3A. Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью Naive GFP и d-Cas9-DNMT3A-GFP.EB на основе протокола, описанного здесь позволяет дифференциации MD NPCs. hiPSCs выразил удовольствие потенции маркер Oct4 в то время как MD NPC выражается как Nestin и FoxA2. Семь пиро-секвенирования анализов были разработаны и проверены для количественной оценки состояния метилирования в интроне SNCA 1.Все 7 анализов были проверены и показали линейную корреляцию, используя проверенные анализы можно было определить уровни метилирования на 23 CPGs в SNCA intron 1 Самое главное помнить, чем посещать эту процедуру является работа с клетками, которые показывают надлежащий рост и здоровье, чтобы обеспечить согласованность между экспериментами. Производство векторов чечевицы, выделенных в этой презентации, может быть легко принято для производства интегральных дефицитных антивирусов, это также может быть легко масштабировано для генерации больших количеств или более концентрированных векторов. Этот метод может проложить путь для изучения патогенного воздействия генов де-регуляции на возрастных, ни генеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера и связанных с ними слабоумия.Преимущество векторов чечевицы здесь заключается в том, что это не опасно или не инфекционные векторы чечевицы имеют лишь минимальное влияние на клеточный цикл, они являются безопасной и надежной платформой доставки для применения генной терапии.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Системные поставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Микроинъекции эмбриона и трансплантации техника для манипуляции генома Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Изоляция, характеристика и микроРНК основе генетической модификации человека Стоматологическая фолликула стволовых клеток

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...