Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Este trabajo fue financiado en parte por el Kahn Neurotecnología desarrollo Premio (C.O.), institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) (NS085011 R01 para C.O.).

1. diseño y producción de Virus
<ol><li>Construcción y diseño de plásmido Nota: La construcción de un vector de LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one se realiza utilizando una producción- y optimizado de expresión expresión casete publicada por Ortinski et al.30. El cassette de vector lleva una repetición del sitio de reconocimiento del factor de transcripción Sp1 y una canceladura de vanguardia dentro del sin traducir (U3') región de una repetición te...

LVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección para la edición de epigenoma, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido principalmente a su capacidad para (i) grandes cargas útiles de DNA y (ii) transducen eficazmente una amplia gama de dividir y células nondividing. La eficacia de empaquetado grande de las LVs es especialmente beneficiosa para las aplicaciones de embalaje de los sistemas CRISPR/dCas9 que son de gran tamaño. Desde esta perspectiva, LVs representan la plataforma de ele...

Múltiples plataformas de edición de epigenoma han desarrollado recientemente para cualquier secuencia de ADN en las regiones que controlan la expresión de gene1,2. Las herramientas de edición de epigenoma creadas están diseñadas para (i) regular la transcripción, (ii) alterar modificaciones post-traduccionales de las histonas, (iii) modificar la metilación del ADN y (iv) modular las interacciones del elemento regulador. El enfoque para la fijación de los modificadores de la transcripción de la cromatina a un Cas9 desactivados (muertos) (dCas9) levantado de previamente desarrolladas plataformas de edición de epigenoma, como zinc dedo de proteínas (ZFPs) y efectores como activador de transcripción (cuentos), albergar un dominio potente efector transcripcional (ED) fusionados con el diseño dominio DNA-que atan (DBD)3. Los resultados del fenotipo deseado como activación o represión es definido por la molécula efectora anclada a los loci endógenos (figura 1). Para crear activadores transcripcionales programables, dCas9/gRNA módulos están vinculados con VP164,5,6 (figura 1A), un dominio de activación viral que recluta Pol II y la maquinaria de transcripción general. La modificación de este sistema ha incluido VP64, un tetrámero de dominios VP16, proporcionando una activación más robusto tipo5,6. El sistema ha sido empleado con éxito para activar regiones de codificación y los dirigidos a promotores y elementos reguladores. Lo importante es que, aunque las moléculas VP64 no modifican directamente la estructura de la cromatina en la región de destino, recluta a modificadores de la cromatina que se unen los resultados en la deposición de las marcas activa (eucromatina), como la acetilación de H3/H4 y H3 K4 di / Tri-metilación5,6. Además VP64, la subunidad p65 del humano complejo NF-kB ha sido anclada a la dCas9/gRNA módulo7. Curiosamente, la inmovilización de estos efectores a las regiones corriente arriba de los sitios de inicio de transcripción (TSSs) a promotores da como resultado una inducción del gen fuerte. Sin embargo, efectores VP64 y p65 también pueden ejercer efectos activatory al ser enlazadas a las regiones ubicadas aguas abajo de TSSs y potenciadores distal7,8. Para provocar una respuesta transcripcional más robusta, múltiples fusiones VP64 dCas9 o dCas9-p65 deben reclutarse a un solo objetivo locus9,10. Así, el reciente desarrollo de próxima generación activadores, que contratar varios dominios efector por un complejo dCas9-gRNA sola, como SunTag, ha dado como resultado una capacidad de activación más fuerte comparación con dCas9-VP64 de contrapartes fusion11 , 12. una mejor activación transcripcional ha sido obtenida mediante la fusión de VP64, p65 y Rta (VPR), un dominio de transactivación de gamma-herpesvirus, el C-terminal de dCas913 (figura 1A). Sistemas similares de CRISPR/dCas9 se han desarrollado para la represión de destino específico (figura 1B).
Represión del gen endógeno puede lograrse con fusiones de represor dirigido a través de una variedad de mecanismos (figura 1B). Se ha demostrado que CRISPR/dCas9 sistemas, relacionados con el represor DBD (incluso sin un dominio efector/s), eficaz pueden silenciar genes mientras que atado a un promotor o upstream, downstream-TSS regiones3,6 ,14. Los efectos sobre la transcripción es causada por la interferencia estérica de unión del factor de transcripción y el procesamiento de ARN polimerasa. Sin embargo, se necesitan enfoques más integrales, como represión génica por impedimento estérico sola a menudo no es suficiente para silenciar robusto. El reciente desarrollo de la próxima generación de silenciadores basados en sistemas de CRISPR/dCas9 con dominios represor transcripcional (TRD), modificadores de la histona (H3-K9 di-/ tri-metilación, H3-K27 di-/ tri-metilación; H3-K36 di-/ tri-metilación, desacetilación H3/H4) y la metilación del ADN (GPC) dirigida a la construcción de herramientas epigenéticas permitiendo más robusto silenciamiento efectos4,5,15,16, 17,18,19,20. Se ha demostrado que el reclutamiento de estos modificadores epigenéticos en el ADN puede conducir a la formación de cromatina más condensada y cerrada, que normalmente generan un silenciamiento más potente resultado21,22. El dominio silenciamiento más comúnmente utilizado con DBD es la caja asociada a Krüppel (Cascarudo)4,5. La contratación del factor se ha demostrado para corresponder con los cambios de la cromatina; sin embargo, los mecanismos de estas modificaciones deben ser elucidadas16,17,18. Recientemente, se ha demostrado que la localización de KRAB al ADN puede promover al montaje de la histona metiltransferasa SETDB1 y los complejos de NuRD histona desacetilación (HDAC), sugiriendo la posibilidad de que estas interacciones median la formación de condensación de la cromatina y silenciamiento transcripcional del3,13. Como un enfoque alternativo, los dominios efectores se pueden fusionar a DBD para crear una proteína silenciamiento epigenética personalizada. Este sistema cataliza directamente represivas marcas de ADN o modificaciones de las histonas.
Recientemente, el uso de sistemas CRISPR/dCas9 sintéticos anclada a la enzima DNMT3A ha sido repurposed para desactivación transcripcional. DNMT3A cataliza la metilación del ADN que ejerce represión transcripcional durante la formación de la heterocromatina en promotores de genes endógenos y otras regiones reguladoras (figura 1B)18,20. McDonald et al.18 y20 de Vojta et al fueron los primeros autores para informar que la metilación del ADN puede utilizarse para silenciamiento de epigenoma o represión, demostrando que el sistema de fusión de plásmido-entrega dCas9-DNMT3A potentemente puede mejorar metilación de la citosina en el TSS18,20. McDonald ' s y compañeros de trabajo demostraron que el empleo de la estrategia puede resultar en una reducción significativa (alrededor del 40%) en un gen supresor de tumores, los niveles de mRNA de CDKN2A 18. Del mismo modo, dirigida a la región unmethylated promotor de los genes de BACH o IL6ST muestra mayor metilación CpG que se ha correlacionado con una reducción de doble en la expresión génica del20. Nuestro laboratorio recientemente ha reutilizar el uso de la metilación del ADN para atenuar los resultados patológicos de SNCA sobreexpresión (figura 2)23. La estrategia se basa en la mejora selectiva en la metilación del ADN en la región del intrón 1 de SNCA , como fue divulgado previamente para ser hypomethylated en EP y demencia de Lewy (DLB) los cuerpos cerebros24,25, 26. Esta hipometilación se ha relacionado con sobreexpresión del SNCA , ofreciendo así un atractivo objetivo para la intervención terapéutica24,27,28. Nos recientemente mostró un bajo nivel de metilación del ADN en el intrón 1 del SNCA región en NPCs dopaminérgico derivado hiPSC Obtenido de un paciente de PD con el SNCA la triplicación de la23. La ventaja de este modelo experimental es que los PNJs pueden ser propagados enérgicamente en la cultura o más diferenciados en neuronas maduras, lo que permite una prueba eficiente identificar factores genéticos que median en fenotipos celulares, incluyendo oxidativo estrés y apoptosis29. Además, este modelo de sistema permite a los científicos a recapitular los acontecimientos del desarrollo que ocurrieron antes de la aparición de los síntomas en los pacientes. Además, NPCs hiPSC derivados representan una gran herramienta para poner a prueba las vías celulares y moleculares asociadas con la expresión génica. Lo importante, NPCs hiPSC derivados combinados con tecnología CRISPR/Cas9-epigenoma pueden facilitan enormemente el desarrollo de "drogas de última generación" para muchas enfermedades neurodegenerativas.
Para reducir niveles patológicos de expresión SNCA, recientemente desarrollamos un lentivirus sistema basado en que una proteína de fusión dCas9-DNMT3A y gRNA a específicamente la metilación CpG objetivo dentro del SNCA intrón 1 (figura 2A)23. Este protocolo describe vectores lentivirales (LV) diseño y producción en detalle. LVs representan un medio eficaz de ofrecer componentes CRISPR/dCas9 por varias razones, a saber: (i) su capacidad para llevar la DNA voluminoso inserciones, (ii) una alta eficiencia de transducción de una amplia gama de células, incluyendo células divisorias y nondividing30 y (iii) su capacidad para inducir respuestas inmunogénicas y citotóxicas mínima. Recientemente, aplicó el sistema del LV a neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y demostró el potencial terapéutico de LVs para la entrega de la edición de epigenoma metilación herramientas23 ( Figura 2B). De hecho, un sistema del LV-gRNA/dCas9-DNMT3A causa un aumento significativo en la metilación del ADN en la región del intrón 1 del SNCA . Este aumento se corresponde con la reducción de los niveles de mRNA y proteína SNCA 23. Por otra parte, downregulation del SNCA rescata fenotipos relacionados con la PD en el SNCA triplicación/hiPSC-derivado dopaminérgico neuronas (p. ej., mitocondrial ROS producción celular viabilidad y)23. Importante aún, hemos demostrado que la reducción en la expresión de SNCA por el sistema del LV-gRNA-dCas9-DMNT3A es capaz de revertir los fenotipos característicos de neuronas dopaminérgicas hiPSC derivado de un paciente de PD que llevó a la SNCA triplicación, como ROS mitocondriales producción y célula viabilidad23. El objetivo de este protocolo es 1) para indicar el protocolo de producción y concentración de una plataforma de LV optimizada para generar alta cuchicheaba preparaciones virales y 2) para describir la diferenciación de hiPSCs en NPCs con motivos para ser dopaminérgico maduro las neuronas31,32 y la caracterización de los niveles de metilación de la región específica dentro del SNCA intrón 1.
Lentivirales plataformas tienen una gran ventaja sobre la plataforma más popular de vector, es decir, adeno-asociado vectores (AAVs), que es la capacidad del primero para dar cabida a grandes inserciones genética33,34. Aireación puede generarse rendimientos significativamente más altos pero poseen una capacidad de envasado bajo (< 4,8 kb), comprometer su uso para la entrega de sistemas de CRISPR/Cas9 all-in-one. Así pues, parece que el LVs sería la plataforma de elección en las aplicaciones involucradas en la entrega de herramientas CRISPR/dCas9. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí será una herramienta valiosa para los investigadores que deseen entregar eficazmente epigenoma edición componentes a las células y órganos. El protocolo adicional describe la estrategia para aumentar las capacidades de producción y expresión de los vectores a través de una modificación en cis de los elementos en el vector expresión cassette30,35. La estrategia se basa en la novela el sistema desarrollado y estudiado en nuestro laboratorio y destaca su habilidad para producir partículas virales en el rango de 1010 unidades virales (VU) / ml30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

El uso de células derivadas de hiPSC representa un valioso enfoque para el estudio de enfermedades neurodegenerativas humanas. Aquí, describimos un protocolo optimizado para la diferenciación de hiPSCs derivada de un paciente con la triplicación del lugar geométrico del gene (SNCA) de alfa-sinucleína en la enfermedad de Parkinson (EP)-las poblaciones neuronales dopaminérgicas pertinentes. La acumulación de pruebas ha demostrado que altos niveles de SNCA son causales para el desarrollo de PD. Reconociendo la insatisfecha necesita establecer nuevos enfoques terapéuticos para la EP, especialmente aquellos dirigidos a la regulación de la expresión del SNCA , recientemente desarrolló un sistema CRISPR/dCas9-metilación-basado en el ADN para modular epigenéticamente SNCA transcripción por enriquecer los niveles de metilación en la región reguladora del intrón 1 de SNCA . Para entregar el sistema, que consta de un muerto (desactivado) versión de Cas9 (dCas9) fusionado con el dominio catalítico de la 3A de enzima metiltransferasa de ADN (DNMT3A), se utiliza un vector lentivirales. Este sistema se aplica a las células con la triplicación del lugar geométrico del SNCA y reduce los niveles de proteína y SNCA-mRNA por cerca de 30% a través de la metilación del ADN específica del SNCA intrón 1. El downregulation del afinado de los niveles SNCA rescata fenotipos celulares relacionados con la enfermedad. En el protocolo actual, nuestro objetivo es describir un procedimiento paso a paso para diferenciarse hiPSCs en células progenitoras neurales (NPCs) y el establecimiento y validación de los análisis de Pirosecuenciación para la evaluación del perfil de metilación en el SNCA intrón 1. Para describir más detalladamente el sistema de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizado en estos experimentos, este protocolo describe cómo producir, purificar y concentrar vectores lentivirales y destacar su idoneidad para aplicaciones de edición de genoma y epigenoma utilizando hiPSCs y NPCs. El protocolo es fácilmente adaptable y puede utilizarse para producir lentivirus de alto título para aplicaciones in vitro e in vivo.

Validación de los títulos de la producción de los vectores de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro en comparación con las contrapartes GFP de ingenuo
Realizamos p24gag ELISA para comparar entre títulos físicos de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro con las contrapartes GFP/Puro ingenuo. Resultados representativos, presentados en la figura 5A, demuestran que los rendimientos físicos de lo...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

La plataforma vectorial Lentiviral tiene una gran ventaja sobre la plataforma vectorial más popular, específicamente debido a la capacidad de los vectores lentivirales para acomodar un inserto genético más grande. Por lo tanto, parece que el vector lentiviral sería la plataforma de elección en la aplicación implica la entrega de herramientas CRISPR/Cas. Esta técnica imita el mecanismo regulador natural de la expresión de alfa-sinucleína que cuando se deteriora se asocia con la enfermedad.Permite ajustar el nivel de expresión frente a cambios robustos en la expresión génica. Recomiendo encarecidamente validar este o enfoques similares utilizando múltiples ARN guía para la detección. Hay una gran variabilidad en la potencia del ARN guía.La única manera de determinarlo es que hay un cribado y validación robustos y completos. El sistema desarrollado se puede adaptar fácilmente a otros sistemas modelo, como modelos animales, incluidos roedores y primates no humanos. Estos experimentos de seguimiento podrían servir como una prueba de concepto para futuros estudios clínicos.Demostrando el procedimiento estará la Dra. Ekaterina Ilich, miembro del personal superior de mi laboratorio, centrada en la ejecución del procedimiento de clonación molecular para la creación de Plásmidos Vectoriales Lentivirales relacionados con este proyecto. También demostrará los pasos clave involucrados en la producción de Vectores Lentivirales. También demostrará el procedimiento la Dra. Lidia Tagliafierro, un postdoctorado de mi laboratorio que se centra en la diferenciación de las células iPS humanas en células patológicas relevantes.Demostrará los pasos clave en el establecimiento de ensayos para evaluar los perfiles de metilación de la sinucleína intron1. Ahila Sriskanda, un miembro del personal de mi laboratorio que se centra en el cultivo de células progenitoras derivadas de células iPS humanas. Para comenzar, desarrolle el dominio catalítico DNMT3A a partir del d-Cas9-DNMT3A-GFP amplificando la porción DNMT3A del vector.Después de digerir el fragmento DNMT3A usando una enzima de restricción BamH1. Cloat en el sitio BamH1 del vector modificado PBK-301 que transporta d-Cas9 y verificado por secuenciación directa de Sanger, para reemplazar el gen reportero Meissen puro y el plásmido resultante con GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen y plásmido con FSC 1. Purificar el fragmento vectorial utilizando un método de purificación de gel.Prepare la plaquita digiriendo PBK-201 con FSC-1. Clonar el fragmento FSC 1 en el vector para crear d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Recubrir las placas de 15 centímetros con 0,2% de gelatina para la transfección y esperar 10 minutos.A continuación, aspirar la gelatina y añadir 22,5 mililitros de alto medio de glucosa y 2,5 mililitros de suspensión celular HEK-293T previamente cultivada. Incubar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de CO2 hasta alcanzar entre el 70 y el 80% de confluencia. Para preparar la mezcla de plásmido suficiente para la placa de 115 centímetros utilice los cuatro plásmidos descritos en el manuscrito.Añadir 312,5 micro litros de un cloruro de calcio molar al mismo tubo de 15 mililitros con los plásmidos y llevar el volumen final a 1,25 mililitros utilizando agua estéril doble destilada. añadir suavemente 1,25 mililitros de dos solución X BBM gota sabia al tubo durante el vórtice. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Aspirar el medio de las células y añadir 22,5 mililitros de DMEM de glucosa alta recién preparada sin suero. Añadir 2,5 mililitros de la mezcla de transfección gota sabia a cada plato. Revolotea las placas e incubar a 37 grados celsius con 5%CO2 durante dos a tres horas después de la incubación añadir 2,5 mililitros de suero por placa para lograr un 10% de dilución e incubar durante la noche a 37 grados Celsius con 5%CO2.Para cosechar el virus recoger el sobrenadante de todas las células trans infectadas y tirar de ellos en tubos cónicos de 50 mililitros. Centrifugar a 400 a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego filtrar el sobrenadante a través de la unidad de filtro de vacío de 0,45 micrómetros. A continuación, cree un gradiente de sacarosa mediante la preparación de tubos cónicos de centrifugación ultra.Agregue cuidadosamente el sobrenadante filtrado al gradiente distribuyendo por igual el sobrenadante viral entre cada tubo de centrifugación ultra llenando al menos tres cuartas partes de cada tubo. Centrifugar las muestras a 70000 g durante dos horas a 17 grados centígrados. Recoger suavemente 30%a 60%fracciones de sacarosa en tubos limpios añadir frío 1X PBS hasta 100 mililitros de volumen total y pipeta varias veces para mezclar.Añadir cuidadosamente cuatro mililitros de 20% de sacarosa en 1X PBS a cada tubo para estratificar la preparación viral continúe pipeteando aproximadamente 20 a 25 mililitros de la solución viral por cada tubo. Equilibre cuidadosamente los tubos y luego centrifugar a 70000 g durante dos horas a 17 grados centígrados. Aspirar cuidadosamente el líquido restante para eliminar por completo todo el líquido dejando el virus que contiene pellets que apenas son visibles como pequeñas manchas translúcidas.Después de vaciar el sobrenadante invertir los tubos en toallas de papel para permitir que el líquido restante drene. Añadir 70 micro litros de 1X PBS al primer tubo y pipetear a fondo para volver a suspender el pellet. Transfiera la suspensión al siguiente tubo y repita con pipeteo y transferencia hasta que todos los pellets se vuelvan a suspender.Agregue 50 micro litros adicionales de 1X PBS al primer tubo y mezcle para lavarlo. A continuación, transfiera la suspensión al segundo tubo para lavarla y continuar con el lavado y la transferencia como anteriormente, produciendo aproximadamente 120 micro litros de la suspensión final ligeramente lechosa. Centrifugar a 10000 g durante 60 segundos para obtener una suspensión clara transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y haga alícuota de cinco micro litros y guárdelas a 80 grados Celsius negativos coloque un Cryovial con MD NPC en un bloque de calor de 37 grados Celsius durante dos minutos y transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 15 mililitros con 10 mililitros de DMEM-F12 caliente.Centrifugar a 300 g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en dos mililitros de medio N2B2 completo precalentado. Añadir dos mililitros de N2B27 a la suspensión celular y placa dos mililitros de células en cada pozo de la placa de seis pozos previamente preparada codificada BMM.Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5%de CO2 durante la noche. Cuando los PNJ MD están al 70%confluencia, transducirlos añadiendo dos micro litros de vectores de ARN d-Cas9-DNMT3A de la guía lentivirus y arremolinar suavemente la placa. Después de incubar las células en las mismas condiciones que anteriormente durante 16 horas reemplace el medio N2B27 48 horas después de la transducción.Añadir N2B27 con cinco microgramos por mililitro de Meissen puro para obtener las líneas estables DE NPC MD, crecer las células durante tres semanas en N2B27 más Meissen puro para caracterizar el perfil de metilación de SNCA intron 1. Primero extraiga ADN de cada línea celular de transductor estable usando un kit de extracción de ADN, luego use 800 nanogramos de ADN para realizar una conversión de bisulfuro con un kit disponible comercialmente y luego un ADN convertido bisulfido a 20 nanogramos por micro litro. Para el análisis de pirosecuenciación preparar la mezcla maestra de PCR en un tubo libre de núcleos transferir la placa de reacción a un termociclo e iniciar la PCR.Visualice los amplicons utilizando dos micro litros de producto PCR con una tinción de 30 y bromuro después de la electroforesis de gel de Agarose. Para los ensayos de secuenciación pirofcionante se utilizaron mezclas de DNA sin metilarse y metilados por sulfuro convertidos y reactivos de secuenciación pirotractora como se describe en el manuscrito. Calcular los valores de metilación para cada sitio CPG utilizando rendimientos físicos de software de secuenciación de pir pirocisión del vector Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP y el vector naive GFP generado con este protocolo son comparables.Esto sugiere que la utilidad de la columna vertebral vectorial optimizada combinada con el protocolo de producción optimizado da como resultado un alto rendimiento más estricto de las tasas de transducción de vectores CRISPR-dCas9 del vector Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP fue cuatro veces menor que la del vector naive GFP, lo que sugiere que se reduce la eficiencia de empaquetado del vector CRISPR d-Cas9-RNA. Las tasas de transducción del vector Naive PURO fueron cinco veces más altas en comparación con el vector d-Cas9-DNMT3A. Estos resultados se confirmaron aún más utilizando el GFP ingenuo y el d-Cas9-DNMT3A-GFP.El protocolo basado en EB descrito aquí permite la diferenciación de LOS NPC MD. hiPSCs expresaron el marcador de potencia de placer Oct4 mientras que el NPC MD se expresa tanto Nestin como FoxA2. Se diseñaron y validaron siete ensayos de pirosecuenciación para la cuantificación del estado de metilación en el intrón 1 de la SNCA.Los 7 ensayos fueron validados y mostraron correlación lineal, utilizando los ensayos validados fue posible determinar los niveles de metilación en los 23 CPG en el intrón 1 de la SNCA Lo más importante a recordar que asistir a este procedimiento es trabajar con células que muestran el crecimiento y la salud adecuados para asegurar la coherencia en todos los experimentos. La producción de vectores de lentejas resaltados en esta presentación se puede adoptar fácilmente para la producción de integrales deficientes anti-virus que también se puede escalar fácilmente para generar grandes cantidades o vectores más concentrados. Esta técnica puede allanar el camino para explorar el impacto patógeno de la desregulación de genes en la edad relacionada ni los trastornos generativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y las demencias relacionadas.La ventaja de los vectores de lentejas que se desarrollan aquí es que no es peligro o no los vectores de lentejas infecciosas tienen sólo un efecto mínimo en el ciclo celular son una plataforma de administración segura y confiable para aplicaciones de terapia génica.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Investigación

Genética

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Silenciamiento de genes mediado por Lentiviral en pseudoislet humano preparado en placas de baja fijación

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...