Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Detta arbete var delvis finansierad av utmärkelsen Kahn Neurotechnology utveckling (att O.C.) och nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NIH/NINDS) (R01 NS085011 att O.C.).

1. systemdesign och Virus produktion
<ol><li>Plasmid design och konstruktion Obs: Byggandet av en allt-i-ett LV-gärna-dCas9-DNMT3A vektor utförs genom att använda en produktions- och uttryck-optimerade uttryck kassett utgiven av Ortinski et al.30. Vector kassetten bär en upprepning av webbplatsen erkännande av transkriptionsfaktor Sp1 och en state-of-the-art radering inom de oöversatta (U3') regionen i en terminal 3' långa upprepa (LTR) (<strong class=...

LVs har börjat dyka upp som fordonet val för epigenomet redigering, särskilt inom ramen för genetiska sjukdomar, främst på grund av deras förmåga att (i) rymma stor DNA nyttolaster och (ii) effektivt transduce ett brett utbud av delar och nondividing celler. Storförpackning effekten av LVs är särskilt fördelaktigt för de program som berör paketering av CRISPR/dCas9 system som är överdimensionerade. Ur detta perspektiv representerar LVs den plattform-av-val för leverans av allt-i-ett CRISPR/Cas9-system. A...

Flera epigenomet-redigering plattformar har nyligen framtagits för att rikta någon DNA-sekvenser i regioner som kontrollerar gene expression1,2. De skapa epigenomet-redigering verktyg är utformade för att (i) reglerar transkription, (ii) ändra posttranslationell Histon ändringar, (iii) ändra DNA-metylering och (iv) modulerar reglerande element interaktioner. Metoden med att förankra de transkription/kromatin modifierarna till en inaktiverad (döda) Cas9 (dCas9) upp från tidigare utvecklade epigenomet-redigering plattformar, såsom zink finger proteiner (ZFPs) och transkription aktivator-liknande effektorer (TALEs), härbärgerat en potent transkriptionell effektor domän smält (ED) till designade DNA-bindande domänen (DBD)3. Resultaten av den önska fenotypen som aktivering eller förtryck definieras av effektor molekylen förankras i de endogena loci (figur 1). För att skapa programmerbara transkriptionell aktivatorer, är dCas9/gärna moduler kopplade till VP164,5,6 (figur 1A), en viral aktiveringen domän som rekryterar Pol II och allmänna transkription maskiner. Ändring av detta system har omfattat VP64, en tetramer VP16 domäner, som tillhandahåller ett ännu mer robust aktiveringen ränta5,6. Systemet har lyckat använts att aktivera kodning och kodande regioner genom att rikta initiativtagare och reglerande element. Ännu viktigare, även om VP64 molekyler inte direkt ändra kromatinstruktur i målregionen, det rekryterar kromatin modifierare som binder resultat i nedfall av aktiv (euchromatin) markerar, bland annat som H3/H4 Acetylering och H3-K4 di / Tri-metylering5,6. Förutom VP64, har den p65 subuniten av mänskliga NF-κB anläggningen varit bundna till dCas9/gärna modul7. Intressant, den tjudra av dessa effektorer till regionerna uppströms av transkription start platser (TSSs) och inom initiativtagare resulterar i en stark gen induktion. VP64 och p65 effektorer kan dock också utöva de activatory effekterna samtidigt kopplad till de regioner som ligger nedströms TSSs och distala enhancers7,8. För att framkalla en mer robust transkriptionell reaktion, behöver flera dCas9-VP64 eller dCas9-p65 fusioner rekryteras till en enda mål locus9,10. Som sådan, har den senaste utvecklingen av nästa generations aktivatorer, som rekrytera flera effektor domäner av en enda dCas9-gärna komplexa, såsom SunTag, resulterat i en starkare aktiveringen anlagen jämföra med dCas9-VP64 fusion motsvarigheter11 , 12. en förbättrad transkriptionell aktivering har erhållits genom fusion av VP64, p65 och Rta (VPR), en transkription domän från gamma-herpesviruses, C-terminus dCas913 (figur 1A). Liknande CRISPR/dCas9 system har utvecklats för target-specifika förtryck (figur 1B).
Endogena gen förtryck kan uppnås med bakåtkompilerade repressor fusioner genom olika mekanismer (figur 1B). Det har visats att CRISPR/dCas9 system, kopplat till repressor DBD (även utan en effektor domän/s), effektivt kan tysta genernas uttryck medan bundna till en promotor eller uppströms/nedströms-TSS regioner3,6 ,14. Effekterna på transkription orsakas av Sterisk inblandning av transkription faktorn bindande och RNA-polymeras bearbetning. Dock är mer omfattande strategier nödvändiga, som genen förtryck av Sterisk hinder ensam räcker ofta inte för robust ljuddämpning. Den senaste utvecklingen av nästa generation av ljuddämpare baserat på CRISPR/dCas9 system transporterar transkriptionell repressor domäner (TRDs), Histon modifierare (H3-K9 di-/ tri-metylering, H3-K27 di-/ tri-metylering; H3-K36 di-/ tri-metylering, H3/H4 deacetylering), och DNA (CpG) metylering ledde till byggandet av epigenetiska bearbetar att låta mer robust tysta effekter4,5,15,16, 17,18,19,20. Det har visats att rekryteringen av dessa epigenetiska modifierare till DNA kan leda till bildandet av mer slutna och kondenserad kromatin, som vanligtvis genererar en mer potent ljuddämpningssystemet resultatet21,22. Oftast tysta domänen används med DBDs är i Krüppel-associerade ruta (KRAB)4,5. Rekrytering av faktorn har visat sig motsvara kromatin förändringar; mekanismerna för dessa ändringar är dock ännu vara klarlagd16,17,18. Det har nyligen visat att lokaliseringen av KRAB DNA kan främja montering av den Histon methyltransferase SETDB1 och Histon deacetylering (HDAC) NuRD komplexen, vilket tyder på möjligheten att dessa interaktioner medla bildandet av kromatin kondens och transkriptionell ljuddämpningssystemet3,13. Som ett alternativ, kan effektor domäner vara smält till DBDs att skapa en anpassad epigenetiska ljuddämpningssystemet protein. Detta system katalyserar direkt repressiva DNA märken eller Histon ändringar.
Användningen av syntetiska CRISPR/dCas9 system uppbundna till enzymet DNMT3A har nyligen varit repurposed för transkriptionell avaktivering. DNMT3A katalyserar DNA-metylering som utövar transkriptionell förtryck i hela bildandet av Heterokromatin på endogena gen promotorer och andra regulatoriska regioner (figur 1B)18,20. McDonald et al.18 och Vojta et al.20 var de första författarna att rapportera att DNA-metylering kan användas för epigenomet-nedtystning eller förtryck, visar att plasmid-levererade dCas9-DNMT3A fusion systemet kraftigt kan öka cytosin metylering runt TSS18,20. McDonald och medarbetare visat att anställningen av strategin kan resultera i en betydande minskning (ca 40%) i en tumörsuppressor gen nivåer CDKN2A mRNA18. Likaså visar inriktning regionen unmethylated arrangören av BACH eller IL6ST gener ökad metylering av CpG som har korrelerats med en tvåfaldig minskning i gen uttryck20. Vårt labb har nyligen repurposed användning av DNA-metylering för förmildrande patologiska resultaten av SNCA överuttryck (figur 2)23. Strategin bygger på selektiv förbättring i DNA-metylering inom regionen SNCA intron 1, som det har tidigare rapporterats vara hypometylering i PD och demens med Lewy organ (DLB) hjärnor24,25, 26. Detta hypometylering har kopplats till SNCA överuttryck, vilket ger ett attraktivt mål för terapeutisk intervention24,27,28. Vi visade nyligen en låg nivå av DNA-metylering i den SNCA intron 1 regionen i hiPSC-derived dopaminerga NPC erhålls från en PD patient med SNCA tredubbling23. Fördelen med denna experimentella modell är att NPC kan vara kraftfullt förökade i kultur eller ytterligare differentieras efter mogna nervceller, möjliggör en effektiv screening att identifiera genetiska faktorer som förmedlar cellulära fenotyper, inklusive oxidativ stress och apoptos29. Dessutom möjliggör detta modellsystem forskare att sammanfatta de utvecklingsmässiga händelser som inträffade före symtomdebut hos patienter. Dessutom utgör hiPSC-derived NPC ett bra verktyg för att testa de cellulära och molekylära vägar som är associerad med genuttryck. Ännu viktigare, kan hiPSC-derived NPC kombinerat med state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenomet teknik underlätta utveckling av ”nästa generations läkemedel” för många neurodegenerativa sjukdomar.
För att minska patologiska nivåer av SNCA uttryck, vi nyligen utvecklat ett lentivirus-baserat system som bär en dCas9-DNMT3A fusionsprotein och gärna till specifikt mål CpG metylering inom den SNCA intron 1 (figur 2A)23. Detta protokoll kommer att beskriva lentiviral vektor (LV) design och produktion i detalj. LVs utgör ett effektivt medel för att leverera CRISPR/dCas9 komponenter av flera skäl, nämligen (i) deras kapacitet att bära skrymmande DNA infogar, (ii) en hög effektivitet av transducing mängder av celler, inklusive både dela och nondividing celler30 , och (iii) deras förmåga att inducera minimal cytotoxiska och immunogent Svaren. Nyligen vi tillämpas LV systemet på hiPSC-derived dopaminerga neuron från en patient med en tredubbling av det SNCA locus och visat den terapeutiska potentialen hos LVs för leverans av epigenomet-redigering metylering verktyg23 ( Figur 2B). Faktiskt, ett LV-gärna/dCas9-DNMT3A system orsakar en betydande ökning i DNA-metylering i regionen SNCA intron 1. Denna ökning motsvarar minskningen av nivåerna av SNCA mRNA och protein23. Dessutom räddar SNCA nedreglering PD-relaterade fenotyper i SNCA tredubbling/hiPSC-derived dopaminerga neuroner (t.ex. mitokondriell ROS produktion och cell bärkraft)23. Ännu viktigare, visat vi att minskningen av SNCA uttryck av LV-gärna-dCas9-DMNT3A systemet är kapabelt att ångra de fenotyper som är karakteristiska för hiPSC-derived dopaminerga nervceller från en PD-patienten som bar SNCA tredubbling, såsom mitokondriell ROS produktion och cell livskraft23. Målet med detta protokoll är 1) att beskriva protokollet av produktion och koncentration av en optimerad LV-plattform för att generera hög-tittered viral preparat och 2) att beskriva differentiering av hiPSCs i NPC mönstrad för att bli mogen dopaminerga nervceller31,32 och karakterisering av metylering nivåerna av riktade regionen inom SNCA intron 1.
Lentiviral plattformar har en stor fördel över mest populära vektor plattformen, nämligen adeno-associerade vektorer (AAVs), som är den förres förmåga att rymma större genetiska skär33,34. AAVs kan genereras på betydligt högre avkastning men besitter en låg förpackningar kapacitet (< 4,8 kb), att äventyra deras användning för att leverera allt-i-ett CRISPR/Cas9-system. Det verkar således att LVs skulle vara den plattform-av-val i tillämpningarna som är inblandad i leveransen av CRISPR/dCas9 verktyg. Protokollet beskrivs här kommer därför ett värdefullt verktyg för forskare som önskar att effektivt leverera epigenomet-redigering komponenter till de celler och organ. Protokollet ytterligare beskriver strategin för att öka produktionen och uttryck funktionerna i vektorerna via en ändring i cis av elementen inom vektor uttryck kassett30,35. Strategin bygger på romanen system utvecklat och studerat i vårt labb och belyser dess förmåga att producera viral partiklar i intervallet 1010 viral enheter (VU) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Användning av hiPSC-derived celler representerar en värdefull metod att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för differentiering av hiPSCs härrör från en patient med en tredubbling av alfa-synuklein genen (SNCA) locus i Parkinsons sjukdom (PD)-relevanta dopaminerga neuronala populationer. Ackumulerande bevis har visat att höga halter av SNCA är orsakande för utveckling av PD. känna den otillfredsställda måste upprätta nya terapeutiska metoder för PD, särskilt de inriktning regleringen av SNCA uttryck, vi nyligen utvecklat ett CRISPR/dCas9-DNA-metylering-baserade system för att modulera epigenetiskt SNCA transkription genom att berika metylering nivåer på regionen SNCA intron 1 tillsyn. Att leverera systemet, bestående av en död (inaktiverade) version av Cas9 (dCas9) smält med den katalytiska domänen av DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), en lentiviral vektor används. Detta system tillämpas på celler med en tredubbling av det SNCA locus och minskar SNCA-mRNA och proteinnivåer med ca 30% genom den riktade DNA-metyleringen av SNCA intron 1. De finjusteras nedreglering SNCA nivåer räddar sjukdomsrelaterade cellulära fenotyper. I det nuvarande protokollet, vi strävar efter att beskriva en steg för steg för att skilja hiPSCs i neurala stamceller (NPC) och etablering och validering av pyrosekvensering analyser för utvärdering av metylering profil i den SNCA intron 1. För att beskriva mer detaljerat det lentivirus-CRISPR/dCas9-system som används i dessa experiment, beskriver det här protokollet hur att producera, rena och koncentrera lentiviral vektorer och att uppmärksamma deras lämplighet för epigenomet och genomet-redigeringsprogram använder hiPSCs och NPCs. Protokollet är lätt anpassningsbar och kan användas för att producera hög titer lentiviruses för in vitro- och in vivo-program.

Validering av de produktionen titrarna av LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektorer jämfört naiv GFP motsvarigheten
Vi genomförde p24gag ELISA att jämföra mellan fysiska titrar av LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro med naiva GFP/Puro motsvarigheter. Representativa resultat, presenteras i figur 5A, visat att fysiska avkastning av vektorer, genereras med hjälp av protokollet som anges ...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Riktade DNA epigenomet redigering representerar en kraftfull terapeutisk metod. Det här protokollet beskriver produktion, rening och koncentration av allt-i-ett lentiviral vektorer härbärgerat den CRISPR-dCas9-DNMT3A transgenens för epigenomet redigeringsprogram i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda nervceller.

Lentiviral Vector plattform för effektiv distribution av epigenomet-redigeringsverktyg i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived sjukdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral vektorplattform har en ha som huvudämnefördel över den populäraste vektorplattformen, specifikt på grund av kapacitet av lentiviral vektorer att hysa större genetisk insats. Således verkar det som om den lentivirala vektorn skulle vara den plattform som valet i ansökan innebär leverans av CRISPR/Cas verktyg. Denna teknik imitera den naturliga regleringsmekanismen av alfa-synuklein uttryck som när nedsatt är associerade med sjukdom.Det möjliggör finjustering av uttrycksnivån kontra robusta förändringar i genuttryck. Jag skulle starkt rekommendera att validera denna eller liknande metoder med hjälp av flera guide RNAs för screening. Det finns stor variation i guide RNA potens.Det enda sättet att avgöra det är det robust och omfattande screening och validering. Det utvecklade systemet kan enkelt anpassas till andra modellsystem som djurmodeller inklusive gnagare och icke-mänskliga primater. Dessa uppföljning experiment skulle kunna fungera som ett konceptbevis för framtida kliniska studier.Demonstrera förfarandet kommer att Dr.Ekaterina Ilich, en högre anställd i mitt labb, med fokus på utförande av molekylär kloning förfarande för att skapa Lentiviral Vector Plasmids relaterade till detta projekt. Hon kommer också att visa de viktigaste stegen i Lentiviral Vector produktion. Också visar förfarandet kommer att Dr.Lidia Tagliafierro, en postdoc från mitt labb med fokus på differentiering av mänskliga iPS-celler i patologiska relevanta celler.Hon kommer att demonstrera de viktigaste stegen i inrättandet av analyser för att utvärdera metyleringsprofilerna hos synuclein intron1. Ahila Sriskanda, en anställd i mitt labb med fokus på kulturen av mänskliga iPS cell-härledda neurala stamceller. Till att börja utveckla DNMT3A katalytisk domän från d-Cas9-DNMT3A-GFP genom att förstärka DNMT3A delen av vektorn.Efter att ha smält DNMT3A-fragmentet med hjälp av ett BamH1-restriktionsenzym. Cloat det in i BamH1 platsen av den ändrade PBK-301 vektorn som bär d-Cas9 och verifierat by riktar Sanger som sekvenserar, att byta ut den rena Meissen reportergenen och den resulterande plasmiden med GFP-sammandrag d-Cas9-DNMT3A-P2A rena Meissen och plasmid med FSC 1. Rena vektorfragmentet med hjälp av en gelreningmetod.Förbered skäret genom att smälta PBK-201 med FSC-1. Klona FSC 1-fragmentet i vektorn för att skapa d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Coat 15 centimeter plattor med 0,2%gelatin för transfektionen och vänta i 10 minuter.Därefter aspirera gelatinet och tillsätt 22,5 milliliter högt glukosmedium och 2,5 milliliter tidigare odlade HEK-293T cell suspension. Inkubera plattorna i 37 grader Celsius med 5%CO2 tills de når 70 till 80%sammanflödet. För att förbereda plasmid mix tillräcklig för 115 centimeter plattan använda de fyra plasmider som beskrivs i manuskriptet.Tillsätt 312,5 mikroliter av en molarkalciumklorid till samma 15 milliliterrör med plasmiderna och föra den slutliga volymen till 1,25 milliliter med sterilt dubbeldestillerat vatten. tillsätt försiktigt 1,25 milliliter av två X BBM lösning droppe klokt till röret medan virvelning. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur.Aspirera mediet från cellerna och tillsätt 22,5 milliliter nyberedda högt glukos DMEM utan serum. Tillsätt 2,5 milliliter av transfection blandningen droppe klokt till varje platta. Snurra plattorna och inkubera vid 37 grader Celsius med 5%CO2 i två till tre timmar efter inkubation tillsätt 2,5 milliliter serum per platta för att uppnå 10%-utspädning och inkubera över natten vid 37 grader Celsius med 5%CO2.Att skörda viruset samla supernatanten från alla transfekterade celler och dra dem i 50 milliliter koniska rör. Centrifugera vid 400 till 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur och filtrera sedan supernatanten genom 0,45 mikrometer vakuumfilterenhet. Nästa skapa en sackaros gradient genom att förbereda koniska ultra centrifugering rör.Tillsätt försiktigt den filtrerade supernatanten till övertoningen genom att lika fördela den virala supernatanten bland varje ultracentrifugeringsrör som fyller minst tre fjärdedelar av varje rör. Centrifugera proverna vid 70000 g i två timmar vid 17 grader Celsius. Samla försiktigt in 30%till 60%sackarosfraktioner i rena rör tillför kalla 1X PBS upp till 100 milliliter total volym och pipetten flera gånger för att blanda.Tillsätt försiktigt fyra milliliter på 20%sackaros i 1X PBS till varje rör för att stratifiera viruspreparatet fortsätta genom att pipettera cirka 20 till 25 milliliter av viruslösningen per varje rör. Balansera försiktigt rören och sedan centrifug vid 70000 g i två timmar vid 17 grader Celsius. Försiktigt aspirera den återstående vätskan för att helt ta bort all vätska lämnar viruset som innehåller pellets som knappt syns som små genomskinliga fläckar.Efter tömning supernatant invertera rören på hushållspapper för att låta den återstående vätskan att rinna. Tillsätt 70 mikro liter 1X PBS till det första röret och grundligt pipetter för att åter upphäva pelleten. Överför suspensionen till nästa rör och upprepa med pipettering och överföring tills alla pellets är åter upphängda.Lägg till ytterligare 50 mikro liter 1X PBS till det första röret och blanda för att tvätta den. Överför sedan suspensionen till det andra röret för att tvätta och fortsätta med tvättning och överföring som tidigare, vilket ger cirka 120 mikro liter av den något mjölkiga slutliga suspensionen. Centrifuge vid 10000 g i 60 sekunder för att få en tydlig fjädring överföra supernatanten till ett nytt rör och gör fem mikroliter alikvoter och förvara dem på negativ 80 grader Celsius placera en Cryovial med MD NPC i 37 grader Celsius värmeblock i två minuter och överföra de tinade cellerna till en 15 milliliter konisk tub med 10 milliliter av varmt DMEM-F12.Centrifug vid 300 g i fem minuter. Aspirera supernatanten och re-suspendera cellerna i två milliliter av pre värmt komplett N2B2 medium. Tillsätt två milliliter av N2B27 till cellfjädringen och platta två milliliter celler i varje brunn av den tidigare beredda BMM-kodade sex brunnsplåten.Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%CO2 över natten. När MD NPCs är på 70%sammanflödet, transduce dem genom att lägga till två mikro liter lentivirus guide RNA d-Cas9-DNMT3A vektorer och försiktigt snurra plattan. Efter inkubation av cellerna vid samma förhållanden som tidigare i 16 timmar ersätta N2B27 medium 48 timmar efter transduktionen.Lägg N2B27 med fem mikrogram per milliliter av ren Meissen för att erhålla den stabila MD NPC linjer, odla cellerna i tre veckor i N2B27 plus ren Meissen att karakterisera metylering profilen av SNCA intron 1. Först extrahera DNA från varje stabil givare cellinje med hjälp av en DNA extraktion kit, sedan använda 800 nanogram DNA för att utföra en bisulfid konvertering med en kommersiellt tillgänglig kit och sedan en bisulfid omvandlas DNA till 20 nanogram per mikro liter. För pyro-sekvensering analysen förbereda PCR master mix i en kärna fri rör överföra reaktionsplattan till en termo-cycler och starta PCR.Visualisera amplikonerna med hjälp av två mikroliter PCR-produkt med en 30 och bromidfärgning efter Agarose gelelektrofores. För pyrosekvenseringsanalyser som används blandningar av un-metylerade och metylerade av sulfidomconverted DNAs och pyro-sequencing reagens enligt beskrivningen i manuskriptet. Beräkna metyleringsvärdena för varje CPG-webbplats med hjälp av pyrosekvensering programvara fysiska avkastningen av Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vektor och Den Naive GFP vektor genereras med hjälp av detta protokoll är jämförbara.Detta tyder på att nyttan av den optimerade vektorns ryggrad i kombination med det optimerade produktionsprotokollet resulterar i hög avkastning som är tätare av CRISPR-dCas9-vektorernas transduktionshastigheter för Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-vektorn var fyra gånger lägre än för Den naiva GFP-vektorn som tyder på att förpackningseffektiviteten hos CRISPR d-Cas9-RNA minskar. Transduktionshastigheter för Den naiva PURO-vektorn var femfaldiga högre jämfört med d-Cas9-DNMT3A-vektorn. Dessa resultat bekräftades ytterligare genom att använda Naive GFP och d-Cas9-DNMT3A-GFP.EB baserade protokollet beskrivs här tillåter differentiering av MD NPCs. hiPSCs uttryckt njutning potens markör Oct4 medan MD NPC uttrycks både Nestin och FoxA2. Sju pyrosekvenseringsanalyser utformades och validerades för kvantifiering av metyleringsstatusen i SNCA intron 1.Alla 7 analyser validerades och visade linjär korrelation, med hjälp av de validerade analyserna var det möjligt att bestämma metyleringsnivåerna vid de 23 CPGs i SNCA intron 1 Det viktigaste att komma ihåg än att delta i detta förfarande är att arbeta med celler som visar korrekt tillväxt och hälsa för att säkerställa konsekvens över experiment. Produktionen av lins vektorer som lyfts fram i denna presentation kan lätt antas till produktion av integraler bristfälliga anti-virus det är också lätt kan skalas upp för att generera större mängder eller mer koncentrerade vektorer. Denna teknik kan bana väg för att utforska patogena effekterna av gener de-reglering på åldersrelaterade eller generativa sjukdomar inklusive Alzheimers sjukdom och relaterade demenssjukdomar.Fördelen med linsvektorer utvecklas här är att det inte är fara eller inte infektiösa linsvektorer har endast minimal effekt på cellcykeln de är säkra och tillförlitliga leveransplattform för genterapi applikationer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemiska leverans av mikroRNA använda rekombinant Adeno-associerade Virus serotyp 9 neuromuskulära sjukdomar hos gnagare

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroskop och Transplantation teknik för Nasonia vitripennis genomet Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolera, sekvensering och analysera extracellulära mikroRNA från humana mesenkymala stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral medierad gen ljuddämpning i humant Pseudoholmen beredd i låga fästplattor

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...