Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Bu eser kısmen Kahn NÖROTEKNOLOJİ geliştirme Ödülü (OC) ve ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar ve kontur (NIH/NINDS) tarafından finanse edildi (R01 NS085011 O.C. için).

1. sistem tasarımı ve virüs üretim
<ol><li>Plazmid tasarım ve İnşaat Not: Bir all-in-one LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektörü inşaatı bir üretim kullanarak gerçekleştirilen- ve ifadesi en iyi şekilde ifade kaset Ortinski vd30tarafından yayınlandı. Vektör kaset transkripsiyon faktörü Sp1 ve state-of--art silme Çevrilmeyen içinde tanıma sitenin tekrarı taşır (U3') bölge bir 3' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) (şekil...

LVs epigenome düzenleme, özellikle genetik hastalıklar bağlamında için Seçim aracı olarak ortaya çıkmaya başladık, (i) karşılamak için esas olarak yeteneklerini nedeniyle büyük DNA payloads ve (ii) bölme geniş bir yelpazesi verimli bir şekilde transduce ve nondividing hücreleri. LVs büyük ambalaj etkinliğinin ambalaj büyük boyutlu CRISPR/dCas9 sistemleri içeren uygulamalar için özellikle yararlıdır. Bu açıdan bakıldığında, LVs platformu-in-seçim tüm-içinde-bir CRISPR/Cas9 sistemler...

Birden çok platform epigenome düzenleme son zamanlarda herhangi bir DNA dizileri gene expression1,2kontrol bölgeleri hedeflemek için geliştirilmiştir. Oluşturulan epigenome düzenleme araçları (i) transkripsiyon düzenleyen, (II) alter ardından Histon değişiklikler, (III) DNA metilasyonu değiştirmek ve (iv) düzenleyici öğe etkileşimleri modüle için tasarlanmıştır. Devre dışı bırakılan bir (ölü) Cas9 için transkripsiyon/Kromatin değiştiriciler tutturmak yaklaşım (dCas9) yükseltilmiş üzerinden daha önce çinko gibi epigenome düzenleme Gelişmiş platformlar parmak proteinleri (ZFPs) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi effectors (hikayeler), güçlü transkripsiyon efektör etki alanı barındıran (ED) tasarlanmış DNA'ya bağlanıcı etki alanına (DBD)3erimiş. Etkinleştirme veya baskı gibi istenen fenotip sonucunu endojen loci (şekil 1) demirlemiş efektör molekül tarafından tanımlanır. Programlanabilir transkripsiyon aktivatörleri oluşturmak için dCas9/gRNA modülleri VP164,5,-6 (şekil 1A), Pol II ve genel transkripsiyon makine acemi bir viral harekete geçirmek etki alanına bağlıdır. Bu sistem modifikasyonu bile daha sağlam bir etkinleştirme oranı5,6sağlayan VP64, bir tetramer VP16 alanlarının yer verdi. Sistem başarıyla rehberleri ve onların düzenleyici elemanlarının hedefleyerek kodlama ve kodlamayan bölgeler etkinleştirmek için istihdam edilmiştir. VP64 molekülleri doğrudan hedef bölge Kromatin yapısında değişiklik yapmayın olsa bile, önemlisi, H3/H4 asetilasyon ve H3-K4 di da dahil olmak üzere etkin (euchromatin) işaretleri birikimi içinde sonuçları bağlama Kromatin değiştiriciler acemi / Tri-metilasyonu5,6. VP64 ek olarak, insan NF-κB kompleks p65 alt birim için dCas9/gRNA modül7gergin. İlginçtir, bu effectors bölgelere akıntıya karşı transkripsiyon başlangıç siteleri (TSSs) ve rehberleri içinde hayvan zinciri bir güçlü gen indüksiyon sonuçlanır. Yine de, VP64 ve p65 effectors da activatory etkileri uygulamayın aşağı TSSs ve distal arttırıcılar7,8bulunan bölgelere bağlı iken. Daha sağlam bir transkripsiyon yanıt temin için birden çok dCas9-VP64 veya dCas9-p65 füzyon bir tek hedef locus9,10' a işe gerekir. Bu nedenle, birden çok efektör etki alanı SunTag gibi bir tek dCas9-gRNA kompleksi tarafından işe yeni nesil harekete geçirmek son gelişmeler bir daha güçlü harekete geçirmek yetenek dCas9-VP64 füzyon karşılıkları11 ' e karşılaştırarak sonuçlandı , 12. geliştirilmiş bir transkripsiyon etkinleştirme VP64, p65 ve Rta (VPR), C-terminus dCas913 (şekil 1A) için gama-herpesviruses, bir transactivation etki alanı füzyon yoluyla elde etti. Benzer CRISPR/dCas9 sistemleri hedef özel baskı (şekil 1B) için geliştirilmiştir.
Endojen gen baskı mühendislik önleyici füzyon ile çeşitli mekanizmalar (şekil 1B) elde edilebilir. CRISPR/dCas9 sistemleri, önleyici DBD (bile olmadan bir efektör etki alanı/sn), bağlantılı verimli bir organizatörü veya akış yukarı/aşağı-TSS bölgeleri3,-6 gergin iken gen ekspresyonu sessizlik gösterilmiştir ,14. Transkripsiyon üzerindeki etkileri transkripsiyon faktörü bağlama ve RNA polimeraz işleme steric girişim tarafından neden oldu. Yine de, daha kapsamlı yaklaşımlar gerekli, steric engel yalnız gen baskı kez sağlam susturmak için yeterli değil gibi. Susturucular yeni nesil son geliştirme tabanlı transkripsiyon önleyici etki alanları (TRDs), Histon değiştiriciler taşıyan CRISPR/dCas9 sistemler üzerinde (H3-K9 di-/ tri-metilasyonu, H3-K27 di-/ tri-metilasyonu; H3-K36 di-/ tri-metilasyonu, H3/H4 deasetilasyonu) ve etkileri4,5,15,16, susturmak daha sağlam izin epigenetik araçlar inşaat için liderliğindeki (KSY) DNA metilasyonu 17,18,19,20. Bu epigenetik değiştiricileri için DNA alımı genellikle bir daha güçlü silencing sonucu21,22oluşturmak daha fazla kapalı ve yoğun Kromatin oluşumu için neden olabilir kanıtlanmıştır. DBDs ile kullanılan en yaygın silencing etki alanını Krüppel ilişkili kutusu (KRAB)4,5' tir. Faktör alımı Kromatin değişikliklerle karşılık göstermiştir; Bununla birlikte, bu değişiklikler mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır16,17,18olmak vardır. Son zamanlarda, bu KRAB DNA için yerelleştirme Histon metiltransferaz SETDB1 ve Histon deasetilasyonu (HDAC) NuRD kompleksleri, bu etkileşimler oluşumuna aracılık olasılığını ima kurul yükseltebilirsiniz gösterilmiştir Kromatin yoğunlaşma ve transkripsiyon susturmak3,13. Alternatif bir yaklaşım efektör etki alanları DBDs için özel bir epigenetik silencing protein oluşturmak için erimiş. Bu sistem doğrudan baskıcı DNA işaretleri veya Histon değişiklikler tromboksan.
DNMT3A enzim kaşif Balonlu keşif sentetik CRISPR/dCas9 sistemlerinin kullanımı son zamanlarda, transkripsiyon deaktivasyon için repurposed. DNMT3A endojen gen rehberleri ve diğer düzenleyici bölgeleri (şekil 1B)18,20heterochromatin oluşumu boyunca transkripsiyon baskı giderek artan DNA metilasyonu tromboksan. McDonald et al.18 ve Vojta vd.20 DNA metilasyonu epigenome-gen susturmak veya baskı, plazmid teslim dCas9-DNMT3A fusion sistemi kuvvetli artırabilir gösteren için kullanılabilir rapor için ilk yazarlar vardı sitozin metilasyonu TSS18,20civarında. McDonald ve iş arkadaşlarınızın istihdam stratejisinin önemli bir azalma (yaklaşık % 40) neden olabilir gösterdi bir Tümör baskılayıcı gen CDKN2A mRNA18düzeyleri. Benzer şekilde, BACH veya IL6ST genlerin bazlar organizatörü bölge hedefleme gen ifade20iki kat azalma ile ilişkili artan CpG metilasyonu gösterir. Laboratuarımızın son zamanlarda SNCA overexpression (Şekil 2)23patolojik sonuçlar inceltiyorum için DNA metilasyonu kullanımı repurposed. Daha önce hypomethylated PD ve demans Lewy organları (DLB) beyin24,25olduğu bildirilen gibi strateji DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölgede seçici geliştirme dayanır, 26. Bu hypomethylation SNCA overexpression, böylece terapötik müdahale24,27,28için cazip bir hedef sunan bağlı. Biz son zamanlarda SNCA intron 1 hiPSC kaynaklı dopaminerjik NPCs bölgede bir PD hasta SNCA triplication23ile elde edilen DNA metilasyonu düşük düzeyde gösterdi. Bu deneysel model NPCs sağlam kültüründe yayılır veya daha fazla olgun nöronların hücresel fenotipleri oksidatif dahil olmak üzere, arabuluculuk genetik faktörlerin tanımlamak etkili bir tarama etkinleştirme ayrıştırılan avantajdır stres ve Apoptozis29. Ayrıca, bu modeli sistem belirti başlangıçlı hastalarda önce gelişim olayları özetlemek bilim adamları sağlar. Buna ek olarak, hiPSC elde edilen NPCs gen ekspresyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler yollar test etmek için harika bir araç temsil eder. Önemlisi, state-of--art CRISPR/Cas9-epigenome teknoloji ile birlikte hiPSC elde edilen NPCs büyük ölçüde ilaçların"yeni nesil" pek çok nörodejeneratif hastalıklar için geliştirme kolaylaştırabilir.
Biz son zamanlarda bir dCas9-DNMT3A füzyon proteini ve gRNA için özel olarak hedef CpG metilasyonu SNCA intron 1 (şekil 2A) içinde taşıyan lentivirus tabanlı bir sistemin SNCA ifade patolojik düzeyde azaltmak için geliştirilen23. Bu iletişim kuralı lentiviral vektör (LV) tasarım ve üretim ayrıntılı olarak açıklanmıştır. CRISPR/dCas9 bileşenleri çeşitli nedenlerden ötürü teslim etmek için etkili bir yol LVs temsil, yani hantal DNA yürütmek için (i) kendi kapasitesi ekler, hücre bölünmesi ve nondividing hücreleri30 da dahil olmak üzere, geniş bir transducing (II) bir yüksek verimlilik ve (iii) yeteneklerini en az sitotoksik ve immünojenik yanıt-e doğru uyarmak için. Son zamanlarda, LV sistem SNCA locus triplication ile bir hastadan hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron için uygulanan ve LVs tedavi potansiyelini'dır epigenome düzenleme gösterdi metilasyonu23 ( araçları Şekil 2B). Gerçekten de, bir LV-gRNA/dCas9-DNMT3A sistemi DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölge, önemli bir artış neden olur. Bu artış SNCA mRNA ve protein23düzeyde azalma ile karşılık gelir. Ayrıca, SNCA downregülasyon PD ile ilgili fenotipleri SNCA triplication/hiPSC-türetilmiş dopaminerjik nöron (örneğin, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı)23yılında kurtarır. Önemlisi, biz gösterdi SNCA ifade LV-gRNA-dCas9-DMNT3A sistem tarafından azalma hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron taşıyan bir PD hastadan için karakteristik olan fenotipleri geri yeteneğine SNCA triplication, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı23gibi. Bu iletişim kuralı 1) üretim Protokolü ve konsantrasyon viral hazırlıklar yüksek tittered oluşturmak için en iyi duruma getirilmiş bir LV platformu belirlemenizi ve 2) hiPSCs farklılaşma olgun dopaminerjik olmak için desenli NPCs içine açıklamak için hedeftir nöronlar31,32 ve SNCA intron 1 hedeflenen bölgeye metilasyon düzeyi karakterizasyonu.
Lentiviral platformlar eski büyük genetik ekler33,34uyum yeteneği olan yani adeno ilişkili vektörel çizimler (AAVs), en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaj var. AAVs önemli ölçüde daha yüksek verim-ebilmek var olmak oluşturmak ama düşük paketleme kapasitesine sahip (< 4,8 kb), All-In-one CRISPR/Cas9 sistemleri sunmak için bunların kullanımı ödün. Böylece, görünüşe göre LVs platformu-in-seçimi CRISPR/dCas9 araçların teslimi ilgili uygulamalarda olurdu. Bu nedenle, burada özetlenen Protokolü hücre ve organların epigenome düzenleme bileşenleri etkin bir şekilde teslim etmek isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olacak. Daha fazla iletişim kuralı vektörel çizimler vektör ifade kaset30,35içindeki öğeler CIS içinde bir değişiklik ile üretim ve ifade yeteneklerini artırmak için strateji özetliyor. Strateji dayanır romanından sistem geliştirdi ve bizim laboratuarımızda okudu ve 1010 viral adet (VU) /mL30,35aralığında viral parçacıkların üretmek için onun yetenek vurgulamaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

HiPSC türetilmiş hücre kullanımı insan nörodejeneratif hastalıkları eğitim için değerli bir yaklaşım temsil eder. Burada, Alfa-synuclein gen (SNCA) locus triplication içine Parkinson hastalığı (PD) ile bir hastadan elde edilen hiPSCs farklılaşma için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklamak-ilgili dopaminerjik nöron popülasyonları. Kanıt biriken SNCA yüksek düzeyde PD. yeni tedavi yaklaşımları PD için özellikle de SNCA ifade, Yönetmeliği hedeflemesi kurmak için karşılanmamış ihtiyaç tanımayı geliştirme için sorumlu olduğunu göstermiştir biz Son zamanlarda epigenetically SNCA intron 1 Düzenleyici bölgesi düzeylerinde metilasyonu zenginleştirici tarafından SNCA transkripsiyon modüle bir CRISPR/dCas9-DNA metilasyon-tabanlı sistem geliştiriyoruz. Bir ölü oluşan sistem, teslim etmek (devre dışı) yorum-in Cas9 (dCas9) erimiş DNA metiltransferaz enzim 3A katalitik etki alanı ile (DNMT3A), lentiviral bir vektör kullanılır. Bu sistem ile SNCA locus triplication hücrelere uygulanmış ve SNCA intron 1 hedeflenen DNA metilasyonu ile yaklaşık % 30 SNCA-mRNA ve protein düzeyleri azaltır. SNCA düzeyleri ince ayar downregülasyon hücresel fenotipleri hastalığı ile ilgili kurtarır. Geçerli protokol, amacımız hiPSCs nöral progenitör hücre (NPCs) ve kuruluş ve pyrosequencing deneyleri SNCA metilasyonu profilinde değerlendirilmesi için doğrulama differentiating için adım adım bir yordam tarif etmek intron 1. Daha ayrıntılı olarak bu deneylerde kullanılan lentivirus-CRISPR/dCas9 sistemi seviyelendirmek için bu iletişim kuralını üretmek için arındırmak ve lentiviral vektörler konsantre ve kullanarak epigenome ve genom düzenleme uygulamaları için uygunluk vurgulamak için açıklar hiPSCs ve NPCs. Kolayca uyarlanabilir ve yüksek titresi lentiviruses tüp bebek ve içinde vivo uygulamaları için üretmek için kullanılan iletişim kuralı.

Üretim titreleri saf GFP Özgününü karşılaştırıldığında LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektörlerin doğrulama
P24gag ELISA LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro fiziksel titreleri saf GFP/Puro meslektaşları ile arasında karşılaştırmak için gerçekleştirilen. Temsilcisi sonuçları şekil 5A', sunulan, burada özetlenen, iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan Vekt...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral vektör platformu en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaja sahip, özellikle lentiviral vektörlerin yeteneği nedeniyle daha büyük genetik eklemek karşılamak için. Böylece, bu lentiviral vektör uygulamada tercih edilen platform crispr / Cas araçlarının teslim dahil olacağını görünüyor. Bu teknik, alfa-sinüklein ekspresyonunun doğal düzenleyici mekanizmasını taklit eder.Gen ekspresyonundaki sağlam değişikliklere karşı ifade düzeyinin ince ayarını sağlar. Ben kuvvetle tarama için birden fazla kılavuz RNA kullanarak bu veya benzeri yaklaşımlar doğrulama nızı öneririz. Kılavuz RNA potens büyük değişkenlik vardır.Bunu belirlemenin tek yolu sağlam ve kapsamlı tarama ve doğrulamadır. Geliştirilen sistem, kemirgen ve insan olmayan primat gibi hayvan modelleri gibi diğer model sistemlerine kolayca adapte edilebilir. Bu takip deneyi gelecekteki klinik çalışmalar için bir kavram kanıtı olarak hizmet verebilir.Prosedürü gösteren Dr.Ekaterina Ilich, benim laboratuvarda üst düzey bir personel, bu proje ile ilgili Lentiviral Vektör Plazmidler oluşturmak için moleküler klonlama prosedürü yürütme odaklanan olacaktır. O da Lentiviral Vektör üretiminde yer alan önemli adımları gösterecektir. Ayrıca prosedürü gösteren Dr.Lidia Tagliafierro, patolojik ilgili hücrelere insan iPS hücrelerinin farklılaşması odaklanan benim laboratuvar bir postdoc olacaktır.Sinüklein intron1 metilasyon profillerini değerlendirmek için tahlillerin kurulmasına ilişkin önemli adımları gösterecektir. Ahila Sriskanda, laboratuvarımda insan iPS hücre kaynaklı nöral ata hücrelerinin kültürüne odaklanan bir personel. Başlamak için, vektörün DNMT3A kısmını yükselterek d-Cas9-DNMT3A-GFP'den DNMT3A katalitik etki alanını geliştirin.Bir BamH1 restriksiyon enzimi kullanarak DNMT3A parçası sindirilmesinden sonra. D-Cas9 taşıyan modifiye PBK-301 vektörünün BamH1 bölgesine d-Cas9 taşıyın ve doğrudan Sanger dizilimi ile doğrulanır, saf Meissen muhabir geni ve ortaya çıkan plazmidi GFP sindirimi d-Cas9-DNMT3A-P2A saf Meissen ve FSC 1 ile plazmid ile değiştirin. Bir jel arıtma yöntemi kullanarak vektör parçasını arındırın.FSC-1 ile PBK-201 sindirerek eklemek hazırlayın. D-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP oluşturmak için FSC 1 parçasını vektöre klonla. Coat 15 santimetre plakalar transfection için% 0.2 jelatin ile ve 10 dakika bekleyin.Sonra jelatin aspire ve yüksek glikoz orta 22.5 mililitre ve daha önce kültürlü HEK-293T hücre süspansiyon 2.5 mililitre ekleyin. Plakaları %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın ve %70 ila %80'lik bir araya ulaşın. 115 santimetre lik plaka için yeterli olan plazmid karışımını hazırlamak için el yazmasında açıklanan dört plazmidi kullanın.Plazmidler ile aynı 15 mililitrelik tüp e bir azı dişi kalsiyum klorür 312,5 mikro litre ekleyin ve steril çift distile su kullanarak 1,25 mililitre için son hacmi getirmek. yavaşça girdap sırasında tüp akıllıca iki X BBM çözeltisi 1,25 mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat.Hücrelerden orta aspire ve serum olmadan taze hazırlanmış yüksek glikoz DMEM 22,5 mililitre ekleyin. Her plakaya 2,5 mililitre transfeksiyon karışımı damla ekleyin. Kuluçkadan sonra 2-3 saat boyunca %5 CO2 ile 37 santigrat derecede plakaları döndürün ve %5 CO2 ile bir gecede 37 santigrat derecede %10 seyreltme ve kuluçkaya yatmak için plaka başına 2,5 mililitre serum ekleyin.Virüs hasat için tüm transfected hücrelerden supernatant toplamak ve 50 mililitre konik tüpler onları çekin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 ila 450 g'da santrifüj edin ve supernatant'ı 0,45 mikrometre vakum filtre ünitesinden geçirin. Sonra konik ultra santrifüj tüpleri hazırlayarak bir sakaroz gradyan oluşturun.Her ultra santrifüj tüpü arasında her tüpün en az dörtte üçünü doldurarak viral süpernatantı eşit olarak dağıtarak filtrelenmiş süpernatantı degradeye dikkatlice ekleyin. Numuneleri 70000 g'de 17 santigrat derecede iki saat santrifüj edin. Temiz tüplere %30 ila %60 sakaroz fraksiyonu toplayın, 100 mililitreye kadar toplam hacim ve pipeti birden fazla kez karıştırın.Her tüp etüt etmek için her tüpe %20 sakarozun dört mililitresini dikkatlice ekleyin ve her tüp için yaklaşık 20 ila 25 mililitre viral çözeltiyi borulandırarak viral hazırlığı nitreye devam edin. Tüpleri dikkatlice dengeleyin ve sonra 70000 g'de 17 santigrat derecede iki saat boyunca santrifüj edin. Küçük yarı saydam noktalar olarak zar zor görülebilen peletleri içeren virüsü tamamen çıkarmak için kalan sıvıyı dikkatlice aspire edin.Supernatant boşalttınktan sonra kalan sıvı drenaj sağlamak için kağıt havlu tüpler ters. Peleti yeniden askıya almak için ilk tüpe 70 mikro litre 1X PBS ve iyice pipet ekleyin. Süspansiyonu bir sonraki boruya aktarın ve tüm peletler yeniden askıya alınana kadar pipetleme ve aktarma ile tekrarlayın.İlk tüpe 50 mikro litre 1X PBS ek leyip yıkayın. Daha sonra yıkamak ve yıkama ve daha önce olduğu gibi transfer devam etmek için ikinci tüp için süspansiyon aktarın, biraz sütlü son süspansiyon yaklaşık 120 mikro litre verimli. Centrifuge 10000 g için 60 saniye yeni bir tüp supernatant net bir süspansiyon transferi elde etmek ve beş mikro litre aliquot yapmak ve negatif 80 derece Santigrat onları saklamak MD NPC ile bir Cryovial yerleştirin 37 derece Santigrat ısı bloğu içine iki dakika ve sıcak DMEM-F12 10 mililitre ile 15 litrelik conical tüp için çözülmüş hücreleri aktarın.Santrifüj 300 gr'da 5 dakika. Supernatant aspire ve önceden ısıtılmış tam N2B2 orta iki mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna iki mililitre N2B27 ekleyin ve daha önce hazırlanmış BMM kodlu altı kuyunun her kuyusundaki iki mililitre hücreyi plakalayın.Hücreleri bir gecede %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın. MD NPT'ler %70'lik bir leştiğinde, iki mikro litre lentivirus kılavuzu RNA d-Cas9-DNMT3A vektörleri ekleyerek ve plakayı yavaşça döndürerek aktarın. Hücreleri daha önce 16 saat aynı koşullarda kuluçkaya yattıktan sonra transdüksiyondan 48 saat sonra N2B27 ortamını değiştirin.Kararlı MD NPC hatları elde etmek için saf Meissen mililitre başına beş mikrogram ile N2B27 ekleyin, SNCA intron 1 metilasyon profilini karakterize etmek için N2B27 artı saf Meissen üç hafta boyunca hücreleri büyümek. Önce dna çıkarma kiti kullanarak her kararlı transdüser hücre hattından DNA ayıklayın, sonra ticari olarak kullanılabilir bir kit ile bisülfit dönüşüm gerçekleştirmek için 800 nanogram DNA kullanın ve daha sonra bir bisülfit mikro litre başına 20 nanogram dna dönüştürülmüştür. Piro-sekme analizi için PCR ana karışımını çekirdeksiz bir tüpe hazırlayın reaksiyon plakasını bir termo-cycler'a aktarın ve PCR'yi çalıştırın.Agarose jel elektroforezini takip eden 30 ve bromür boyama ile iki mikro litre PCR ürünü kullanarak amperleri görselleştirin. Piro-sekans lama tahlilleri için, el yazmasında açıklandığı gibi sülfür dönüştürülmüş DNA'lar ve piro-sıralama reaktifleri tarafından metillenmemiş ve metilasyonlu karışımlar kullanılmıştır. Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vektörünün pyro-sektilasyon yazılımı fiziksel verimleri ve bu protokol kullanılarak oluşturulan Naive GFP vektörü kullanılarak her CPG sitesi için metilasyon değerlerini hesaplayın.Bu, optimize edilmiş vektör omurgasının, optimize edilmiş üretim protokolü ile birlikte, Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP vektörünün CRISPR-dCas9 vektörtransdüksiyon oranlarının daha sıkı olması yla birleştiğinde, CRISPR d-Cas9-RNA'nın ambalaj verimliliğinin azaldığını öne süren Naive GFP vektöründen dört kat daha düşük olduğunu göstermektedir. Naif PURO vektörünün transdüksiyon oranları d-Cas9-DNMT3A vektörüne göre beş kat daha yüksekti. Bu sonuçlar naif GFP ve d-Cas9-DNMT3A-GFP kullanılarak da doğrulandı.Burada açıklanan EB tabanlı protokol MD NPC'lerin farklılaşmasına izin verir. Yedi piro-sekans lama tahlilleri SNCA intron 1'deki metilasyon durumunun ölçülmesi için tasarlanmış ve doğrulanmış.Tüm 7 tahliller doğrulandı ve doğrusal korelasyon gösterdi, doğrulanmış tahliller kullanarak SNCA intron 23 CpGs de metilasyon düzeylerini belirlemek mümkün oldu 1 Bu prosedüre katılan daha hatırlanması gereken en önemli şey deneyler arasında tutarlılık sağlamak için uygun büyüme ve sağlık gösteren hücrelerle çalışmaktır. Bu sunumda vurgulanan mercimek vektörlerinin üretimi, daha büyük miktarlarda veya daha yoğun vektörler oluşturacak şekilde kolayca ölçeklendirilebilen, yetersiz anti-virüslerin integral üretimine kolayca kabul edilebilir. Bu teknik, genlerin yaşa bağlı de-regülasyon veya Alzheimer Hastalığı ve bunaklık dahil olmak üzere generatif bozukluklar üzerindeki patojenik etkisini keşfetmenin yolunu açabilir.Mercimek vektörleri burada geliştirmek avantajı bu tehlike ya da bulaşıcı mercimek vektörleri değil sadece hücre döngüsü üzerinde en az etkiye sahip değil onlar gen tedavisi uygulamaları için güvenli ve güvenilir dağıtım platformu konum.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Kemirgen nöromusküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant Adeno ilişkili virüs serotip 9 kullanarak mikroRNA sistemik teslim

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral aracılı transgenik fareler üretimi: doğrudan eğitim kurucuları basit ve son derece etkili bir yöntem

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...