Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Vi takker Mihn Duc for hans bidrag til en hurtig indførelse af denne procedure.

Alle de metoder og procedurer, der er beskrevet her, er godkendt af SISSA Organismo preposto al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering af konstruerede "grønne" progenitorpuljer
<ol><li>Forberedelse af den "grønne" pulje
	<ol>
<li>Mate en vild-type CD1 kvinde med en Mtaptegfp/+ grundlægger16. Euthanize den gravide dæmning ved livmoderhals dislokation på 12,5 dage post-coitum (dag 0 bestemmes ved vaginal stik inspektion...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Specifikke aspekter/trin i denne procedure er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. Først, (a) operatørerne skal være tilstrækkeligt foruddannet til sikkert at manipulere lentivira i et BSL-2-kompatibelt lab miljø. For det andet, (b) før mix "test" og "Control" neurale præparater, er det obligatorisk at omhyggeligt vaske de to tilsvarende Neuro Sphere suspensioner som beskrevet, for at forhindre enhver forsinket krydsinfektion af de to præparater på grund af uønskede lentiviral overføre. For det tredje, (...

Her beskriver vi en simpel metode, vi udviklede til at dissekere in vivo gen kontrol af neuronal cytoarchitecture. Baseret på in vitro-engineering af neuronal prækursorer, deres transplantation i neonatal hjerne og parret morfometrisk evaluering af "test" og "kontrol" celler, det gør det muligt at afsløre funktionelle konsekvenser af test gener i fin kontrol af neuronal morfologi i en hurtig og overkommelig måde. For at undersøge in vivo-genkontrol af neuronal arkitektur skal der tages fat på tre centrale tekniske spørgsmål: (1) opnåelse af et tilstrækkeligt mønstret udtryk for gen-of-Interest (GOI) og en nøjagtig kvantitativ kontrol af det; (2) opnåelse af en korrekt segmenteret visualisering af særskilte neuronal silhuetter; (3) fremkalde Statistisk signifikans af resultater, mens der anvendes et begrænset antal dyr.
Når de er tilgængelige, kan mus mutant linjer husly tetracyclin (tet)-kontrollerede transgener være det bedste værktøj til at løse det første spørgsmål1. Alternativt kan der anvendes somatisk transgenese. I sådanne tilfælde leveres transgenet via elektroporation2 eller viral transduktion3. Dernæst bevares det som et episome (f. eks. ved standard elektroporation4), eller det er integreret i genomet (tilfældigt, via antiretroviral integrasehæmmer5; eller på et defineret sted via crispr-forfremmet homologe rekombination (slendr)6 ).
Anden, neuronal silhuet visualisering kan opnås via (a) sparsomme ensartet mærkning eller (b) tætte differentiel mærkning. Med hensyn til sparsomme mærkning, avancerede Golgi-lignende metoder kan anvendes7, udvalgte neuronal minisets kan fyldes med biocytinel8, og salt-og-peber mærkning kan opnås takket være en tyndt udtrykt transgen. En sådan transgene kan vise variegeret transkriptionen (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres ved stokastiske rekombination (morf)10. Med hensyn til (b), state of art strategier omfatter CRE-medieret stokastiske rekombination inden for en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integration af fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatisk transgenese (klon)12.
Med hensyn til det tredje spørgsmål påvirkes det morphometriske resultat ofte af en stor tilfældig variation, der stammer fra forskelle mellem dyr og celle Indsprøjtnings uforudsete hændelser. Derfor anvendes et stort antal dyr sædvanligvis til at opnå den statistiske effekt, der er nødvendig for at vurdere den indiske morphometriske aktivitet.
De tidligere beskrevne tilgange beror ofte på avancerede tekniske færdigheder og kræver iøjnefaldende finansielle ressourcer, hvilket kan begrænse deres udbredelse inden for forskersamfundet. For at omgå disse problemer, vi udtænkt en nem og ligetil pipeline til at dissekere gen kontrol af neuroarchitecture in vivo på en hurtig og overkommelig måde. Dette er inspireret af en lignende Co-transplantation design tidligere udviklet til hurtig in vivo evaluering af antiblastic transgene aktivitet13.
Specifikt, det menes, at medtransplantation af in vitro manipuleret "grønne" neurale prækursorer ("test" og "kontrol" celler) i en "sort" modtager neonatal hjerne kan samtidig løse de tre centrale spørgsmål, der er anført ovenfor. I virkeligheden, in vitro lentiviral engineering af prækursorer, i velkontrollerede forhold, tillader vedligeholdelse af variabilitet af neuronal transgene udtryk på et minimum, langt under, at der normalt er forbundet med in vivo somatiske manipulationer (udført tidligere 14 , 15 og i vores ikke offentliggjorte resultater). Den resulterende nøjagtige kontrol af genekspression er sammenlignelig med den, der opnås ved tet-kontrollerede transgene modeller. Omkostningerne ved denne procedure er dog langt under dem, der stammer fra vedligeholdelsen af en transgene muse linje. Næste, fri-hånd celle injektion er let og kræver minimal træning. Desuden kan mængden af mærkede prækursorer, der injiceres i hver hjerne, let justeres for at opnå et tilstrækkeligt kumulativt antal tyndt fordelte prækursorer, samtidig med at det samlede antal transplanterede dyr holdes på et minimum. Sidst, men ikke mindst, modvirker Co-injektion af forskellige fluor-mærkede, "test" og "kontrol" prækursorer og efterfølgende parvis statistisk analyse af resultaterne virkningerne af interdyrs eksperimentelle variabilitet, hvilket gør det muligt at nå Statistisk signifikans af resultater, selv ved analyse af et begrænset antal personer13.
Det skal understreges, at, omend hurtig og billig, denne metode har to hovedbegrænsninger. For det første er det designet til at undersøge celle-autonome gen kontrol af neuronal arkitektur, og det er ikke hensigtsmæssigt at behandle miljøkontrol. For det andet, som transplanterede neuronal prækursorer nå deres endelige placering af en heterokronisk tidsplan, denne metode er at foretrække frem for model neuroarchitectonics kontrol sker tidligere migration færdiggørelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Genkontrol af neuronal cytoarchitecture er i øjeblikket genstand for intensiv efterforskning. Beskrevet her er en simpel metode udviklet til at studere in vivo gen kontrol af neocortical projektion neuron morfologi. Denne metode er baseret på (1) in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer som "test" og "kontrol" celler, (2) deres medtransplantation til vild-type hjerner, og (3) parret morfometrisk vurdering af deres neuronal derivater. Specifikt, E 12.5 pallial prækursorer fra panneuronal, genetisk mærkede donorer, er ansat til dette formål. De er konstrueret til at drage fordel af udvalgte promotorer og tetON/OFF-teknologi, og de er frihånds planteret til neonatal laterale ventrikler. Senere, efter immunofluorescens profilering af modtager hjerner, silhuetter af transplanterede neuroner er fodret med NeurphologyJ open source-software, deres morphometriske parametre udvindes, og gennemsnitlig længde og forgrenings indeks beregnes. Sammenlignet med andre metoder, denne ene giver tre vigtigste fordele: det giver mulighed for at opnå en fin kontrol af transgene ekspression til overkommelige omkostninger, det kræver kun grundlæggende kirurgiske færdigheder, og det giver statistisk pålidelige resultater ved analyse af en begrænset antal dyr. På grund af sit design, dog, det er ikke tilstrækkeligt til at løse ikke-celle-autonome kontrol af neuroarchitecture. Desuden bør det fortrinsvis anvendes til at undersøge neurite morfologi kontrol efter afslutning af neuronal migration. I sin nuværende formulering, denne metode er udsøgt tunet til at undersøge genkontrol af glutamaterge neortikale neuron arkitektur. Ved at drage fordel af transgene linjer, der udtrykker EGFP i andre specifikke neurale celletyper, kan det genbruges til at adressere genkontrol af deres arkitektur.

Der er fem primære datasæt, som giver nyttige oplysninger om de vigtigste aspekter af proceduren, hvoraf den første er (1) effektiviteten af de neurale prækursorer og co-transduktion af lentiviral vektorer. (2) et eksempel på de vigtigste træk ved de initiativtagere, der anvendes til at drive "test genet". (3) et eksempel på manipulerede celler, som er klar til transplantation. (4) en tegneserie, herunder centrale proceduremæssige detaljer om celle mikroinjektion i den neonatal hj...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Baseret på in vitro lentiviral engineering af neuronal prækursorer, deres Co-transplantation til vild-type hjerner og parret morphometrisk evaluering af "test" og "kontrol" derivater, denne metode giver præcis modellering af in vivo gen kontrol af neocortical neuron morfologi på en enkel og overkommelig måde.

Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Det overordnede mål med denne teknik er vurderingen af effekten af genudtryksmanipulationer på kortikal neuronal arkitektur in vivo. Vores første vigtige fordel ved denne procedure i forhold til dem, der er baseret på en neutral elektroporation, er den fine kontrol af genekspressionsniveauer. Specifikt muliggør denne integrerede rørledning in vivo-evaluering af defekt, ophøjet af små ændringer i genekspressionen på kontrol af neuronal cytoarkitektur.Desuden giver transplantationstestens parstruktur mulighed for en enorm reduktion i antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå statistisk signifikante resultater. Teknikken udnytter en forløber pulje stammer fra Tau EGFP transgene embryoner. Denne pulje er opdelt i to underpuljer, der alternativt er inficeret med to lentivirale blandinger.For at få en grøn test pulje og en gul kontrol pulje, der vil blive co-injiceret. Efter to dages in vitro ekspansion, er den resulterende neuro kugler adskilles, blandet en til en, og injiceres med en kapillær i musen ventrikel rum. Ti dage senere, immunofluorescens på koronale sektioner udføres for at tillade sammenligning mellem test og kontrol neuroner.Endelig afbildes og skeletoniseres de immunstained sektioner til endelig evaluering af morfometriske parametre. Før in vivo transplantation, forberede forløberen grønne pool. E12.5 embryoner, høstet fra en gravid dæmning tidligere parret til en Tau EGFP grundlægger, er sat i individuelle brønde af en multi-brønd plade i PBS løsning.Genotype dem hurtigt ved visuel inspektion under en blå lyslampe. Fjerne forbindelsen mellem de dissekerede grønne cortices til enkelte celler. Re-suspendere celler i proliferative medium, og underinddele dem i to lige store delpuljer.Inficere hver sub-pool med en dedikeret lentiviral mix. Hver blanding indeholder rød etiket virus eller sort kontrol virus. Samt virus for Tet-Off drevet transgene eller kontrol udtryk, henholdsvis.Hver lentivirus skal administreres ved en mangfoldighed af infektion på 8. Plade de inficerede celler i proliferativ medium med 2 mikrogram pr. milliliter doxycyclin. Overfør celler til kuvøsen og lad dem i 2 dage ved 37 grader.Efter 2 dage, de to sub-puljer skal fremstå som suspensioner af små neurosfærer. Homogent udtrykke det røde fluorescerende protein, eller ej. Efter konstruktion af prækursorer, sæt en vurdering array for transplantation i P0 hvide lab hvalpe.Brug borosilikat glas kapillærer med evig og indre diameter svarende til 1,5 millimeter og 1,12 millimeter, henholdsvis. Træk kapillæren med en P1000 puller. Først skal du indtaste trække programmet.For det andet skal kapillæren ind i holderne og stramme dem. For det tredje skal du starte programmet og tage de to trak mikrokapsler. Skær kapillær spidsen, i hånden med en skalpel, under stereomikroskopet for at opnå en spids med en udvendig diameter på 200-250 mikrometer.Endelig placere kapillærer på plasticine støtte i en lukket petriskål, og overføre det under kølerhjelmen. Desinficere optiske fibre og læg dem under kølerhjelmen. Bland EGTA og Fast Green master mix, at forberede celle sporstof løsning, og læg den igen under kølerhjelmen.Skær små stykker af laboratorium forsegling film til celle suspension spotting. Og endelig, forberede en opløsning på 1 milligram per milliliter steril doxycyclin bortskaffes i en 0,3 milliliter sprøjte. Injektionsrøret fremstilles af to latexrør.Fix en hård plast mund stykke til den ene ende af en latex rør. Fastgør derefter kapillærholderen til den ene ende af det andet latexrør. Tilslut de frie ender af de to latexrør fra et 0,45 mikrometersterilt filter som en barriere mod operatørbakterier.Anbring den resulterende aspiratorrørssamling på en plasticineholder, der skal holdes under kølerhjelmen. Indsamle, teste og kontrollere neurosfærer i separate rør. Centrifuge neurosphere suspensioner og erstatte supernatant med PBS.Gentag denne sekvens to gange mere. Centrifuge neurosphere suspensioner, erstatte supernatant ved trypsin løsning, og pipette cellen pellet op og ned, 4, 5 gange. Lad cellerne i kuvøsen stå i fem minutter for at få en enkelt cellesuspension.Blok trypsin med trypsinhæmmer løsning. Centrifugeceller, og re-suspendere dem i frisk proliferative medium. Tæl cellerne i de to puljer og juster deres koncentration til 100.000 celler pr. mikroliter i proliferativ medium.Derefter blandes test- og kontrolcellerne 1:1, og den resulterende blanding kontrolleres under et fluorescensmikroskop. Endelig placere blandingen på isen under kølerhjelmen. Forbered buret med moderen og hvalpene på et bord langt væk fra det kirurgiske operatørområde.Placer et bjærgningsbur på en vogn. Sæt en blanding af savsmuld taget fra moderens bur på bunden, og læg opringningsburet under en lampe. Til side, der er en isboks dækket af en aluminiumsfolie til anæstesi af P0 hvalpe.Lige før transplantationen tilsættes en 1 til 10 volumencellesporingsopløsning til et volumen af cellesuspension, og spot tre mikroliter af den resulterende blanding på et stykke laboratorieforseglingsfilm. Placer hvalpen på den kølige, aluminiumsfolie i et minut, og kontrollere, at det er fuldt bedøvet. I mellemtiden, aspirere de 3 mikroliter injektion mix i glas kapillær.Tør forsigtigt hovedet af den bedøvede hvalp med 70% ethanol. Dernæst finde det på den optiske fiber, for klart at identificere de kortikale halvkugler. Indtast kapillær ind i front og få adgang til ventrikelhulen.Mens du gør det, være opmærksom på ikke at beskadige blodkarrene. For at forhindre beskadigelse af ganglionic eminence, rotere nålen sideom sidet med tredive grader. Injicer forsigtigt cellerne i hulrummet og overvåg deres diffusion ved hjælp af Fast Green.Vent i fem til ti sekunder. Fjern glasnålen, pas på ikke at aspirere cellesuspensionen, og kassér den i en passende bortskaffelsesspand. Før hvalpen kommer sig efter anæstesi, injiceres 150 mikroliter doxyopløsning intraperitoneally for at holde det transgene udtryk stadig slukket efter transplantationen.Efter injektionen skal ungerne straks under lampen komme sig. Lad hvalpene der i fem til ti minutter, og når de er helt vågen, placere dem i buret med moderen. Overhold de opererede hvalpe i to til tre timer for at sikre, at moderen accepterer dem.Forsyne buret med drikkevand, der indeholder 0,5 mg/ml doxycyclin og saccharose, for at opretholde det transgene udtryk slukket. Udskift doxycyclin, der indeholder vand, med doxy-frit vand fire dage efter transplantationen. Således aktivering af trans-genet i postmitotiske neuroner.Hold mus i en doxy-fri regime i seks dage, og aflive dem på P10. Fix hjerner fra euthanized hvalpe i 4%PFA, ved fire grader, natten over. Fjern PFA-opløsningen, og udskift den med 30% saccharoseopløsning.Lad hjernen på fire grader, indtil de synker til hætteglasbunden. Overfør hjernerne til en engangsindlejringsform cirka halvt fyldt med kryo-inklusionsmedium. Frys den medfølgende hjerne ved 80 grader.Skær 60 mikron tykke koronale sektioner ved hjælp af en kryostat. Bearbejde sektioner for anti-GFP, anti-RFP immunfluorescens og kontrastain dem med DAPI-opløsning. Angiv arbejdsparametre for konfokale mikroskop korrekt som vist.Saml billeder af immunoassayed skiver, vælge GFP positive neuron-rige fotografiske felter blind for RFP signal distribution. Eksporter billederne som ND2-filer, og generer maksimale z-projektioner af dem som TIFF-filer. For at give mulighed for efterfølgende neuron skeletonisering blind af celle genotype, skjule det røde signal.Det kan du gøre ved at tilføje et justeringslag. Vælg niveauer, vælg rød. Indstil output til nul.Og gem filen som sådan. Skeletonisering udføres efterfølgende af en ny operatør, som ikke tidligere havde adgang til originale almindelige røde filer. For hver skjult rød fil skal du åbne filen, føje et tegnelag til det primære billede og vælge blyantværktøjet.Spor somer på grundlag af GFP signal. Så spor neuritterne. Endelig gemme mutlilayer fil, herunder neuronal silhuetter.Efterfølgende analyse af neuronale skeletter kan udføres af begge operatører. Åbn hver mulitlayer-fil, opret nye tomme 16-bit gråtonefiler med sort baggrund. En pr. neuron.Kopier og indsæt enkelte neuronale silhuetter, fra det primære billede, til gråtonefilerne. Kom tilbage til flerlagsfil og sluk justeringslaget for at afsløre neuronale genotyper. Gem 16-bit gråtonefiler, der anmærkninger de tilsvarende neurongenotyper.Import gråtonebilleder i ImageJ én efter én, og analyser skeletter ved NeurphologyJ plugin. Indsamle udvalgte NeurophologyJ primære data, det samlede areal af neurite længde, vedhæftede punkter og slutpunkter, i et regneark, og ansætte dem til at beregne sekundære morfometriske parametre. Den tekniske protokol, vi foreslår, gør det muligt at cotransduce langt de fleste neuroner genstand for undersøgelse, med de tilsigtede transgene sæt.Desuden gør det det muligt at opnå en betydelig homogenitet af transgene udtryksniveauer inden for den transucucerede cellepopulation. Et centralt element i vores procedure, er det parret konfiguration. En test og en kontrol prækursor pulje er separat manipuleret, blandet 1:1, og endelig co-transplanteret.Denne parrede tilgang vil gøre det lettere at opdage resultatforskelle, der er specifikt knyttet til forskellige genotyper. I dette eksempel analyserede vi koronale dele af transplanterede hvalpe, ti dage efter den intervenriske co-injektion af Foxg1 over-udtrykke neuron prækursorer og kontrol dem. Billeder af grupper af neuroner blev erhvervet med konfokal mikroskopi.Z-stack filer blev brugt til at beregne maksimale fremskrivninger. Neuronal silhuetter blev manuelt sporet. Her repræsenterer grønne og gule silhuetter henholdsvis Foxg1 over-ekspresning og kontrol neuroner.Endelig blev primære parametre opnået ved NeurphologyJ-analyse anvendt til beregning af sekundære morfometriske indekser, som illustreret. Dette er en simpel protokol, som gør det muligt for forskeren at vurdere den virkning, som det blandede udtryk for et givet gen, kan udøve på fin kontrol af neurite udvikling darth in vivo. De største fordele ved denne protokol er to.Eksisterende antal gener, der er involveret i neuronal morfogens, kan være funktionelt karakteriseret in vivo, i mangel af de tilsvarende teratogene linjer. Og der er brug for færre dyr til analysen for at få de signifikante statistiske resultater.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiale kønsceller Transplantation til CRISPR/Cas9-baserede kvantespring i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo mikroinjektion og Transplantation teknik for Nasonia vitripennis genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input Genome Sequencing bibliotek forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøvemateriale

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...