Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Wij danken Mihn Duc do voor zijn bijdrage aan de vroegtijdige instelling van deze procedure.

Alle hier beschreven methoden en procedures zijn goedgekeurd door de SISSA organismo preposto al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generatie van engineered "Green" voorlopercellen Pools
<ol><li>Voorbereiding van het "groene" zwembad
	<ol>
<li>Mate een wild-type CD1 vrouwtje met een MtaptEGFP/+ oprichter16. Euthanaseren de zwangere Dam door cervicale dislocatie op 12,5 dagen na-coitum (dag 0 wordt bepaald door vaginale plug inspe...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Specifieke aspecten/stappen van deze procedure zijn van cruciaal belang en vereisen speciale aandacht. Ten eerste moeten (a) exploitanten adequaat zijn vooropgeleid om lentivirussen veilig te manipuleren in een BSL-2-conforme labomgeving. Ten tweede, (b) voorafgaand aan het mengen van "test" en "controle" neurale preparaten, is het verplicht om de twee overeenkomstige neurosphere suspensies zorgvuldig te wassen zoals beschreven, om een vertraagde kruisbesmetting van de twee preparaten te voorkomen als gevolg van ongewens...

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die we hebben ontwikkeld om in vivo gencontrole van neuronale cytoarchitectuur te ontleden. Op basis van in vitro engineering van neuronale precursoren, hun transplantatie in neonatale hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" cellen, maakt het mogelijk om functionele implicaties van test genen te onthullen in de fijne beheersing van neuronale morfologie in een snelle en betaalbare manier. Om in vivo gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, moeten drie belangrijke technische kwesties worden aangepakt: (1) het bereiken van een adequaat gedessineerde gen-of-Interest (GOI) expressie en een nauwkeurige kwantitatieve controle ervan; (2) het verkrijgen van een correct gesegmenteerde visualisatie van verschillende neuronale silhouetten; (3) het opwekken van statistische significantie van de resultaten terwijl een beperkt aantal dieren wordt tewerkstelt.
Indien beschikbaar, muis Mutant lijnen cellen tetracycline (tet)-gecontroleerde transgenes mogelijk de beste tool om het eerste nummer1aan te pakken. Als alternatief kan somatische Transgenese worden gebruikt. In dergelijke gevallen wordt het transgen geleverd via electroporatie2 of virale transductie3. Vervolgens wordt het bewaard als een episome (bijv. bij standaard elektroporation4), of het is geïntegreerd in het genoom (willekeurig, via retrovirale integrase5; of op een gedefinieerde locatie, via crispr-gepromoveerde homologe RECOMBINATIE (slendr)6 ).
Tweede, neuronale silhouet visualisatie kan worden bereikt via (a) sparse uniforme labeling of (b) dichte differentiële labeling. Wat betreft sparse labeling, geavanceerde Golgi-achtige methodologieën kunnen worden gebruikt7, geselecteerde neuronale minisets kunnen worden gevuld door biocytine8, en zout-en-peper labeling kan worden verkregen dankzij een dun uitgedrukt transgene. Een dergelijk transgen kan bonte transcriptie (Thy-EGFP)9 vertonen of kan worden geactiveerd door stochastische recombinatie (Morf)10. Als voor (b), State of Art strategieën omvatten CRE-gemedieerde stochastische recombinatie binnen een multi-floxed fluoroprotein transgen array (brainbow)11, evenals piggybac-transposase-driven genomische integratie van fluoroprotein genen, eerder geleverd via somatische Transgenese (kloon)12.
Wat betreft het derde probleem, wordt de morometrische uitkomst vaak beïnvloed door een grote willekeurige variabiliteit, afkomstig van verschillen tussen dieren en contingenties van de celinjectie. Hierdoor wordt een groot aantal dieren gewoonlijk gebruikt om het statistische vermogen te bereiken dat nodig is om de werking van de GOI-Morfometrische activiteit te beoordelen.
De eerder beschreven benaderingen zijn vaak gebaseerd op geavanceerde technische vaardigheden en vereisen opvallende financiële middelen, die hun verspreiding binnen de wetenschappelijke gemeenschap kunnen beperken. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een eenvoudige en ongecompliceerde pijpleiding bedacht om op een snelle en betaalbare manier de genbeheersing van neuro architectuur in vivo te ontleden. Dit is geïnspireerd door een soortgelijk co-transplantatie ontwerp dat eerder is ontwikkeld voor een snelle in vivo evaluatie van antiblastische transgen activiteit13.
Specifiek, er wordt gedacht dat de co-transplantatie van in vitro engineered "groene" neurale precursoren ("test" en "controle" cellen) in een "zwarte" ontvangende neonatale hersenen kunnen tegelijkertijd de drie belangrijkste problemen die hierboven vermeld. In vitro lentivirale engineering van precursoren, in goed gecontroleerde omstandigheden, maakt het mogelijk om de variabiliteit van neuronale transgenexpressie minimaal te onderhouden, ver onder die meestal geassocieerd met somatische manipulaties (eerder uitgevoerd 14 , 15 en in onze niet-gepubliceerde resultaten). De resulterende nauwkeurige controle van genexpressie is vergelijkbaar met die bereikt door Tet-gecontroleerde transgene modellen. De kosten van deze procedure liggen echter ver onder die van het onderhoud van een transgene muis lijn. Volgende, vrije-hand celinjectie is eenvoudig en vereist minimale training. Bovendien kan de hoeveelheid gelabelde precursoren die in elke hersenen worden geïnjecteerd, gemakkelijk worden afgestemd om een voldoende Cumulatief aantal dunbevolkte precursoren te bereiken, terwijl ook het totale aantal getransplanteerde dieren minimaal blijft. Niet in de laatste plaats, co-injectie van verschillend fluoro-gelabeld, "test"-en "controle"-precursoren en daaropvolgende Pairwise statistische analyse van de resultaten neutraliseren de effecten van de experimentele variabiliteit van de Inter-Animal, waardoor het bereiken van statistische significantie van de resultaten, zelfs bij de analyse van een beperkt aantal personen13.
Benadrukt moet worden dat deze methode, zij het snel en voordelig, twee belangrijke beperkingen heeft. Ten eerste is het ontworpen om de celautonome gencontrole van neuronale architectuur te onderzoeken, en het is niet gepast om de milieucontrole aan te pakken. Ten tweede, aangezien getransplanteerde neuronale precursoren hun uiteindelijke locatie bereiken met een heterochronisch schema, verdient deze methode de voorkeur om neuroarchitectonische controle te modelleren die plaatsvindt na voltooiing van de migratie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Genbeheersing van neuronale cytoarchitectuur is momenteel het onderwerp van intensief onderzoek. Hier beschreven is een eenvoudige methode ontwikkeld om in vivo gencontrole van neocorticale projectie neuron morfologie te bestuderen. Deze methode is gebaseerd op (1) in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren als "test" en "Control" cellen, (2) hun co-transplantatie in wild-type hersenen, en (3) gepaarde morphometrische evaluatie van hun neuronale derivaten. Specifiek, E 12.5 palliale precursoren van panneuronale, genetisch gelabelde donoren, worden gebruikt voor dit doel. Ze zijn ontworpen om te profiteren van geselecteerde promotors en tetON/OFF-technologie, en ze zijn vrije hand getransplanteerd in neonatale laterale ventrikels. Later, na immunofluorescentie profilering van ontvangende hersenen, silhouetten van getransplanteerde neuronen worden gevoed in NeurphologyJ open source software, hun morphometrische parameters worden geëxtraheerd, en de gemiddelde lengte en vertakkings index worden berekend. In vergelijking met andere methoden, deze biedt drie belangrijke voordelen: het maakt het bereiken van de fijne controle van transgen expressie tegen betaalbare kosten, het vereist alleen elementaire chirurgische vaardigheden, en het biedt statistisch betrouwbare resultaten bij analyse van een beperkte aantal dieren. Vanwege het ontwerp is het echter niet voldoende om niet-cel-autonome controle van neuro architectuur aan te pakken. Bovendien, het moet bij voorkeur worden gebruikt om te onderzoeken neuriet morfologie controle na voltooiing van neuronale migratie. In zijn huidige formulering is deze methode prachtig afgestemd op het onderzoeken van gencontrole van glutamaterge neocorticale neuron architectuur. Gebruik te maken van transgene lijnen uitdrukken EGFP in andere specifieke neurale celtypen, het kan worden hergebruikt voor het aanpakken van gencontrole van hun architectuur.

Er zijn vijf primaire gegevenssets met nuttige informatie over belangrijke aspecten van de procedure, de eerste is (1) efficiëntie van neurale precursoren transductie en co-transductie door lentivirale vectoren. (2) een voorbeeld van de belangrijkste kenmerken van de organisatoren die werkzaam zijn om het "test gen" te stimuleren. (3) een voorbeeld van ontwikkelde cellen die klaar zijn voor transplantatie. (4) een cartoon met belangrijke procedurele details van celmicroinjection in het n...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Het algemene doel van deze techniek is de beoordeling van het effect van genexpressie manipulaties op corticale neuronale architectuur in vivo. Ons eerste belangrijke voordeel van deze procedure ten opzichte van die gebaseerd op een neutrale elektroporatie, is de fijne controle van genexpressieniveaus. Specifiek, deze geïntegreerde pijpleiding maakt de in vivo evaluatie van defect, verheven door kleine veranderingen in genexpressie op de controle van neuronale cytoarchitectuur.Bovendien zorgt de pairstructuur van de transplantatietest voor een enorme vermindering van het aantal dieren dat nodig is om statistisch significante resultaten te verkrijgen. De techniek maakt gebruik van een precursorpool afkomstig van Tau EGFP transgene embryo's. Deze pool is onderverdeeld in twee subpools die als alternatief zijn geïnfecteerd met twee lentivirale mixen.Om een groene testpool en een gele controlepool te verkrijgen die mede-injecteerde zal worden. Na twee dagen van in vitro expansie, de resulterende neuro bollen worden losgekoppeld, gemengd een op een, en geïnjecteerd met een capillaire in de muis ventriculaire ruimte. Tien dagen later wordt immunofluorescentie op coronale secties uitgevoerd om de vergelijking tussen test- en controleneuronen mogelijk te maken.Ten slotte worden de immunovlekken afgebeeld en geskeletteerd voor de eindevaluatie van morfometrische parameters. Voordat in vivo transplantatie, bereiden de voorloper groene zwembad. E12.5 embryo's, geoogst uit een zwangere moeder die voorheen aan een Tau EGFP-oprichter werd gekoppeld, worden in individuele putten van een multi-well plaat in PBS-oplossing geplaatst.Genotype ze snel door visuele inspectie onder een blauw licht lamp. Loskoppelen van de ontleed groene cortices aan enkele cellen. Schorst cellen opnieuw in proliferative medium en verdeel ze onder in twee even grote subpools.Infecteer elke subpool met een speciale lentivirale mix. Elke mix bevat rood label virus of zwart controlevirus. Evenals virussen voor Tet-Off gedreven transgene of controle expressie, respectievelijk.Elk lentivirus moet worden toegediend bij een veelheid aan infectie van 8. Plaat de geïnfecteerde cellen in proliferative medium met 2 microgram per milliliter doxycycline. Breng cellen naar de couveuse en laat ze gedurende 2 dagen op 37 graden.Na 2 dagen moeten de twee subpools verschijnen als suspensies van kleine neurosferen. Homogeen uitdrukken van de rode fluorescerende eiwit, of niet. Na de engineering van precursoren, stel een beoordeling array voor de transplantatie in P0 witte lab pups.Gebruik de borosilicaat glazen haarvaten met een eeuwige en interne diameter van respectievelijk 1,5 millimeter en 1,12 millimeter. Trek de capillaire met een P1000 trekker. Voer eerst het trekprogramma in.Ten tweede, plaats de capillaire in de houders en draai ze aan. Ten derde, start het programma en neem de twee getrokken microcapillaries. Snijd de capillaire punt, met de hand met een scalpel, onder de stereomicroscoop om een tip met een uitwendige diameter van 200-250 micrometer te verkrijgen.Tot slot, plaats de haarvaten op de plasticine steun in een gesloten petrischaal, en breng het onder de motorkap. Ontsmet optische vezels en leg ze onder de motorkap. Meng de EGTA en Fast Green master mixen, om de cel tracer oplossing voor te bereiden, en plaats het opnieuw onder de motorkap.Snijd kleine stukjes laboratorium afdichting film voor cel suspensie spotting. En tot slot, bereid een oplossing van 1 milligram per milliliter steriele doxycycline verwijderd in een 0,3 milliliter spuit. De injectiebuis wordt bereid uit twee latexbuizen.Bevestig een harde plastic mond stuk aan het ene uiteinde van een latex buis. Bevestig vervolgens de capillaire houder aan het ene uiteinde van de andere latexbuis. Sluit de vrije uiteinden van de twee latexbuizen aan van een 0,45 micrometer steriel filter, als barrière tegen operatorkiemen.Plaats de resulterende aspiratorbuisassemblage op een plasticinehouder die onder de motorkap moet worden gehouden. Verzamel, test en controleer neurosferen in afzonderlijke buizen. Centrifuge neurosfeer suspensies en vervang de supernatant door PBS.Herhaal deze reeks nog twee keer. Centrifuge neurosfeer suspensies, vervang de supernatant door trypsine oplossing, en pipette de cel pellet op en neer, 4, 5 keer. Laat cellen in de couveuse voor vijf minuten om een enkele cel suspensie te krijgen.Blokkeer trypsine met trypsine remmer oplossing. Centrifuge cellen, en opnieuw op te schorten in verse proliferative medium. Tel cellen van de twee zwembaden en pas hun concentratie aan op 100.000 cellen per microliter, in proliferative medium.Meng vervolgens de test- en besturingscellen 1:1 en controleer de resulterende mix onder een fluorescentiemicroscoop. Tot slot, plaats de mix op ijs onder de motorkap. Bereid de kooi met de moeder en de pups op een tafel ver weg van de chirurgische operatory gebied.Plaats een herstelkooi op een kar. Doe een mengsel van zaagsel uit de kooi van de moeder op de bodem, en plaats de herstelkooi onder een lamp. Zet terzijde, zet een ijsdoos bedekt met een aluminiumfolie voor de anesthesie van de P0 pups.Vlak voor de transplantatie, voeg een 1 tot 10 volume van cel tracer oplossing aan een volume van de cel suspensie, en ter plaatse drie microliters van de resulterende mix op een stuk van laboratorium afdichting film. Plaats de pup op de koele, aluminiumfolie voor een minuut, en controleer of het volledig verdoofd. Ondertussen, aspirate de 3 microliters van injectie mix in het glas capillair.Veeg voorzichtig het hoofd van de verdoofde pup af met 70% ethanol. Zoek het vervolgens op de optische vezel, om de corticale hemisferen duidelijk te identificeren. Voer de capillaire in de voorkant en toegang tot de ventriculaire holte.Terwijl u dat doet, let dan niet op schade aan bloedvaten. Om schade van ganglionic eminentie te voorkomen, draai de naald lateraal door dertig graden. Injecteer de cellen voorzichtig in de holte en controleer de verspreiding ervan door middel van Fast Green.Wacht vijf tot tien seconden. Verwijder de glazen naald, waarbij u ervoor zorgt dat de celsuspensie niet wordt aangezogen en in een geschikte afvalbak wordt weggegooid. Voor het herstel van de pup van anesthesie, injecteer 150 microliters doxy oplossing intraperitoneally, om transgene expressie nog steeds af te houden na de transplantatie.Plaats de pups na de injectie onmiddellijk onder de lamp voor herstel. Laat de pups daar voor vijf tot tien minuten, en zodra ze volledig wakker zijn, plaats ze in de kooi met de moeder. Let op de geopereerde pups gedurende twee tot drie uur, om ervoor te zorgen dat de moeder ze accepteert.Voorslever de kooi van drinkwater met 0,5 mg/mL doxycyclie en sacharose, om de transgene uitdrukking af te houden. Vervang de doxycycline die water bevat vier dagen na transplantatie door doxyvrij water. Zo activeert het trans-gen in postmitotische neuronen.Houd muizen zes dagen lang in een doxy-vrij regime en euthanaseer ze op P10. Fix hersenen van geëuthanaseerde pups in 4%PFA, op vier graden, 's nachts. Verwijder de PFA-oplossing en vervang deze door een 30%sucrose-oplossing.Laat de hersenen op vier graden totdat ze zinken naar de flacon bodem. Breng de hersenen in een wegwerp inbedding schimmel ongeveer de helft gevuld met cryo-inclusion medium. Bevries de opgenomen hersenen op 80 graden.Snijd 60 micron dikke coronale secties met behulp van een cryostat. Processecties voor anti-GFP, anti-RFP immunofluorescentie en tegensperd met DAPI oplossing. Stel de werkparameters van de confocale microscoop op de juiste manier in, zoals afgebeeld.Verzamel foto's van immunoassayed plakjes, het selecteren van GFP positieve neuron-rijke fotografische velden blind van RFP signaal distributie. Exporteer de afbeeldingen als ND2-bestanden en genereer maximale z-projecties van deze bestanden als TIFF-bestanden. Om latere neuron skeletonization blind van celgenotype mogelijk te maken, verbergt u het rode signaal.Voeg hiervoor een aanpassingslaag toe. Selecteer niveaus, selecteer rood. Stel de uitvoer in op nul.En sla het bestand als zodanig op. Skeletonization wordt vervolgens uitgevoerd door een nieuwe operator, die geen eerdere toegang had tot originele gewone rode bestanden. Open voor elk verborgen rood bestand het bestand, voeg een tekenlaag toe aan de primaire afbeelding en selecteer het potloodgereedschap.Traceer de somer op basis van GFP signaal. Zoek dan de neurites. Sla ten slotte het mutlilayer-bestand op, inclusief neuronale silhouetten.Latere analyse van neuronale skeletten kan worden uitgevoerd door beide operatoren. Open elk mulitlayer-bestand en maak nieuwe lege 16-bits grijswaardenbestanden met een zwarte achtergrond. Eén per neuron.Kopieer en plak enkele neuronale silhouetten, van de primaire afbeelding tot de grijswaardenbestanden. Ga terug naar het meerlaagse bestand en schakel de aanpassingslaag uit om neuronale genotypen te onthullen. Sla de 16-bits grijswaardenbestanden op en notatie van de bijbehorende neurongenogen.Importeer grijswaardenafbeeldingen één voor één in ImageJ en analyseer skeletten van NeurphologyJ-plug-in. Verzamel geselecteerde primaire neurophologyJ-gegevens, het totale gebied van de neuritelengte, de bevestigingspunten en de eindpunten, in een spreadsheet en gebruik ze om secundaire morfometrische parameters te berekenen. Het engineering protocol dat wij voorstellen maakt het mogelijk om de overgrote meerderheid van de neuronen onderwerp van onderzoek cotransduce, met de beoogde transgenes sets.Bovendien maakt het mogelijk om een aanzienlijke homogeniteit van transgene expressieniveaus binnen de getransduceerde celpopulatie te bereiken. Een belangrijk kenmerk van onze procedure, is het gekoppelde configuratie. Een test en een controle voorloper pool zijn afzonderlijk ontworpen, gemengd 1:1, en uiteindelijk co-getransplanteerd.Deze gekoppelde aanpak zal de detectie van resultatenverschillen die specifiek verband houden met verschillende genotypen vergemakkelijken. In dit voorbeeld analyseerden we coronale secties van getransplanteerde pups, tien dagen na de interventriculaire co-injectie van Foxg1 over-uitdrukken neuron precursoren en controle degenen. Beelden van groepen neuronen werden verworven met confocale microscopie.Z-stack bestanden werden gebruikt om maximale projecties te berekenen. Neuronale silhouetten werden handmatig getraceerd. Hier, groene en gele silhouetten vertegenwoordigen Foxg1 over-uitdrukken en controle neuronen, respectievelijk.Ten slotte werden primaire parameters verkregen door NeurphologyJ-analyse gebruikt voor de berekening van secundaire morfometrische indexcijfers, zoals geïllustreerd. Dit is een eenvoudig protocol dat de onderzoeker in staat stelt om de impact die de gemengde expressie van een bepaald gen te evalueren, kan uitoefenen op fijne controle van de neuriet ontwikkeling darth in vivo. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn twee.Bestaand aantal genen die betrokken zijn bij neuronale morfogenese kan functioneel worden gekarakteriseerd in vivo, bij afwezigheid van de overeenkomstige teratogene lijnen. En er zijn minder dieren nodig voor de analyse om de significante statistische resultaten te krijgen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...