Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Nous remercions Mihn Duc Do pour sa contribution à la mise en place précoce de cette procédure.

Toutes les méthodes et procédures décrites ici ont été approuvées par le SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Génération de piscines d'ancêtres « vertes » d'ingénierie
<ol><li>Préparation de la piscine « verte »
	<ol>
<li>Mate une femelle CD1 de type sauvage avec un fondateur MtaptEGFP / 16. Euthanasier la mère enceinte par luxation cervicale à 12,5 jours après le coitum (le jour 0 est ...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Les aspects/étapes spécifiques de cette procédure sont essentiels et nécessitent une attention particulière. Premièrement, a) les opérateurs doivent être suffisamment préformés pour manipuler en toute sécurité les lentivirus dans un environnement de laboratoire conforme au BSL-2. Deuxièmement, b) avant de mélanger les préparations neuronales « test » et « contrôle », il est obligatoire de laver soigneusement les deux suspensions de neurosphère correspondantes telles que décrites, afin d'éviter tout...

Ici nous décrivons une méthode simple que nous avons développée pour disséquer le contrôle in vivo de gène de cytoarchitecture neuronale. Basé sur l'ingénierie in vitro des précurseurs neuronaux, leur transplantation dans le cerveau néonatal et l'évaluation morphométrique couplée des cellules « d'essai » et de « contrôle », il permet de dévoiler des implications fonctionnelles des gènes de test dans le contrôle fin de la morphologie neuronale dans un moyen rapide et abordable. Pour étudier le contrôle in vivo des gènes de l'architecture neuronale, trois questions techniques clés doivent être abordées : (1) la réalisation d'une expression de gène d'intérêt (GOI) correctement modelée et un contrôle quantitatif précis de celui-ci; (2) obtenir une visualisation correctement segmentée des silhouettes neuronales distinctes; (3) obtenir une signification statistique des résultats tout en employant un nombre limité d'animaux.
Lorsqu'elles sont disponibles, les lignées mutantes de souris abritant des transgènes contrôlés par la tétracycline (tet) peuvent être le meilleur outil pour aborder le premier numéro1. Alternativement, la transgenèse somatique peut être employée. Dans de tels cas, le transgène est délivré par électroporation2 ou transduction virale3. Ensuite, il est conservé comme épisome (par exemple, lors de l'électroporation standard4), ou il est intégré dans le génome (au hasard, via l'intégrase rétrovirale5;ou dans un endroit défini, via CRISPR-promouvoir recombinaison homologue (SLENDR)6 ).
Deuxièmement, la visualisation neuronale de la silhouette peut être réalisée par (a) l'étiquetage uniforme clairsemé ou (b) l'étiquetage différentiel dense. En ce qui concerne l'étiquetage clairsemé, des méthodologies avancées de golgi peuvent être employées7, certains minisets neuronaux peuvent être remplis par la biocytine8, et l'étiquetage sel et poivre peut être obtenu grâce à un transgène peu exprimé. Un tel transgène peut afficher une transcription variée (Thy-EGFP)9 ou peut être activé par recombinaison stochastique (MORF)10. En ce qui concerne (b), les stratégies de pointe comprennent la recombinaison stochastique à médiation C au sein d'un réseau de transgènes de fluoroprotéines multi-floxed (Brainbow)11, ainsi que l'intégration génomique de gènes fluoroprotéines par la transpolation de piggyBac-transposase, précédemment par transgenèse somatique (CLoNE)12.
En ce qui concerne le troisième problème, le résultat morphométrique est souvent affecté par une grande variabilité aléatoire, provenant de différences inter-animaux et les contingences d'injection cellulaire. Pour cette raison, un grand nombre d'animaux est généralement utilisé pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour évaluer l'activité morphométrique GOI.
Les approches décrites précédemment reposent souvent sur des compétences techniques avancées et nécessitent des ressources financières remarquables, ce qui peut limiter leur diffusion au sein de la communauté scientifique. Pour contourner ces problèmes, nous avons conçu un pipeline simple et facile pour disséquer le contrôle génétique de la neuroarchitecture in vivo d'une manière rapide et abordable. Ceci est inspiré par une conception similaire de co-transplantation précédemment développée pour l'évaluation in vivo rapide de l'activité de transgène antiblastique13.
Plus précisément, on pense que la co-transplantation de précurseurs neuronaux « verts » in vitro (« cellules de test » et de « contrôle ») dans un cerveau néonatal « noir » peut simultanément corriger les trois questions clés énumérées ci-dessus. En fait, l'ingénierie lentivirale in vitro de précurseurs, dans des conditions bien contrôlées, permet le maintien de la variabilité de l'expression transgène neuronale au minimum, bien en dessous de celle habituellement associée à des manipulations somatiques in vivo (effectuées précédemment 14 (en) , 15 et dans nos résultats inédits). Le contrôle précis de l'expression des gènes qui en résulte est comparable à celui obtenu par des modèles transgéniques contrôlés par les tets. Cependant, les coûts de cette procédure sont bien inférieurs à ceux provenant de l'entretien d'une ligne de souris transgénique. Ensuite, l'injection de cellules à main levée est facile et nécessite une formation minimale. En outre, la quantité de précurseurs étiquetés injectés dans chaque cerveau peut être facilement réglée pour atteindre un nombre cumulatif suffisant de précurseurs peu distribués, tout en maintenant le nombre total d'animaux transplantés à un minimum. Enfin, la co-injection de précurseurs pseudoo-étiquetés différemment, « testés » et « témoins » et l'analyse statistique par paire s'ensuit des résultats contrecarrent les effets de la variabilité expérimentale interanimale, permettant d'atteindre l'importance statistique des résultats, même sur l'analyse d'un nombre limité d'individus13.
Il convient de souligner que, bien que rapide et bon marché, cette méthode a deux principales limites. Tout d'abord, il est conçu pour étudier le contrôle des gènes autonomes cellulaires de l'architecture neuronale, et il n'est pas approprié de s'attaquer au contrôle de l'environnement. Deuxièmement, comme les précurseurs neuronaux transplantés atteignent leur emplacement final par un calendrier hétérochronique, cette méthode est préférable au contrôle neuroarchitectonique modèle se produisant après l'achèvement de migration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Le contrôle génique de la cytoarchitecture neuronale fait actuellement l'objet d'une enquête intensive. Décrit ici est une méthode simple développée pour étudier le contrôle in vivo de gène de la morphologie néocortical de neurone de projection. Cette méthode est basée sur (1) l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux comme cellules « d'essai » et de « contrôle », (2) leur co-transplantation dans les cerveaux sauvages-type, et (3) l'évaluation morphométrique paire de leurs dérivés neuronaux. Plus précisément, des précurseurs pallial E12.5 provenant de donneurs panneuronaux, génétiquement étiquetés, sont utilisés à cette fin. Ils sont conçus pour tirer parti de certains promoteurs et de la technologie tetON/OFF, et ils sont transplantés à la main libre dans des ventricules latéraux néonatals. Plus tard, sur le profilage d'immunofluorescence des cerveaux receveurs, des silhouettes des neurones transplantés sont introduites dans le logiciel open source NeurphologyJ, leurs paramètres morphométriques sont extraits, et la longueur moyenne et l'index de ramification sont calculés. Comparé à d'autres méthodes, celle-ci offre trois avantages principaux : elle permet la réalisation d'un contrôle fin de l'expression transgène à des coûts abordables, elle ne nécessite que des compétences chirurgicales de base, et elle fournit des résultats statistiquement fiables sur analyse d'une nombre d'animaux. En raison de sa conception, cependant, il n'est pas suffisant pour aborder le contrôle non cellulaire-autonome de la neuroarchitecture. En outre, il devrait être de préférence employé pour étudier le contrôle de morphologie neurite après l'achèvement de la migration neuronale. Dans sa formulation actuelle, cette méthode est exquisement accordée pour étudier le contrôle génique de l'architecture néocortical de neurone glutamatergic. Profitant des lignées transgéniques exprimant l'EGFP dans d'autres types spécifiques de cellules neurales, il peut être réconçu pour aborder le contrôle génétique de leur architecture.

Il existe cinq ensembles de données primaires fournissant des informations utiles sur les aspects clés de la procédure, le premier étant (1) l'efficacité de la transduction des précurseurs neuronaux et la co-transduction par les vecteurs lentiviraux. (2) Exemple des principales caractéristiques des promoteurs employés pour piloter le « gène d'essai ». (3) Exemple de cellules modifiées prêtes à être rectifiées. (4) Un dessin animé comprenant les détails procéduraux princ...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Basée sur l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux, leur co-transplantation dans des cerveaux de type sauvage et l'évaluation morphométrique appariée des dérivés « test » et « contrôle », cette méthode permet une modélisation précise du contrôle des gènes in vivo du néocortical morphologie neuronale d'une manière simple et abordable.

Transplantation intraventriculaire de précurseurs neuronaux artificiels pour les études de neuroarchitecture In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

L’objectif global de cette technique est l’évaluation de l’effet des manipulations d’expression génétique sur l’architecture neuronale corticale in vivo. Notre premier avantage clé de cette procédure par rapport à ceux basés sur une électroporation neutre, est le contrôle fin des niveaux d’expression des gènes. Plus précisément, ce pipeline intégré permet l’évaluation in vivo du défaut, exalté par de petits changements dans l’expression des gènes sur le contrôle de la cytoarchitecture neuronale.En outre, la structure de paire du test de transplantation permet une réduction énorme du nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. La technique tire parti d’un bassin précurseur provenant d’embryons transgéniques Tau EGFP. Ce pool est subdivisé en deux sous-piscines qui sont alternativement infectées par deux mélanges lentiviraux.Pour obtenir une piscine d’essai verte et un pool de contrôle jaune qui sera co-injecté. Après deux jours d’expansion in vitro, les sphères neuro résultantes sont dissociées, mélangées une à une, et injectées avec un capillaire dans l’espace ventriculaire de souris. Dix jours plus tard, l’immunofluorescence sur les sections coronaires est effectuée pour permettre la comparaison entre les neurones d’essai et de contrôle.Enfin, les sections immunotachées sont imaged et squelettées pour l’évaluation finale des paramètres morphométriques. Avant la transplantation in vivo, préparer la piscine verte précurseur. Les embryons E12.5, récoltés à partir d’une mère enceinte précédemment agenquée à un fondateur de Tau EGFP, sont mis dans des puits individuels d’une plaque multi-puits dans la solution PBS.Génotypez-les rapidement par inspection visuelle sous une lampe à lumière bleue. Dissocier les cortices verts disséqués en cellules individuelles. Re-suspendre les cellules dans le milieu proliférant, et les subdiviser en deux sous-pools de taille égale.Infecter chaque sous-piscine avec un mélange de lentiviral dédié. Chaque mélange contient le virus rouge d’étiquette ou le virus noir de commande. Ainsi que les virus pour tet-off conduit transgène ou l’expression de contrôle, respectivement.Chaque lentivirus doit être administré à la multiplicité de l’infection de 8. Plaquez les cellules infectées dans le milieu proliférant avec 2 microgrammes par millilitre de doxycycline. Transférer les cellules à l’incubateur et les laisser pendant 2 jours à 37 degrés.Après 2 jours, les deux sous-piscines doivent apparaître comme des suspensions de petites neurosphères. Exprimant homogènement la protéine fluorescente rouge, ou non. Après l’ingénierie des précurseurs, établissez un tableau d’évaluation pour la transplantation chez les chiots de laboratoire blancs P0.Utilisez les capillaires en verre borosilicate avec un diamètre éternel et interne égal à 1,5 millimètre et 1,12 millimètres, respectivement. Tirez le capillaire avec un pull P1000. Tout d’abord, entrez dans le programme de traction.Deuxièmement, placez le capillaire dans les porte-porte et serrez-les. Troisièmement, commencer le programme et prendre les deux microcapillaires tirés. Couper la pointe capillaire, à la main avec un scalpel, sous le stéréomicroscope pour obtenir une pointe avec un diamètre externe de 200-250 micromètres.Enfin, placez les capillaires sur le support en plasticine dans une boîte de Pétri fermée, et transférez-le sous le capot. Désinfectez les fibres optiques et placez-les sous le capot. Mélangez les mélanges maître EGTA et Fast Green, pour préparer la solution de traceur cellulaire, et placez-la à nouveau sous le capot.Couper de petits morceaux de film d’étanchéité de laboratoire pour repérer la suspension cellulaire. Enfin, préparez une solution de 1 milligramme par millilitre de doxycycline stérile disposée dans une seringue de 0,3 millilitre. Le tube d’injection est préparé à partir de deux tubes de latex.Fixer un morceau de bouche en plastique dur à une extrémité d’un tube de latex. Ensuite, fixez le support capillaire à une extrémité de l’autre tube de latex. Connectez les extrémités libres des deux tubes de latex à partir d’un filtre stérile de 0,45 micromètre, comme barrière contre les germes de l’opérateur.Placez l’assemblage du tube aspirateur qui en résulte sur un support en plasticine à garder sous le capot. Recueillir, tester et contrôler les neurosphères dans des tubes séparés. Centrifugeuse suspensions neurosphère et remplacer le supernatant par PBS.Répétez cette séquence deux fois de plus. Suspensions de neurosphère de centrifugeuse, remplacent le supernatant par la solution de trypsine, et pipette la pastille de cellules de haut en bas, 4, 5 fois. Laissez les cellules dans l’incubateur pendant cinq minutes pour obtenir une suspension à cellule unique.Bloquer la trypsine avec la solution inhibiteur de la trypsine. Cellules centrifugeuses, et les suspendre à nouveau dans un milieu proliférant frais. Comptez les cellules des deux piscines et ajustez leur concentration à 100 000 cellules par microlitre, dans un milieu proliférant.Ensuite, mélangez les cellules d’essai et de contrôle 1:1 et vérifiez le mélange qui en résulte au microscope à fluorescence. Enfin, placez le mélange sur la glace sous le capot. Préparer la cage avec la mère et les chiots sur une table loin de la zone d’opérateur chirurgical.Placez une cage de récupération sur un chariot. Placez un mélange de sciure de bois prélevé dans la cage de la mère sur son fond et placez la cage de récupération sous une lampe. De côté, mettre une glaciation recouverte d’une feuille d’aluminium pour l’anesthésie des chiots P0.Juste avant la transplantation, ajouter un volume de 1 à 10 volume de solution de traceur cellulaire à un volume de suspension cellulaire, et repérer trois microlitres du mélange résultant sur un morceau de film d’étanchéité de laboratoire. Placez le chiot sur le papier d’aluminium frais pendant une minute, et vérifiez qu’il est entièrement anesthésié. Pendant ce temps, aspirer les 3 microlitres de mélange d’injection dans le verre capillaire.Essuyer délicatement la tête du chiot anesthésié avec 70 % d’éthanol. Ensuite, localisez-le sur la fibre optique, pour identifier clairement les hémisphères corticals. Entrez le capillaire à l’avant et accédez à la cavité ventriculaire.Tout en faisant cela, faites attention à ne pas endommager les vaisseaux sanguins. Pour éviter les dommages causés par l’éminence ganglionnaire, faites pivoter l’aiguille latéralement de trente degrés. Injectez doucement les cellules dans la cavité et surveillez leur diffusion au moyen de Fast Green.Attendez cinq à dix secondes. Retirez l’aiguille en verre, en prenant soin de ne pas aspirer la suspension cellulaire et jetez-la dans un bac d’élimination approprié. Avant le rétablissement de chiot de l’anesthésie, injectez 150 microlitres de solution doxy intraperitoneally, pour maintenir l’expression transgénique encore éteinte après la transplantation.Après l’injection, placez les chiots immédiatement sous la lampe pour la récupération. Laissez les chiots là pendant cinq à dix minutes, et une fois qu’ils sont complètement éveillés, placez-les dans la cage avec la mère. Observez les chiots opérés pendant deux à trois heures, pour s’assurer que la mère les accepte.Fournir à la cage de l’eau potable contenant de la doxycycline et du saccharose de 0,5 mg/mL, afin de maintenir l’expression transgénique. Remplacer la doxycycline contenant de l’eau par de l’eau sans quatre jours après la transplantation. Activant ainsi le transgénique dans les neurones postmitotic.Gardez les souris dans un régime sansoxy pendant six jours, et euthanasiez-les à P10. Fixer le cerveau des chiots euthanasiés dans 4%PFA, à quatre degrés, pendant la nuit. Retirez la solution PFA et remplacez-la par une solution de saccharose à 30 %.Laissez le cerveau à quatre degrés jusqu’à ce qu’ils descendent vers le fond du flacon. Transférer les cerveaux dans un moule d’intégration jetable environ la moitié rempli de cryo-inclusion moyen. Congeler le cerveau inclus à 80 degrés.Couper 60 microns de sections coronal épaisses à l’aide d’un cryostat. Les sections de processus pour l’anti-GFP, l’immunofluorescence anti-DP et les contre-taches avec la solution DAPI. Définissez les paramètres de fonctionnement du microscope confocal de manière appropriée, comme indiqué.Recueillir des photos de tranches immunoassayed, en sélectionnant GFP positif neurone riche champs photographiques aveugles de la distribution du signal DP. Exportez les images sous forme de fichiers ND2 et générez des projections z maximales d’entre elles sous forme de fichiers TIFF. Pour permettre la squelettisation neuronale ultérieure aveugle du génotype cellulaire, cachez le signal rouge.Pour ce faire, ajoutez une couche d’ajustement. Sélectionnez les niveaux, sélectionnez rouge. Réglez la sortie à zéro.Et enregistrer le fichier en tant que tel. La skeletonisation est ensuite effectuée par un nouvel opérateur, qui n’avait pas auparavant accès aux fichiers rouges ordinaires originaux. Pour chaque fichier rouge caché, ouvrez le fichier, ajoutez une couche de dessin à l’image principale et sélectionnez l’outil crayon.Tracez le somer sur la base du signal GFP. Puis, tracez les neurites. Enfin, enregistrez le fichier mutlilayer, y compris les silhouettes neuronales.L’analyse ultérieure des squelettes neuronaux peut être effectuée par l’un ou l’autre opérateur. Ouvrez chaque fichier mulitlayer, créez de nouveaux fichiers gris vides de 16 bits avec fond noir. Un par neurone.Copiez et coller des silhouettes neuronales simples, de l’image primaire aux fichiers à échelle grise. Revenez au fichier multicouche et éteignez la couche d’ajustement pour dévoiler les génotypes neuronaux. Enregistrez les fichiers gris 16 bits, en annotant les génotypes neuronaux correspondants.Importer des images à échelle grise dans ImageJ une par une, et analyser les squelettes par NeurphologyJ plugin. Recueillir des données primaires neurophologyJ sélectionnées, une superficie totale de longueur de neurite, des points de fixation et des points d’extrémité, dans une feuille de calcul, et les utiliser pour calculer les paramètres morphométriques secondaires. Le protocole d’ingénierie que nous proposons permet de cotransduire la grande majorité des neurones sujets d’investigation, avec les ensembles transgènes prévus.En outre, il permet d’atteindre une homogénéité substantielle des niveaux d’expression transgénique au sein de la population cellulaire transduced. Une caractéristique clé de notre procédure, c’est sa configuration jumelée. Un test et un pool de précurseurs de contrôle sont conçus séparément, mélangés 1:1, et finalement co-transplantés.Cette approche jumelée facilitera la détection des différences de résultats spécifiquement liées à des génotypes distincts. Dans cet exemple, nous avons analysé des sections coronaires de chiots transplantés, dix jours après la co-injection intertriculaire des précurseurs et des précurseurs de neurones sur-exprimants de Foxg1 et des précurseurs de contrôle. Des images de groupes de neurones ont été acquises avec la microscopie confocale.Les fichiers Z-stack ont été utilisés pour calculer des projections maximales. Des silhouettes neuronales ont été tracées manuellement. Ici, les silhouettes vertes et jaunes représentent foxg1 sur-exprimant et contrôler les neurones, respectivement.Enfin, les paramètres primaires obtenus par l’analyse NeurphologyJ, ont été utilisés pour le calcul des indices morphométriques secondaires, comme illustré. Il s’agit d’un protocole simple qui permet au chercheur d’évaluer l’impact que l’expression mixte d’un gène donné, peut exercer sur le contrôle fin du développement de neuritearth in vivo. Les principaux avantages de ce protocole sont deux.Le nombre existant de gènes impliqués dans la morphogenèse neuronale peut être fonctionnellement caractérisé in vivo, en l’absence des lignes tératogènes correspondantes. Et moins d’animaux sont nécessaires pour l’analyse pour obtenir les résultats statistiques significatifs.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Unicellulaire profil d&#39;expression génique utilisant FACS et qPCR avec les normes internes

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Recherche

Génétique

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

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Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

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