Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Wir danken Mihn Duc Do für seinen Beitrag zur frühzeitigen Einrichtung dieses Verfahrens.

Alle hier beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC) zugelassen.
1. Erzeugung von "grünen" Vorläuferpools
<ol><li>Vorbereitung des "grünen" Pools
	<ol>
<li>Mate eine wilde CD1 Hündin mit einem MtaptEGFP/+ Gründer16. Euthanisieren Sie die schwangere Mutter durch Zervixdislokation bei 12,5 Tagen nach dem Koitum (Tag 0 wird durch vaginale Steckerinspektion bestimmt...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Spezifische Aspekte/Schritte dieses Verfahrens sind von entscheidender Bedeutung und erfordern besondere Aufmerksamkeit. Erstens müssen (a) die Bediener ausreichend vortrainiert sein, um Lentiviren in einer BSL-2-kompatiblen Laborumgebung sicher zu manipulieren. Zweitens, b) vor dem Mischen von "Test" und "Kontrolle" neuronaler Präparate ist es obligatorisch, die beiden entsprechenden Neurosphärensuspensionen wie beschrieben sorgfältig zu waschen, um eine verzögerte Kreuzinfektion der beiden Präparate aufgrund uner...

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die wir entwickelt haben, um die in vivo Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur zu sezieren. Basierend auf in vitro Engineering von neuronalen Vorläufern, ihre Transplantation in neonatale Gehirn und gepaart morphometrische Bewertung von "Test" und "Kontroll" Zellen, ermöglicht es, funktionelle Auswirkungen von Testgenen in der feinen Kontrolle der neuronalen Morphologie in einem schnell und erschwinglich. Um die In-vivo-Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, müssen drei wichtige technische Fragen angegangen werden: (1) Die Erreichung einer angemessen gemusterten Gen-of-Interest-Expression (GOI) und eine genaue quantitative Kontrolle dieser Expression; (2) Eine korrekt segmentierte Visualisierung unterschiedlicher neuronaler Silhouetten zu erhalten; (3) Statistische Signifikanz der Ergebnisse bei der Verwendung einer begrenzten Anzahl von Tieren.
Wenn verfügbar, können Maus-Mutantenlinien, die Tetracyclin (tet)-gesteuerte Transgene beherbergen, das beste Werkzeug sein, um das erste Problem zu beheben1. Alternativ kann eine somatische Transgenese eingesetzt werden. In solchen Fällen wird das Transgen über Elektroporation2 oder virale Transduktion3geliefert. Als nächstes wird es als Episom (z.B. bei Standardelektroporation4) beibehalten oder in das Genom integriert (zufällig über retrovirale Integrase5; oder an einem definierten Ort, über CRISPR-geförderte homologe Rekombination (SLENDR)6 ).
Zweitens kann die neuronale Silhouettenvisualisierung durch (a) eine spärliche einheitliche Kennzeichnung oder (b) dichte Differentialbeschriftung erreicht werden. Wie für die spärliche Etikettierung können fortschrittliche Golgi-ähnliche Methoden verwendet werden7, ausgewählte neuronale Minisets können mit Biocytin8gefüllt werden, und Salz-und-Pfeffer-Etikettierung kann dank einer spärlich exprimierenden Transgene erhalten werden. Ein solches Transgen kann eine bunte Transkription (Thy-EGFP)9 aufweisen oder durch stochastische Rekombination (MORF) aktiviert werden10. Was (b) betrifft, so umfassen die modernsten Strategien die cre-vermittelte stochastische Rekombination innerhalb eines multi-floxierten Fluorprotein-Transgen-Arrays (Brainbow)11, sowie die piggyBac-transposase-getriebene genomische Integration von Fluorproteingenen, über somatische Transgenese (CLoNE)12geliefert.
Was die dritte Ausgabe betrifft, so wird das morphometrische Ergebnis häufig durch eine große zufällige Variabilität beeinflusst, die auf Unterschiede zwischen den Tieren und Zellinjektionskontingenten beruht. Aus diesem Grund wird in der Regel eine große Anzahl von Tieren eingesetzt, um die statistische Leistung zu erreichen, die für die Bewertung der morphometrischen Aktivität der ausländischen Aktivitäten erforderlich ist.
Die zuvor beschriebenen Ansätze beruhen häufig auf fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten und erfordern auffällige finanzielle Ressourcen, die ihre Verbreitung innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft einschränken können. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine einfache und einfache Pipeline konzipiert, um die Genkontrolle der Neuroarchitektur in vivo schnell und erschwinglich zu sezieren. Dies ist inspiriert von einem ähnlichen Co-Transplantations-Design, das zuvor für die schnelle in vivo-Bewertung der antiblastischen Transgenaktivität13entwickelt wurde.
Insbesondere wird angenommen, dass die Co-Transplantation von in vitro entwickelten "grünen" neuronalen Vorläufern ("Test"- und "Kontrollzellen") in ein "schwarzes" neonatales Gehirn gleichzeitig die drei oben aufgeführten Schlüsselprobleme beheben kann. Tatsächlich ermöglicht die in vitro lentivirale Entwicklung von Vorläufern unter gut kontrollierten Bedingungen die Aufrechterhaltung der Variabilität der neuronalen Transgenexpression auf ein Minimum, weit unter dem, das normalerweise mit in vivo somatischen Manipulationen verbunden ist (zuvor durchgeführt 14 , 15 und in unseren unveröffentlichten Ergebnissen). Die daraus resultierende genaue Kontrolle der Genexpression ist vergleichbar mit der von tet-kontrollierten transgenen Modellen. Die Kosten dieses Verfahrens liegen jedoch weit unter denen, die aus der Wartung einer transgenen Mauslinie stammen. Als nächstes ist die Freihandinjektion einfach und erfordert minimales Training. Darüber hinaus kann die Menge der in jedes Gehirn injizierten markierten Vorläufer leicht darauf abgestimmt werden, eine ausreichende kumulative Anzahl von dünn verteilten Vorläufern zu erreichen, während gleichzeitig die Gesamtzahl der transplantierten Tiere auf ein Minimum beschränkt bleibt. Last but not least wirken die Co-Injektion unterschiedlich fluormarkierter, "test" und "kontrollierter" Vorläufer und die anschließende paarweise statistische Analyse der Ergebnisse den Auswirkungen der versuchsweisen Variabilität zwischen Dentieren entgegen, die das Erreichen von statistische Signifikanz der Ergebnisse, auch nach der Analyse einer begrenzten Anzahl von Personen13.
Es sollte betont werden, dass diese Methode, wenn auch schnell und billig, zwei Hauptbeschränkungen hat. Erstens wurde es entwickelt, um die zellautonome Genkontrolle der neuronalen Architektur zu untersuchen, und es ist nicht angemessen, sich mit der Umweltkontrolle zu befassen. Zweitens ist diese Methode, da transplantierte neuronale Vorläufer durch einen heterochronischen Zeitplan ihren endgültigen Standort erreichen, dem Modell der neuroarchitektonischen Kontrolle nach der Migration vorzuziehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
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intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Die Genkontrolle der neuronalen Zytoarchitektur wird derzeit intensiv untersucht. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um die in vivo Genkontrolle der neokortikalen Projektionsneuronenmorphologie zu untersuchen. Diese Methode basiert auf (1) in vitro lentiviralen Engineering sernischen Vorläufern als "Test"- und "Kontrollzellen", (2) ihrer Co-Transplantation in Wild-Gehirne und (3) gepaarter morphometrischer Auswertung ihrer neuronalen Derivate. Konkret werden dafür E12.5 palliale Vorläufer von panneuronalen, genetisch gekennzeichneten Spendern eingesetzt. Sie sind so konzipiert, dass sie ausgewählte Promotoren und tetON/OFF-Technologie nutzen, und sie werden freihändig in neonatale Querventrikel transplantiert. Später, nach der Immunfluoreszenzprofilierung von Empfängergehirnen, werden Silhouetten transplantierter Neuronen in NeurphologyJ Open Source Software eingespeist, ihre morphometrischen Parameter extrahiert und die durchschnittliche Länge und der Verzweigungsindex berechnet. Im Vergleich zu anderen Methoden bietet diese drei Hauptvorteile: Sie ermöglicht die Erzielung einer feinen Kontrolle der Transgenexpression zu erschwinglichen Kosten, sie erfordert nur grundlegende chirurgische Fähigkeiten und liefert statistisch zuverlässige Ergebnisse bei der Analyse einer begrenzten Anzahl der Tiere. Aufgrund seines Designs reicht es jedoch nicht aus, die nicht zellautonome Kontrolle der Neuroarchitektur zu adressieren. Darüber hinaus sollte es vorzugsweise verwendet werden, um die Kontrolle der Neuritenmorphologie nach Abschluss der neuronalen Migration zu untersuchen. In ihrer gegenwärtigen Formulierung ist diese Methode exquisit abgestimmt, um die Genkontrolle der glutamatergen neokortikalen Neuronenarchitektur zu untersuchen. Unter Ausnutzung transgener Linien, die EGFP in anderen spezifischen neuronalen Zelltypen exemiten, kann es umfunktioniert werden, um die Genkontrolle ihrer Architektur zu adressieren.

Es gibt fünf primäre Datensätze, die nützliche Informationen über schlüsselwichtige Aspekte des Verfahrens liefern, wobei der erste (1) die Effizienz der transdiven Neuronater-Vorläufertransduktion und Co-Transduktion durch lentivirale Vektoren ist. (2) Ein Beispiel für die wichtigsten Merkmale der Promotor, die für den Antrieb des "Testgens" eingesetzt werden. (3) Ein Beispiel für vermehrt transplantierte technische Zellen. (4) Eine Karikatur mit wichtigen Verfahrensdetails der...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Bewertung der Auswirkungen von Genexpressionsmanipulationen auf kortikale neuronale Architektur in vivo. Unser erster hauptentscheidender Vorteil dieses Verfahrens gegenüber solchen, die auf einer neutralen Elektroporation basieren, ist die feine Kontrolle der Genexpressionsniveaus. Insbesondere ermöglicht diese integrierte Pipeline die In-vivo-Bewertung von Defekten, die durch kleine Veränderungen der Genexpression bei der Kontrolle der neuronalen Zytoarchitektur erhöht werden.Darüber hinaus ermöglicht die Paarstruktur des Transplantationstests eine enorme Reduzierung der Anzahl der Tiere, die notwendig ist, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Die Technik nutzt einen Vorläuferpool, der von transgenen Tau-EGFP-Embryonen stammt. Dieser Pool ist in zwei Unterpools unterteilt, die alternativ mit zwei lentiviralen Mischungen infiziert sind.Um einen grünen Testpool und einen gelben Kontrollpool zu erhalten, der gemeinsam injiziert wird. Nach zwei Tagen In-vitro-Expansion werden die resultierenden Neurosphären getrennt, eins zu eins gemischt und mit einer Kapillare in den ventrikulären Raum der Maus injiziert. Zehn Tage später wird die Immunfluoreszenz an koronalen Abschnitten durchgeführt, um den Vergleich zwischen Test- und Kontrollneuronen zu ermöglichen.Schließlich werden die immunbefleckten Abschnitte abgebildet und skelettiert, um die morphometrischen Parameter abschließend zu bewerten. Bereiten Sie vor der In-vivo-Transplantation den Vorläufer-Grünpool vor. E12.5-Embryonen, die von einer schwangeren Mutter geerntet wurden, die zuvor mit einem Tau EGFP-Gründer verpaart wurde, werden in einzelnen Brunnen einer Multi-Well-Platte in PBS-Lösung gesetzt.Genotyp sie schnell durch Sichtprüfung unter einer Blaulichtlampe. Dissoziieren Sie die sezierten grünen Kortiken einzelnen Zellen. Setzen Sie Zellen in einem proliferativen Medium wieder aus, und unterteilen Sie sie in zwei gleich große Teilpools.Infizieren Sie jeden Subpool mit einer speziellen lentiviralen Mischung. Jede Mischung enthält Red-Label-Virus oder Black-Control-Virus. Ebenso wie Viren für Tet-Off-gesteuerte Transgen- bzw. Kontrollexpression.Jedes Lentivirus muss bei einer Vielzahl von Infektionen von 8 verabreicht werden. Die infizierten Zellen in proliferativem Medium mit 2 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin verschichten. Übertragen Sie Zellen in den Inkubator und lassen Sie sie für 2 Tage bei 37 Grad.Nach 2 Tagen müssen die beiden Subpools als Suspensionen kleiner Neurosphären erscheinen. Homogen eszisch das rote fluoreszierende Protein ausdrücken, oder nicht. Nach der Entwicklung von Vorläufern, legen Sie ein Bewertungsarray für die Transplantation in P0 weißen Labor Welpen.Verwenden Sie die Borosilikatglaskapillaren mit einem ewigen und inneren Durchmesser von 1,5 Millimetern bzw. 1,12 Millimetern. Ziehen Sie die Kapillare mit einem P1000-Abzieher. Geben Sie zunächst das Ziehprogramm ein.Zweitens, legen Sie die Kapillare in die Halter und ziehen Sie sie fest. Drittens, starten Sie das Programm und nehmen Sie die beiden gezogenen Mikrokapillaren. Schneiden Sie die Kapillarspitze von Hand mit einem Skalpell unter das Stereomikroskop, um eine Spitze mit einem Außendurchmesser von 200-250 Mikrometern zu erhalten.Schließlich die Kapillaren auf den Kunststoffträger in eine geschlossene Petrischale legen und unter die Haube geben. Disfizieren Sie optische Fasern und legen Sie sie unter die Haube. Mischen Sie die EGTA- und Fast Green-Master-Mischungen, um die Zell-Tracer-Lösung vorzubereiten, und legen Sie sie erneut unter die Haube.Schneiden Sie kleine Stücke von Labor-Dichtungsfolie für Zellsuspension stonung. Und schließlich, bereiten Sie eine Lösung von 1 Milligramm pro Milliliter steriles Doxycyclin in einer 0,3 Milliliter Spritze entsorgt. Das Injektionsrohr wird aus zwei Latexröhren hergestellt.Befestigen Sie ein hartes Kunststoff-Mundstück an einem Ende eines Latexrohrs. Befestigen Sie dann den Kapillarhalter an einem Ende des anderen Latexrohrs. Verbinden Sie die freien Enden der beiden Latexröhren aus einem 0,45 Mikrometer sterilen Filter als Barriere gegen Bedienerkeime.Legen Sie die resultierende Aspiratorrohranordnung auf einen Kunststoffhalter, der unter der Haube aufbewahrt werden soll. Sammeln, testen und steuern Sie Neurosphären in separaten Röhren. Zentrifugen-Neurosphäresuspensionen und ersetzen den Überstand durch PBS.Wiederholen Sie diese Sequenz zwei weitere Male. Zentrifugen-Neurosphärensuspensionen, ersetzen Sie den Überstand durch Trypsin-Lösung, und Pipette der Zellpellet rauf und runter, 4, 5 mal. Lassen Sie die Zellen für fünf Minuten im Inkubator, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.Blockieren Sie Trypsin mit Trypsin-Inhibitor-Lösung. Zentrifugenzellen und setzen sie in einem frischen proliferativen Medium wieder aus. Zählen Sie die Zellen der beiden Pools und passen Sie ihre Konzentration auf 100.000 Zellen pro Mikroliter in proliferativem Medium an.Anschließend werden Test- und Kontrollzellen 1:1 gemischt und die resultierende Mischung unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft. Schließlich legen Sie die Mischung auf Eis unter der Haube. Bereiten Sie den Käfig mit der Mutter und den Welpen auf einem Tisch weit weg vom chirurgischen Bedienerbereich vor.Legen Sie einen Bergungskäfig auf einen Warenkorb. Legen Sie eine Mischung aus Sägemehl aus dem Käfig der Mutter auf den Boden, und legen Sie den Bergungskäfig unter eine Lampe. Beiseite, stellen Sie eine Eiskiste mit einer Aluminiumfolie für die Anästhesie der P0 Welpen bedeckt.Kurz vor der Transplantation ein Volumen von 1 bis 10 Volumen zellierstattiger Lösung zu einem Volumen der Zellsuspension hinzufügen und drei Mikroliter der resultierenden Mischung auf einem Stück Labor-Dichtungsfolie erkennen. Legen Sie den Welpen für eine Minute auf die kühle Aluminiumfolie und überprüfen Sie, ob er vollständig beästhetisiert ist. In der Zwischenzeit die 3 Mikroliter Injektion in die Glaskapillare absaugen.Wischen Sie den Kopf des anästhesierten Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol ab. Als nächstes, lokalisieren Sie es auf der optischen Faser, um die kortikalen Hemisphären klar zu identifizieren. Geben Sie die Kapillare in die Vorderseite und greifen Sie auf die ventrikuläre Kavität zu.Achten Sie dabei darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Um Schäden an ganglionischer Eminenz zu vermeiden, drehen Sie die Nadel seitlich um dreißig Grad. Injizieren Sie die Zellen vorsichtig in den Hohlraum und überwachen Sie deren Diffusion mit Fast Green.Warten Sie fünf bis zehn Sekunden. Entfernen Sie die Glasnadel, achten Sie darauf, die Zellsuspension nicht zu aspirieren, und entsorgen Sie sie in einem geeigneten Entsorgungsbehälter. Vor der Erholung des Welpen von der Anästhesie 150 Mikroliter Doxylösung intraperitoneal injizieren, um die transgene Expression nach der Transplantation noch ausschalten zu lassen.Legen Sie die Welpen nach der Injektion sofort unter die Lampe, um sich zu erholen. Lassen Sie die Welpen dort für fünf bis zehn Minuten, und sobald sie vollständig wach sind, legen Sie sie in den Käfig mit der Mutter. Beobachten Sie die operierten Welpen für zwei bis drei Stunden, um sicherzustellen, dass die Mutter sie akzeptiert.Den Käfig mit Trinkwasser, das 0,5mg/ml Doxycyclin und Saccharose enthält, zu versorgen, um die transgene Expression fern zu halten. Ersetzen Sie das Wasser enthaltendes Doxycyclin vier Tage nach der Transplantation durch doxyfreies Wasser. So wird das Transgen in postmitotischen Neuronen aktiviert.Halten Sie Mäuse sechs Tage lang in einem doxyfreien Regime auf und einschläfern Sie sie bei P10. Fix Gehirne von eingeschläferten Welpen in 4%PFA, bei vier Grad, über Nacht. Entfernen Sie die PFA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30%Saccharose-Lösung.Lassen Sie das Gehirn bei vier Grad, bis sie auf die Durchstechflasche unten sinken. Übertragen Sie die Gehirne in eine Einweg-Einbettform etwa die Hälfte mit Kryo-Inklusionsmedium gefüllt. Einfrieren Sie das mitgelieferte Gehirn bei 80 Grad.Schneiden Sie 60 Mikrometer dicke koronale Abschnitte mit einem Kryostat. Prozessabschnitte für Anti-GFP, Anti-RFP-Immunfluoreszenz und gegenstain sie mit DAPI-Lösung. Stellen Sie die Arbeitsparameter des konfokalen Mikroskops entsprechend wie gezeigt ein.Sammeln Sie Bilder von immunoassayed Scheiben, Auswahl GFP positive neuronreiche fotografische Felder blind von RFP-Signalverteilung. Exportieren Sie die Bilder als ND2-Dateien und generieren Sie maximale Z-Projektionen davon als TIFF-Dateien. Um eine nachfolgende Neuronen-Skelettierung blind des Zellgenotyps zu ermöglichen, verstecken Sie das rote Signal.Fügen Sie dazu eine Anpassungsebene hinzu. Wählen Sie Ebenen, wählen Sie rot. Setzen Sie die Ausgabe auf Null.Und speichern Sie die Datei als solche. Die Skelettierung wird anschließend von einem neuen Operator durchgeführt, der zuvor keinen Zugriff auf originale rote Dateien hatte. Öffnen Sie für jede ausgeblendete rote Datei die Datei, fügen Sie dem primären Bild eine Zeichnungsebene hinzu, und wählen Sie das Bleistiftwerkzeug aus.Verfolgen Sie den Somer auf der Grundlage des GFP-Signals. Verfolgen Sie dann die Neuriten. Speichern Sie schließlich die Mutlilayer-Datei, einschließlich neuronaler Silhouetten.Eine nachträgliche Analyse neuronaler Skelette kann von beiden Operatoren durchgeführt werden. Öffnen Sie jede mulitlayer-Datei, erstellen Sie neue leere 16-Bit-Graustufendateien mit schwarzem Hintergrund. Eins pro Neuron.Kopieren und fügen Sie einzelne neuronale Silhouetten vom primären Bild bis hin zu den Graustufendateien ein. Kehren Sie zur Mehrschichtdatei zurück und schalten Sie die Einstellungsschicht aus, um neuronale Genotypen zu enthüllen. Speichern Sie die 16-Bit-Graustufendateien, und kommentieren Sie die entsprechenden Neuronen-Genotypen.Importieren Sie Graustufenbilder in ImageJ nacheinander und analysieren Sie Skelette mit dem NeurphologyJ-Plugin. Sammeln Sie ausgewählte NeurophologieJ-Primärdaten, Gesamtfläche der Neuritenlänge, Befestigungspunkte und Endpunkte, in einer Kalkulationstabelle und verwenden Sie sie, um sekundäre morphometrische Parameter zu berechnen. Das von uns vorgeschlagene Engineering-Protokoll ermöglicht es, die überwiegende Mehrheit der untersuchten Neuronen mit den beabsichtigten Transgenen-Sets zu kotransduzieren.Darüber hinaus ermöglicht es eine erhebliche Homogenität der transgenen Expressionsniveaus innerhalb der transduced Zellpopulation. Ein wesentliches Merkmal unseres Verfahrens ist die gekoppelte Konfiguration. Ein Test und ein Kontrollvorläuferpool werden separat entwickelt, 1:1 gemischt und schließlich mittransplantiert.Dieser gepaarte Ansatz erleichtert die Erkennung von Ergebnisunterschieden, die speziell mit unterschiedlichen Genotypen in Verbindung stehen. In diesem Beispiel analysierten wir koronale Abschnitte transplantierter Welpen zehn Tage nach der interventrikulären Koinjektion von Foxg1-überexzierenden Neuronenvorläufern und Kontrollvorläufern. Bilder von Gruppen von Neuronen wurden mit konfokaler Mikroskopie erworben.Z-Stack-Dateien wurden verwendet, um maximale Projektionen zu berechnen. Neuronale Silhouetten wurden manuell nachverfolgt. Hier stellen grüne und gelbe Silhouetten Foxg1-Über-Ausdrucks- bzw. Kontrollneuronen dar.Schließlich wurden die primären Parameter, die durch die NeurphologyJ-Analyse ermittelt wurden, für die Berechnung der sekundären morphometrischen Indizes verwendet, wie dargestellt. Dies ist ein einfaches Protokoll, das es dem Forscher ermöglicht, die Auswirkungen zu bewerten, die die gemischte Expression eines bestimmten Gens auf die feine Kontrolle der Neuritenentwicklung in vivo ausüben kann. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind zwei.Vorhandene Anzahl von Genen, die an neuronaler Morphogenese beteiligt sind, können in vivo funktionell charakterisiert werden, wenn die entsprechenden teratogenen Linien fehlen. Und für die Analyse werden weniger Tiere benötigt, um die signifikanten statistischen Ergebnisse zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Forschung

Genetik

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...