Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

אנו מודים לקרן דוק על תרומתו לשלב מוקדם של הליך זה.

כל השיטות וההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הארגון SISSA הקדם אל Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. הדור הנדסי של בריכות מחולל "ירוקות"
<ol><li>הכנת הבריכה "הירוקה"
	<ol>
<li>מחבר מסוג פראי CD1 נקבה עם מייסד Mtapt/+ + 16. המתת חסד הסכר ההרה על ידי פריקה צוואר הרחם ב 12.5 ימים ...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

היבטים/צעדים ספציפיים של הליך זה הם קריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. ראשית, (א) אופרטורים חייבים להיות מאומנים בצורה מספקת כדי לתפעל בביטחה את הווירוסים בסביבת מעבדה תואמת BSL-2. שנית, (ב) לפני ערבוב "מבחן" ו "שליטה" ההכנות העצביות, זה הכרחי כדי לשטוף בזהירות את שני השעיות נוירוספירה המקביל כפי ?...

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שפיתחנו לנתח בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית. מבוסס על הנדסת חוץ גופית של מקדים עצביים, ההשתלה שלהם לתוך המוח הבין לבין הערכה מוגרמטרית של "מבחן" ו "שליטה" תאים, זה מאפשר לחשוף את ההשלכות תפקודית של גנים מבחן בשליטה עדינה של מורפולוגיה עצבית ב דרך מהירה ומשתלמת. כדי לחקור בקרת גנים vivo של אדריכלות עצבית, שלושה נושאים טכניים מרכזיים חייב להיות ממוען: (1) השגת ביטוי גן התעניינות מספקת (הגוי) ושליטה כמותית מדויקת של אותו; (2) קבלת הדמיה מקוטעת כראוי של צלליות נוירואליות נפרדות; (3) מעורר משמעות סטטיסטית של תוצאות תוך העסקת מספר מוגבל של בעלי חיים.
כאשר זמין, העכבר מוטציה קווים מחסה טטרציקלין (ט) מבוקרת transgenes עשוי להיות הכלי הטוב ביותר כדי לטפל בגיליון הראשון1. לחילופין, הטרנסגנזה הסומטית עשויה להיות מועסק. במקרים כאלה, הטרנסגנטית מועברת באמצעות אלקטרופורציה2 או התמרה נגיפית3. לאחר מכן, הוא נשמר כאפיכמה (למשל, על-ידי אלקטרופורציה סטנדרטית4), או שהוא משולב לתוך הגנום (באופן אקראי, באמצעות שילובים retroviral יעיל5; או במיקום מוגדר, באמצעות crispr-קידם הומולוציה שילוב מחדש (slendr)6 ).
שנית, צללית עצבית הדמיה עשוי להיות מושגת באמצעות (a) מדים דלילים תיוג או (ב) צפוף תיוג דיפרנציאלי. באשר לתיוג דליל, מתודולוגיות מתקדמות כמו Golgi עשוי להיות מועסק7, מיניסטים עצביים שנבחרו ניתן למלא על ידי biocytin8, ותיוג מלח ופלפל ניתן להשיג תודות לגנים מבוטא בדלילות. כזה יכול להציג שעתוק מגוון (שלך-EGFP)9 או יכול להיות מופעל על ידי שילוב סטוכסטי (morf)10. באשר (ב), המדינה של אסטרטגיות האמנות כוללים מתווך של היצור-תיווך סטוכסטי שילוב של בתוך מערך מרובה פלואופאנפרוטאין transopחלבון (במוח)11, כמו גם שילוב של מונחה גנומה-טרנספססאוסה של גנים fluoroprotein, בעבר נמסר באמצעות טרנסגנזה סומטית (שיבוט)12.
באשר לסוגיה השלישית, התוצאה המורמטרית מושפעת לעתים קרובות על ידי שינויים אקראיים גדולים, שמקורם הבדלים בין בעלי חיים ואפשרויות הזרקת תאים. בגלל זה, מספר גדול של בעלי חיים מועסק בדרך כלל כדי להשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש כדי להעריך את הפעילות הטובה ביותר של מורמטרי.
הגישות שתוארו לעיל מסתמכות לעתים קרובות על מיומנויות טכניות מתקדמות ודורשות משאבים פיננסיים בולט, אשר עשויים להגביל את הדיפוזיה שלהם בתוך הקהילה המדעית. כדי לעקוף בעיות אלה, הצלחנו צינור קל ופשוט לנתח את השליטה גנים של נוירוארכיטקטורה ב vivo בדרך מהירה ובמחיר נוח. זה מעורר השראה על ידי עיצוב דומה שיתוף השתלת בעבר שפותחה במהירות vivo הערכה של פעילות antiblastic transgene13.
באופן ספציפי, הוא חשב כי השתלת המשותף של הנדסה חוץ גופית "ירוק" מקדים עצביים ("מבחן" ו "שליטה" תאים) לתוך המוח התינוק "שחור" התינוק יכול במקביל לתקן את שלושת הנושאים המרכזיים המפורטים לעיל. למעשה, בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של סמנים מוקדמים, בתנאים מבוקרים היטב, מאפשר תחזוקה של השתנות הביטוי העצבי-מגנטי במינימום, הרחק מתחת כי בדרך כלל הקשורים במניפולציות vivo סומטיים (שבוצעה בעבר מיכל בן 14 , 15 ובתוצאות שלא פורסמו. השליטה המדויקת המתקבלת על ביטוי הגנים דומה לזו שהושגה במודלים טרנסגניים מבוקרים. עם זאת, עלויות של הליך זה הן הרבה מתחת לאלה שמקורן בתחזוקת קו העכבר הטרנסגניים. לאחר מכן, הזרקת התא החופשי היא קלה ודורשת הכשרה מינימלית. כמו-כן, ניתן לכוונן בקלות את כמות הסמנים המושתלים המוזרקים לתוך כל מוח כדי להשיג מספר מצטבר מספיק של מקדם-סמנים בדלילות, תוך שמירה על המספר הכולל של חיות משושתלים במינימום. אחרון חביב, שיתוף הזרקה של fluoro שונים מתויג, "מבחן" ו-"שליטה" מראש סמנים וניתוח סטטיסטי הבאים של התוצאות לנטרל את ההשפעות של בעלי חיים השונות ניסיוני, המאפשר להגיע של משמעות סטטיסטית של תוצאות, גם על ניתוח של מספר מוגבל של אנשים13.
יודגש כי, אם כי מהיר וזול, שיטה זו יש שתי מגבלות עיקריות. ראשית, היא נועדה לחקור את השליטה הגנטית התאית של האדריכלות העצבית, וזה לא מתאים לטפל בשליטה סביבתית. שנית, כמו מושתלים המושתלים טרום המעבר להגיע למיקום הסופי שלהם על ידי לוח זמנים הטרוכרוני, שיטה זו עדיפה על מודל שליטה נוירופרטונידנטים המתרחשים השלמת הגירה בעבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

השליטה הגנטית באדריכלות העצבית. היא הנושא של חקירה אינטנסיבית מתוארים כאן היא שיטה פשוטה שפותחה ללמוד בקרת גנים vivo של מורפולוגיה הקרנה הניאו קליפת המוח. שיטה זו מבוססת על (1) בהנדסה מחוץ לתחום ויראלי של הנדסה עצבית מסוג "מבחן" ו-"שליטה" תאים, (2) שיתוף הפעולה שלהם למוח פראי, ו (3) לזווג הערכה מורמטרית של נגזרות עצבי שלהם. באופן ספציפי, E 12.5 מסמני מקדים מתורמים בעלי התווית גנטית, מעובדים בעלי התוויות, מועסקים למטרה זו. הם מתוכננים כדי לנצל את היזמים שנבחרו, tetON/OFF הטכנולוגיה, והם בחינם יד מושתלים לתוך החדרים לרוחב הלובין. מאוחר יותר, על הפרופילים של המוח המושתלים של מוחות הנמען, צלליות של נוירונים מושתלים מוזנים לתוך התוכנה הקוד הפתוח עצבי, הפרמטרים שלהם מורמטרים מופקים, ואת האורך הממוצע מדד הסתעפות מחושבים. בהשוואה לשיטות אחרות, אחד זה מציע שלושה יתרונות עיקריים: הוא מתיר השגת שליטה עדינה של ביטוי טרנזגני במחיר סביר, זה רק דורש כישורי ניתוח בסיסיים, והוא מספק תוצאות אמינות סטטיסטית על ניתוח מוגבל ספר בעלי חיים. בגלל העיצוב שלה, עם זאת, זה לא מספיק כדי לטפל שאינו השליטה האוטונומית התא של נוירוארכיטקטורה. כמו-כן, רצוי להשתמש בה כדי לחקור שליטה neurite ורפולוגיה לאחר השלמת הגירה עצבית. בניסוח הנוכחי שלה, שיטה זו מכוונת להפליא כדי לחקור בקרת גנים של האדריכלות נוירונים glutamatergic neoקורטיקלית. ניצול של קווים טרנסגניים המבטא EGFP בסוגים אחרים של תאים עצביים ספציפיים, זה יכול להיות מחדש תכליתי כדי לטפל בקרת גנים של הארכיטקטורה שלהם.

קיימות חמש מערכות נתונים ראשיות המספקות מידע שימושי אודות היבטים מרכזיים של הפרוצדורה, היעילות הראשונה (1) התייעלות של התמרה ושיתוף התמרה של וקטורים מבוססי-ויראליות. (2) דוגמה של תכונות עיקריות של היזמים המועסקים לנהוג "גן מבחן". (3) דוגמה של תאים מהונדסים מוכן השתלת. (4) קריק?...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא הערכת ההשפעה של מניפולציות ביטוי גנים על ארכיטקטורה עצבית קליפת המוח ב vivo. היתרון העיקרי הראשון שלנו בהליך זה על פני אלה המבוססים על אלקטרופורציה נייטרלית, הוא השליטה העדינה ברמות ביטוי הגנים. באופן ספציפי, צינור משולב זה מאפשר את הערכת in vivo של פגם, מווסל על ידי שינויים קטנים בביטוי גנים על השליטה של cytoarchitecture עצבי.יתר על כן, מבנה הזוג של בדיקת ההשתלה מאפשר הפחתה עצומה במספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג תוצאות מובהקות סטטיסטית. הטכניקה מנצלת מאגר מבשר שמקורו בעוברים מהופנטים טאו EGFP. בריכה זו מחולקת לשתי בריכות משנה כי הם נגועים לחילופין עם שתי lentiviral מערבב.כדי להשיג בריכת בדיקה ירוקה ובריכת בקרה צהובה כי יהיה במשותף מוזרק. לאחר יומיים של התרחבות במבחנה, הספירות הנוירו וכתוצאה מכך מנותקות, מעורבבות אחת לאחד, ומוזרקות עם נימי בחלל חדר העכבר. עשרה ימים לאחר מכן, חיסון על חלקים coronal מבוצעת כדי לאפשר את ההשוואה בין נוירונים בדיקה ושליטה.לבסוף, החלקים הכשלים בחיסון הם בתמונה ושלד להערכה סופית של פרמטרים מורפומטריים. לפני השתלת vivo, להכין את הבריכה הירוקה מבשר. E12.5 עוברים, שנקטפו מסכר בהריון שהומתק בעבר למייסד טאו EGFP, מוגדרים בארות בודדות של צלחת רב בארות בתת פתרון PBS.גנוטיפ אותם במהירות על ידי בדיקה חזותית תחת מנורת אור כחול. נתק את הקורטיות הירוקות המנותנות לתאים בודדים. השהה מחדש תאים במדיום שגשוג, והכנס אותם לשתי תתי-מאגרים בגודל שווה.להדביק כל תת בריכה עם תערובת lentiviral ייעודית. כל תערובת מכילה וירוס תווית אדומה או וירוס בקרה שחורה. כמו גם וירוסים עבור ביטוי טרנסג'ן מונחה Tet-Off או בקרה, בהתאמה.כל lentivirus חייב להינתן בריבוי של זיהום של 8. צלחת התאים הנגועים במדיום התפשטות עם 2 מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין. מעבירים תאים לאנקובטור ומשאירים אותם ליומיים ב-37 מעלות.לאחר יומיים, שתי תת הבריכות חייבות להופיע כהשעיות של נוירוספרות קטנות. מבטא הומוגנית את החלבון הפלואורסצנטי האדום, או לא. לאחר ההנדסה של מבשרים, להגדיר מערך להעריך להשתלה P0 גורי מעבדה לבנים.השתמש נימי זכוכית borosilicate עם קוטר נצחי ופנימי שווה 1.5 מילימטרים ו 1.12 מילימטרים, בהתאמה. משוך את נימי עם מושך P1000. ראשית, הזן את תוכנית משיכה.שנית, מניחים את נימי למחזיקים ומהדקים אותם. שלישית, התחל את התוכנית וקח את שני המיקרו-capillaries שנמשכו. חותכים את קצה נימי, ביד עם אזמל, מתחת סטריאומיקרוסקופ כדי לקבל קצה עם קוטר חיצוני של 200-250 מיקרומטר.לבסוף, מניחים את הניבים על התמיכה הפלסטלינה בצלחת פטרי סגורה, ומעבירים אותה מתחת למכסה המנוע. לחטא סיבים אופטיים ולה מניחים אותם מתחת למכסה המנוע. מערבבים את התערובות הראשיות של EGTA ו-Fast Green, כדי להכין את פתרון מעקב התאים, ומ מניחים אותו שוב מתחת למכסה המנוע.חותכים חתיכות קטנות של סרט איטום מעבדה עבור איתור השעיית תא. ולבסוף, להכין פתרון של 1 מיליגרם למיליליטר דוקסיציקלין סטרילי השליך במזרק 0.3 מיליליטר. צינור ההזרקה מוכן משני צינורות לטקס.תקן חתיכת פה מפלסטיק קשיח לקצה אחד של צינור לטקס. לאחר מכן, לתקן את מחזיק נימי לקצה אחד של צינור לטקס השני. חבר את הקצוות החופשיים של שני צינורות לטקס ממסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר, כמחסום נגד חיידקי המפעיל.מניחים את הרכבה צינור שאפתן וכתוצאה מכך על מחזיק פלסטיק להישמר מתחת למכסה המנוע. לאסוף, לבדוק ולשלוט נוירוספרות בצינורות נפרדים. השעיות נוירוספרה צנטריפוגה ולהחליף את על טבעי על ידי PBS.חזור על רצף זה פעמיים נוספות. השעיות נוירוספרה צנטריפוגה, להחליף את supernatant על ידי פתרון טריפסין, ו pipette גלולת התא למעלה ולמטה, 4, 5 פעמים. השאירו תאים באינקובטור למשך חמש דקות כדי לקבל השעיה של תא אחד.לחסום טריפסין עם פתרון מעכבי טריפסין. תאי צנטריפוגה, ולהשעות אותם מחדש במדיום שגשוג טרי. לספור תאים של שתי הבריכות ולהתאים את הריכוז שלהם ל 100, 000 תאים לכל microliter, במדיום שגשוג.לאחר מכן, מערבבים את תאי הבדיקה והבקרה 1:1 ובדקו את התערובת המתקבלת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, מניחים את התערובת על קרח מתחת למכסה המנוע. הכינו את הכלוב עם האם והגורים על שולחן הרחק מאזור המפעיל הכירורגי.שים כלוב התאוששות על עגלה. שים תערובת של נסורת שנלקחה מהכלוב של האם בתחתיתו, והניח את כלוב ההתאוששות מתחת למנורה. בצד, מניחים קופסת קרח מכוסה בנייר אלומיניום עבור ההרדמה של גורי P0.ממש לפני ההשתלה, להוסיף 1 עד 10 נפח של פתרון מעקב תאים לנפח אחד של השעיית תא, ולאתר שלושה microliters של תערובת וכתוצאה מכך על פיסת סרט איטום מעבדה. מניחים את הגור על רדיד אלומיניום קריר במשך דקה אחת, ולבדוק שהוא הרדמה מלאה. בינתיים, שאפו את 3 המיקרוליטרים של תערובת ההזרקה לתוך נימי הזכוכית.מנגבים בעדינות את ראש הגור הרדמה עם 70% אתנול. לאחר מכן, לאתר אותו על הסיב האופטי, כדי לזהות בבירור את ההמיספרות קליפת המוח. הזן את נימי לחזית וגישה לחלל החדר.בזמן שאתה עושה את זה, לשים לב לא לפגוע בכלי הדם. כדי למנוע נזק של הוד גנגליוני, לסובב את המחט באופן משני על ידי שלושים מעלות. בעדינות להזריק את התאים לתוך החלל ולפקח על ההיתוך שלהם באמצעות ירוק מהיר.חכה חמש עד עשר שניות. הסר את מחט הזכוכית, דואג לא לשאיף את ההשעיה התא, ולהשליך אותו בפח סילוק מתאים. לפני התאוששות גור מהרדמה, להזריק 150 microliters של פתרון דוקסי intraperitoneally, כדי לשמור על ביטוי מהונדס עדיין כבוי לאחר ההשתלה.לאחר ההזרקה, מניחים את הגורים מיד מתחת למנורה להחלמה. השאירו את הגורים שם במשך חמש עד עשר דקות, וברגע שהם ערים לחלוטין, מניחים אותם בכלוב עם האם. שימו לב לגורים המופעלים במשך שעתיים עד שלוש שעות, כדי להבטיח שהאם תקבל אותם.לספק את הכלוב עם מי שתייה המכילים 0.5mg/ mL דוקסיציקלין סוכרוז, כדי לשמור על הביטוי מהומר כבוי. החלף את הדוקסיציקלין המכיל מים במים נטולי דוקסי ארבעה ימים לאחר ההשתלה. ובכך מפעיל את הגן הטרנס-גנטי בנוירונים פוסט-מיוטיים.שמור עכברים במשטר ללא דוקסי במשך שישה ימים, ולהרים אותם ב P10. תקן מוחות מגורים המתת ים ב 4% PFA, בארבע מעלות, לילה. הסר את פתרון ה- PFA והחלף אותו בפתרון 30%sucrose.השאירו את המוח בארבע מעלות עד שהם שוקעים לתחתית הבקבוקון. מעבירים את המוח לתבנית הטבעה חד פעמית כחצי מלאה במדיום הכללת קריו. להקפיא את המוח הכלול ב 80 מעלות.חותכים 60 מיקרון עבה חלקים coronal באמצעות קריוסטט. תעבד מקטעים עבור אנטי-GFP, נגד שפעת חיסונית של RFP ונגד פתרון DAPI. הגדר פרמטרי עבודה של המיקרוסקופ הקונפוקלי כראוי כפי שמוצג.לאסוף תמונות של פרוסות immunoassayed, בחירת GFP חיובי נוירון עשיר שדות צילום עיוור של הפצת אותות RFP. יצא את התמונות כקבצי ND2 וליצור מקסימום z-הקרנות שלהם כקבצי TIFF. כדי לאפשר שלד נוירון עוקב עיוור של גנוטיפ התא, להסתיר את האות האדום.לשם כך, הוסיפו שכבת התאמה. בחר רמות, בחר אדום. הגדר פלט לאפס.ולשמור את הקובץ ככזה. שלד מבוצע לאחר מכן על ידי מפעיל חדש, שלא הייתה לו גישה קודמת לקבצים אדומים רגילים מקוריים. לכל קובץ אדום מוסתר, פתחו את הקובץ, הוסיפו שכבת ציור לתמונה הראשית ובחרו בכלי העיפרון.עקוב אחר somer על בסיס אות GFP. לאחר מכן, עקוב אחר הנוריטים. לבסוף, שמור את קובץ mutlilayer, כולל צלליות עצביות.ניתוח עוקב של שלדים עצביים יכול להתבצע על ידי כל אחד מהמפעילים. פתחו כל קובץ mulitlayer, צרו קבצים ריקים חדשים בגווני אפור של 16 סיביות עם רקע שחור. אחד לכל נוירון.העתק והדבק צלליות עצביות בודדות, מהתמונה הראשית, לקבצים בגווני אפור. חזור לקובץ רב שכבתי כבה את שכבת ההתאמה כדי לחשוף גנוטיפים עצביים. שמור את הקבצים בגווני אפור של 16 סיביות, ביאורים של גנוטיפים מתאימים של נוירונים.יבא תמונות בגווני אפור ב- ImageJ בזה אחר זה, ונתח שלדים לפי תוסף NeurphologyJ. לאסוף נתונים ראשוניים נבחרים NeurophologyJ, שטח כולל של אורך neurite, נקודות קובץ מצורף ונקודות קצה, לתוך גיליון אלקטרוני, ומעסיקים אותם כדי לחשב פרמטרים מורפומטריים משניים. הפרוטוקול ההנדסי שאנו מציעים מאפשר להפוך את הרוב המכריע של הנוירונים לנושא החקירה, עם ערכות הטרנסג'נדרים המיועדות.יתר על כן, הוא מאפשר להשיג הומוגניות משמעותית של רמות ביטוי מהומר בתוך אוכלוסיית התאים מתמרן. תכונה מרכזית של ההליך שלנו, היא תצורה מזווגת. בדיקה ובריכת מבשר בקרה מהונדסים בנפרד, מעורבים 1:1, ולבסוף מושתלים במשותף.גישה מזווגת זו תאפשר זיהוי של הבדלי תוצאות הקשורים במיוחד לגנוטיפים נפרדים. בדוגמה זו, ניתחנו חלקים קורונטל של גורים מושתלים, עשרה ימים לאחר הזרקת שיתוף בין-תאית של Foxg1 ביטוי יתר של נוירונים מבשרי ושליטה אלה. תמונות של קבוצות של נוירונים נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקל.קבצי מחסנית Z שימשו לזיכרון התחזיות המרביות. צלליות עצביות אותרו ידנית. כאן, צלליות ירוקות וצהובות מייצגות את הנוירונים של Foxg1 שמבטאים ושולטים יתר על כן, בהתאמה.לבסוף, פרמטרים ראשוניים שהתקבלו על ידי ניתוח NeurphologyJ, הועסקו לחישוב מדדים מורפומטריים משניים, כפי שמודגם. זהו פרוטוקול פשוט המאפשר לחוקר להעריך את ההשפעה כי הביטוי המעורב של גן נתון, עשוי להפעיל על שליטה עדנה של התפתחות neurite darth in vivo. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם שניים.מספר קיים של גנים המעורבים morphogenesis עצבי עשוי להיות מאופיין תפקודית ב vivo, בהיעדר הקווים הטרטוגניים המתאימים. ופחות בעלי חיים נדרשים לניתוח כדי לקבל את התוצאות הסטטיסטיות המשמעותיות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...