Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

हम इस प्रक्रिया की जल्दी स्थापित करने के लिए उनके योगदान के लिए Mihn Duc क्या धन्यवाद.

सभी तरीकों और प्रक्रियाओं यहाँ वर्णित SISSA जीवो preposto अल Benessere Animale (SISSA IACU) द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. इंजीनियर "हरी" जनक पूल की पीढ़ी
<ol><li>"हरी" पूल की तैयारी
	<ol>
<li>मेट एक जंगली प्रकार CD1 महिला के सा?...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

इस प्रक्रिया के विशिष्ट पहलू/चरण महत्वपूर्ण हैं और इस पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, (क) ऑपरेटरों पर्याप्त रूप से एक बीएसएल-2 अनुरूप प्रयोगशाला वातावरण में lentiviruses हेरफेर करने के लिए पर्याप...

यहाँ हम एक सरल विधि हम न्यूरॉन cytoarchiketoke के vivo जीन नियंत्रण में विच्छेदन के लिए विकसित का वर्णन. न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो इंजीनियरिंग के आधार पर, नवजात मस्तिष्क में उनके प्रत्यारोपण और "परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं के युग्मित morphometric मूल्यांकन, यह एक में न्यूरॉन आकृति विज्ञान के ठीक नियंत्रण में परीक्षण जीन के कार्यात्मक प्रभाव अनावरण करने के लिए अनुमति देता है तेजी से और सस्ती तरीका है. न्यूरोनल वास्तुकला के विवो जीन नियंत्रण में जांच करने के लिए, तीन प्रमुख तकनीकी मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए: (1) एक पर्याप्त रूप से पैटर्न जीन के ब्याज (भारत आई ओ आई) अभिव्यक्ति और इसका एक सटीक मात्रात्मक नियंत्रण प्राप्त करना; (2) अलग न्यूरॉन silhouettes की एक ठीक से खंडित दृश्य प्राप्त करने; (3) परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करते हुए पशुओं की एक सीमित संख्या में रोजगार.
उपलब्ध होने पर, टेट्रासाइक्लिन (टीईटी) नियंत्रित transgenes शरण माउस उत्परिवर्ती लाइनों पहले मुद्दे1को संबोधित करने के लिए सबसे अच्छा उपकरण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, दैहिक transgenesis नियोजित किया जा सकता है. ऐसे मामलों में, ट्रांसजीन इलेक्ट्रोपोरेशन2 या वायरल ट्रांसडक्शन3के माध्यम से वितरित किया जाता है। इसके बाद, इसे एक महामारी के रूप में बनाए रखा जाता है (जैसे, मानक इलेक्ट्रोपोट्रेशन4पर), या यह जीनोम में एकीकृत होता है (यादृच्छिक रूप से, रेट्रोवायरल इंटीग्रेस5के माध्यम से ; या एक परिभाषित स्थान में, CRISPR-प्रमोट किए गए समजात पुनर्संयोजन (SLENDR)6 के माध्यम से ).
दूसरा, न्यूरॉन सिल्हूट दृश्य के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (क) विरल वर्दी लेबलिंग या (ख) घने अंतर लेबलिंग. विरल लेबलिंग के लिए, उन्नत Golgi की तरह तरीकों कार्यरत किया जा सकताहै7, चयनित न्यूरोनल minisets biocytin द्वारा भरा जा सकताहै 8, और नमक और मिर्च लेबलिंग एक विरल व्यक्त transgene के लिए धन्यवाद प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के एक transgene विभिन्न लिप्यंजन प्रदर्शित कर सकते हैं (Thy-EGFP)9 या stochastic पुनर्संयोजन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है (MORF)10. के लिए के रूप में (ख), कला रणनीतियों के राज्य एक बहु-फ्लैक्स्ड फ्लोरोप्रोटीन ट्रांसजीन सरणी (Brainbow)11के भीतर क्रे-मध्यस्थ stochastic पुनर्संयोजन शामिल हैं, साथ ही साथ piggyBac-transposase संचालित फ्लोरोप्रोटीन जीन के जीनोमिक एकीकरण, पहले दैहिक ट्रांसजेनेसिस (CLoNE)12के माध्यम से दिया |
तीसरे मुद्दे के लिए के रूप में, morphometric परिणाम अक्सर एक बड़े यादृच्छिक परिवर्तनशीलता से प्रभावित है, अंतर पशु मतभेद और सेल इंजेक्शन आकस्मिकताओं से शुरू होता है. इस वजह से, जानवरों की एक बड़ी संख्या आमतौर पर भारत सरकार morphometric गतिविधि का आकलन करने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति को प्राप्त करने के लिए कार्यरत है।
पहले वर्णित दृष्टिकोण अक्सर उन्नत तकनीकी कौशल पर भरोसा करते हैं और विशिष्ट वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता होती है, जो वैज्ञानिक समुदाय के भीतर उनके प्रसार को सीमित कर सकते हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हमने विवो में न्यूरोआर्किटेक्चर के जीन नियंत्रण को एक तेज और किफायती तरीके से विभाजित करने के लिए एक आसान और सरल पाइपलाइन की कल्पना की। यह एंटीब्लास्टिक ट्रांसजीन गतिविधि13के विवो मूल्यांकन में तेजी से विकसित एक समान सह-ट्रांसप्लांटेशन डिजाइन से प्रेरित है।
विशेष रूप से, यह सोचा है कि इन विट्रो इंजीनियर के सह-प्रतिरोपण "हरी" तंत्रिका अग्रदूतों ("परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं) एक "काला" प्राप्तकर्ता नवजात मस्तिष्क में एक साथ तीन प्रमुख मुद्दों के ऊपर सूचीबद्ध ठीक कर सकते हैं. वास्तव में, अग्रदूतों के इन विट्रो lentiviral इंजीनियरिंग में, अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में, एक न्यूनतम पर न्यूरॉन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता के रखरखाव की अनुमति देता है, अभी तक नीचे है कि आम तौर पर विवो दैहिक जोड़तोड़ में के साथ जुड़े (पहले प्रदर्शन किया 14 , 15 और हमारे अप्रकाशित परिणामों में). जीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप सटीक नियंत्रण है कि tet नियंत्रित transgenic मॉडल द्वारा प्राप्त के साथ तुलनीय है. हालांकि, इस प्रक्रिया की लागत अभी तक एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के रखरखाव से शुरू होने वालों से नीचे हैं. अगले, मुक्त हाथ सेल इंजेक्शन आसान है और कम से कम प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रत्येक मस्तिष्क में इंजेक्शन लेबल अग्रदूतों की राशि आसानी से कम से कम वितरित अग्रदूतों की एक पर्याप्त संचयी संख्या को प्राप्त करने के लिए tuned किया जा सकता है, जबकि भी एक न्यूनतम पर प्रतिरोपित जानवरों की कुल संख्या रखते हुए. पिछले नहीं बल्कि कम से कम, सह अलग fluoro लेबल के इंजेक्शन, "परीक्षण" और "नियंत्रण" अग्रदूतों और बाद में pairwise परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण अंतर पशु प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के प्रभाव प्रतिक्रिया, तक पहुँचने की अनुमति परिणामों का सांख्यिकीय महत्व, यहां तक कि सीमित संख्या में व्यक्तियों के विश्लेषण पर13.
यह जोर दिया जाना चाहिए कि, हालांकि तेजी से और सस्ते, इस विधि दो मुख्य सीमाएं हैं. सबसे पहले, यह कोशिका-स्वायत्त जीन नियंत्रण न्यूरॉन वास्तुकला की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और यह पर्यावरण नियंत्रण को संबोधित करने के लिए उपयुक्त नहीं है. दूसरा, के रूप में प्रत्यारोपित न्यूरोनल अग्रदूतों एक विषमक्रोनिकन अनुसूची द्वारा अपने अंतिम स्थान तक पहुँचने, इस विधि मॉडल neuroarchitectonics नियंत्रण पिछले प्रवास पूरा होने वाली करने के लिए बेहतर है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

न्यूरोनल साइटोआर्किटेक्चर का जीन नियंत्रण वर्तमान में गहन जांच का विषय है। यहाँ वर्णित एक सरल विधि neocortical प्रक्षेपण न्यूरॉन आकृति विज्ञान के vivo जीन नियंत्रण में अध्ययन करने के लिए विकसित की है. इस विधि पर आधारित है (1) "परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं के रूप में न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो leniviral इंजीनियरिंग में, (2) जंगली प्रकार के दिमाग में उनके सह प्रत्यारोपण, और (3) उनके न्यूरॉन डेरिवेटिव के युग्मित morphometric मूल्यांकन. विशेष रूप से, E12.5 panneuronal से pallial अग्रदूतों, आनुवंशिक रूप से लेबल दाताओं, इस उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं. वे चयनित प्रमोटरों और tetON / ऑफ प्रौद्योगिकी का लाभ लेने के लिए इंजीनियर हैं, और वे नि: शुल्क हाथ नवजात पार्श्व निलय में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. बाद में, प्राप्तकर्ता दिमाग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोफाइलिंग पर, प्रतिरोपित न्यूरॉन्स के silhouettes NeurphologyJ खुला स्रोत सॉफ्टवेयर में खिलाया जाता है, उनके morphometric मापदंडों निकाले जाते हैं, और औसत लंबाई और शाखा सूचकांक की गणना कर रहे हैं. अन्य तरीकों की तुलना में, यह एक तीन मुख्य लाभ प्रदान करता है: यह सस्ती कीमत पर transgene अभिव्यक्ति के ठीक नियंत्रण के प्राप्त करने की अनुमति देता है, यह केवल बुनियादी शल्य कौशल की आवश्यकता है, और यह एक सीमित के विश्लेषण पर सांख्यिकीय विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है जानवरों की संख्या. इसके डिजाइन के कारण, हालांकि, यह neuroarchitecture के गैर सेल स्वायत्त नियंत्रण को संबोधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है. इसके अलावा, यह अधिमानतः न्यूरोनल प्रवास के पूरा होने के बाद neurite आकृति विज्ञान नियंत्रण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अपने वर्तमान निर्माण में, इस विधि अति सुंदर glutamatergic neocortical न्यूरॉन वास्तुकला के जीन नियंत्रण की जांच करने के लिए tuned है. ट्रांसजेनिक अन्य विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार में EGFP व्यक्त लाइनों का लाभ उठाते हुए, यह उनकी वास्तुकला के जीन नियंत्रण को संबोधित करने के लिए फिर से उद्देश्य किया जा सकता है.

प्रक्रिया के प्रमुख पहलुओं के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करने वाले पांच प्राथमिक डेटासेट हैं, पहला (1) तंत्रिका अग्रदूतों की दक्षता और lentiviral सदिशों द्वारा सह-परिवर्तन। (2) "परीक्षण जीन" ड्?...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो लेन्टिवायरल इंजीनियरिंग के आधार पर, जंगली-प्रकार के दिमाग में उनके सह-ट्रांसप्लांटेशन और "परीक्षण" और "नियंत्रण" डेरिवेटिव के युग्मित मॉर्फोमीट्रिक मूल्यांकन, इस विधि से नियोकोर्टिकल के विवो जीन नियंत्रण में सटीक मॉडलिंग की अनुमति देता है एक सरल और सस्ती तरीके से न्यूरॉन आकारिकी.

विवो न्यूरोआर्किटेक्चर स्टडीज के लिए इंजीनियर न्यूरोनल प्रवर्तकों का इंट्रावेंट्रिकल ट्रांसप्लांटेशन

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा आंतरिक मानकों के साथ FACS और qPCR का उपयोग

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Xenopus में CRISPR/Cas9-आधारित Leapfrogging के लिए मौलिक रोगाणु कोशिका प्रत्यारोपण

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक समरूपता-मध्यस्थ अंत में शामिल होने की रणनीति का उपयोग कर Vivo में लक्षित एकीकरण

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

भ्रूण Microinjection और प्रत्यारोपण तकनीक Nasonia vitripennis जीनोम हेरफेर के लिए

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

एक एकल Tardigrade नमूना से Ultralow इनपुट जीनोम अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, सेल प्रकार- Arabidopsis में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता ट्रांस-सक्रियण

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

रोग से जुड़े दुर्लभ मानव वेरिएंट Drosophila का उपयोग कर के Vivo कार्यात्मक अध्ययन में

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

प्रोस्टेट कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर organoids की पीढ़ी

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...