Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Ringraziamo Mihn Duc Do per il suo contributo alla creazione anticipata di questa procedura.

Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dal SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Generazione di piscine progenitori "verdi" ingegnerizzate
<ol><li>Preparazione della piscina "verde"
	<ol>
<li>Accoppiare una femmina di tipo selvaggio CD1 con un Fondatore di MtaptEGFP / s 16 . Eutanasia la diga incinta per lussazione cervicale a 12,5 giorni dopo il coitum (giorno 0 è determinato d...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Aspetti/passaggi specifici di questa procedura sono fondamentali e richiedono particolare attenzione. In primo luogo, (a) gli operatori devono essere adeguatamente addestrati per manipolare in modo sicuro i lentivirus in un ambiente di laboratorio conforme a BSL-2. In secondo luogo, (b) prima di mescolare "test" e "controllo" preparati neurali, è obbligatorio lavare attentamente le due sospensioni neurosfera corrispondenti come descritto, al fine di prevenire qualsiasi infezione incrociata ritardata dei due preparati a ...

Qui descriviamo un semplice metodo che abbiamo sviluppato per sezionare il controllo genico in vivo della citoarchitettura neuronale. Basato sull'ingegneria in vitro dei precursori neuronali, il loro trapianto nel cervello neonale e la valutazione morfometrica accoppiata delle cellule "test" e "controllo", permette di svelare implicazioni funzionali dei geni di prova nel controllo fine della morfologia neuronale in un modo veloce e conveniente. Per studiare il controllo genico in vivo dell'architettura neuronale, devono essere affrontate tre questioni tecniche chiave: (1) ottenere un'espressione gene of-interest (GOI) adeguatamente modellata e un controllo quantitativo accurato di essa; (2) ottenere una visualizzazione adeguatamente segmentata di sagome neuronali distinte; (3) suscitare un significato statistico dei risultati, impiegando un numero limitato di animali.
Quando disponibile, le linee mutanti di topo che ospitano transgeni controllati da tetraciclina (tet) possono essere lo strumento migliore per affrontare il primo numero1. In alternativa, può essere impiegata la transgenesi somatica. In questi casi, il transgene viene consegnato tramite elettroporazione2 o trasduzione virale3. Successivamente, viene mantenuto come esoma (ad esempio, su elettroporazione standard4), oppure è integrato nel genoma (casualmente, tramite integrasi retrovirale5; o in una posizione definita, tramite la ricombinazione omologa promossa da CRISPR (SLENDR)6 ).
In secondo luogo, la visualizzazione della silhouette neuronale può essere ottenuta tramite (a) etichettatura uniforme sparsa o (b) etichettatura differenziale densa. Per quanto riguarda l'etichettatura sparse, le metodologie avanzate simili a Golgi possono essere impiegate7, i miniset neuronali selezionati possono essere riempiti dalla biocitina8e l'etichettatura sale e pepe può essere ottenuta grazie a un transgene scarsamente espresso. Tale transgene può visualizzare la trascrizione variegata (Thy-EGFP)9 o può essere attivato da ricombinazione stocastica (MORF)10. Per quanto riguarda (b), le strategie all'avanguardia includono la ricombinazione stocastica mediata da Cre nell'ambito di un array transgene di fluoroproteina multi-floscio (Barcobalen)11, nonché l'integrazione genomica di semi-maschera-trasponesi dei geni della fluoroproteina, in precedenza tramite transgenesi somatica (CLoNE)12.
Per quanto riguarda il terzo numero, l'esito morfometrico è spesso influenzato da una grande variabilità casuale, originata da differenze tra animali e contingenze di iniezione cellulare. Per questo motivo, un gran numero di animali è di solito impiegato per ottenere il potere statistico necessario per valutare l'attività morfometrica GOI.
Gli approcci descritti in precedenza spesso si basano su competenze tecniche avanzate e richiedono risorse finanziarie cospicue, che possono limitare la loro diffusione all'interno della comunità scientifica. Per aggirare questi problemi, abbiamo concepito una pipeline semplice e diretta per sezionare il controllo genetico della neuroarchitettura in vivo in modo rapido e conveniente. Questo è ispirato da un design di co-trapianto simile precedentemente sviluppato per la valutazione veloce in vivo dell'attività transgenica antiblastica13.
In particolare, si pensa che il co-trapianto di precursori neurali "verdi" ingegnerizzati in vitro ("test" e cellule "controllo") in un cervello neoatale ricevente "nero" possa risolvere contemporaneamente le tre questioni chiave sopra elencate. Infatti, in vitro lentivirale dei precursori, in condizioni ben controllate, consente il mantenimento della variabilità dell'espressione transgenica neuronale al minimo, molto al di sotto di quella solitamente associata a manipolazioni somatiche in vivo (eseguite in precedenza 14 Del sistema , 15 e nei nostri risultati inediti). Il controllo accurato risultante dell'espressione genica è paragonabile a quello ottenuto da modelli transgenici controllati da tet. Tuttavia, i costi di questa procedura sono di gran lunga inferiori a quelli derivanti dal mantenimento di una linea murina transgenica. Successivamente, l'iniezione di celle a mano libera è facile e richiede un addestramento minimo. Inoltre, la quantità di precursori etichettati iniettati in ogni cervello può essere facilmente messa a punto per ottenere un numero cumulativo sufficiente di precursori scarsamente distribuiti, mantenendo al contempo il numero totale di animali trapiantati. Infine, ma non meno importante, la coiniezione di diversi precursori con etichettatura fluoro, "test" e "controllo" e la successiva analisi statistica a coppie dei risultati contrastano gli effetti della variabilità sperimentale interanimale, consentendo il raggiungimento di significato statistico dei risultati, anche dopo l'analisi di un numero limitato di individui13.
Va sottolineato che, anche se veloce ed economico, questo metodo ha due limitazioni principali. In primo luogo, è progettato per studiare il controllo genico autonomo delle cellule dell'architettura neuronale e non è appropriato affrontare il controllo ambientale. In secondo luogo, poiché i precursori neuronali trapiantati raggiungono la loro posizione finale da un programma eterocronico, questo metodo è preferibile al controllo neuroarchitettonico modello che si verificano oltre il completamento della migrazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Il controllo genico della citoarchitettura neuronale è attualmente oggetto di indagini intensive. Descritto qui è un metodo semplice sviluppato per studiare il controllo genico in vivo della morfologia del neurone di proiezione neocorticale. Questo metodo si basa su (1) ingegneria lentivirale in vitro di precursori neuronali come cellule "test" e "controllo", (2) il loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e (3) la valutazione morfometrica associata dei loro derivati neuronali. In particolare, a questo scopo vengono utilizzati precursori palliali E12.5 provenienti da donatori panneuronali, geneticamente etichettati. Sono progettati per sfruttare i promotori selezionati e la tecnologia tetON/OFF, e vengono trapiantati a mano libera in ventricoli laterali neoalari. Successivamente, al momento della profilazione immunofluorescenza dei cervelli riceventi, le sagome dei neuroni trapiantati vengono inserite nel software open source NeurphologyJ, vengono estratti i loro parametri morfometrici e vengono calcolati i dati di lunghezza e diramazione medici. Rispetto ad altri metodi, questo offre tre vantaggi principali: permette di ottenere un controllo fine dell'espressione transgenica a costi accessibili, richiede solo competenze chirurgiche di base e fornisce risultati statisticamente affidabili dopo l'analisi di un numero di animali. A causa del suo design, tuttavia, non è sufficiente affrontare il controllo non autonomo delle cellule della neuroarchitettura. Inoltre, dovrebbe essere preferibilmente usato per studiare il controllo della morfologia neurite dopo il completamento della migrazione neuronale. Nella sua formulazione attuale, questo metodo è squisitamente sintonizzato per studiare il controllo genetico dell'architettura neocorticale glutamatergica. Approfittando delle linee transgeniche che esprimono EGFP in altri tipi specifici di cellule neurali, può essere riutilizzato per affrontare il controllo genico della loro architettura.

Esistono cinque set di dati primari che forniscono informazioni utili sugli aspetti chiave della procedura, il primo è (1) l'efficienza della trasduzione e co-trasduzione dei precursori neurali da parte dei vettori lentivirali. (2) Un esempio di caratteristiche chiave dei promotori impiegati per guidare il "gene di prova". (3) Un esempio di cellule ingegnerizzate pronte per il trapianto. (4) Una vignetta che include i dettagli procedurali chiave della microiniezione cellulare nel cervell...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è la valutazione dell'effetto delle manipolazioni dell'espressione genica sull'architettura neuronale corticale in vivo. Il nostro primo vantaggio chiave di questa procedura rispetto a quelli basati su un'elettroporazione neutra, è il controllo fine dei livelli di espressione genica. Nello specifico, questa pipeline integrata consente la valutazione in vivo del difetto, esaltata da piccoli cambiamenti nell'espressione genica sul controllo della citoarchitettura neuronale.Inoltre, la struttura a coppie del test di trapianto consente un'enorme riduzione del numero di animali necessaria per ottenere risultati statisticamente significativi. La tecnica sfrutta un pool precursore proveniente da embrioni transgenici Tau EGFP. Questa piscina è suddivisa in due sottocomacchi che sono in alternativa infettati da due miscele lentivirali.Per ottenere un pool di test verde e un pool di controllo giallo che verrà co-iniettato. Dopo due giorni di espansione in vitro, le sfere neurologiche risultanti vengono dissociate, mescolate una a una e iniettate con un capillare nello spazio ventricolare del topo. Dieci giorni dopo, viene eseguita l'immunofluorescenza sulle sezioni coronali per consentire il confronto tra i neuroni di test e controllo.Infine, le sezioni immunostained vengono immagini e scheletrate per la valutazione finale dei parametri morfometrici. Prima del trapianto in vivo, preparare la piscina verde precursore. Gli embrioni E12.5, raccolti da una diga incinta precedentemente accoppiata a un fondatore di Tau EGFP, sono incastonati in singoli pozzi di una piastra multi-pozzo in soluzione PBS.Genotipi rapidamente mediante ispezione visiva sotto una lampada a luce blu. Dissociare le cortici verdi sezionate in singole cellule. Sospendere di nuovo le celle in un supporto proliferatore e suddividerle in due sottocomigruppo di dimensioni uguali.Infettare ogni sotto-piscina con un mix lentivirale dedicato. Ogni mix contiene virus con etichetta rossa o virus di controllo nero. Così come i virus per il transgene o l'espressione di controllo guidata da Tet-Off, rispettivamente.Ogni lentivirus deve essere somministrato a molteplicità di infezione di 8. Placcare le cellule infette in mezzo proliferativo con 2 microgrammi per millilitro di doxiciclina. Trasferire le cellule nell'incubatrice e lasciarle per 2 giorni a 37 gradi.Dopo 2 giorni, le due sottocome pozze devono apparire come sospensioni di piccole neurosfere. Esprimere in modo omogeneo la proteina fluorescente rossa, o no. Dopo l'ingegneria dei precursori, impostare un array di valutazione per il trapianto nei cuccioli di laboratorio bianchi P0.Utilizzare i capillari in vetro borosilicato con diametro eterno e interno pari rispettivamente a 1,5 millimetri e 1,12 millimetri. Tirare il capillare con un estrattore P1000. Per prima cosa, inserisci il programma di trazione.In secondo luogo, posizionare il capillare nei supporti e stringerli. In terzo luogo, avviare il programma e prendere i due microcapillari tirati. Tagliare la punta capillare, a mano con un bisturi, sotto lo stereomicroscopio per ottenere una punta con un diametro esterno di 200-250 micrometri.Infine, posizionare i capillari sul supporto di plastilina in una piastra di Petri chiusa e trasferirli sotto il cofano. Disinfettare le fibre ottiche e posizionarle sotto il cofano. Mescolare le miscele master EGTA e Fast Green, per preparare la soluzione di tracciante cellulare e posizionarla di nuovo sotto il cofano.Tagliare piccoli pezzi di pellicola di tenuta di laboratorio per l'avvistamento delle sospensioni cellulari. E infine, preparare una soluzione di 1 milligrammo per millilitro di doxiciclina sterile smaltita in una siringa da 0,3 millilitro. Il tubo di iniezione viene preparato da due tubi di lattice.Fissare un bocchino in plastica dura a un'estremità di un tubo di lattice. Quindi, fissare il supporto capillare a un'estremità dell'altro tubo di lattice. Collegare le estremità libere dei due tubi di lattice da un filtro sterile da 0,45 micrometri, come barriera contro i germi dell'operatore.Posizionare l'assieme del tubo aspiratore risultante su un supporto di plastilina da tenere sotto il cofano. Raccogliere, testare e controllare le neurosfere in tubi separati. La neurosfera centrifuga le sospensioni e sostituisce il supernatante con pbs.Ripetere questa sequenza altre due volte. Centrifugare le sospensioni della neurosfera, sostituire il supernatante con la soluzione di tripina e pipettare il pellet cellulare su e giù, 4, 5 volte. Lasciare le cellule nell'incubatrice per cinque minuti per ottenere una singola sospensione cellulare.Bloccare la tripina con soluzione inibitore della tripina. Centrifugare le cellule e sospenderle di nuovo in mezzo proliferatore fresco. Contare le cellule dei due pool e regolarne la concentrazione a 100.000 cellule per microlitro, in mezzo proliferatore.Quindi, mescolare le cellule di prova e controllo 1:1 e controllare la miscela risultante al microscopio a fluorescenza. Infine, posizionare il mix sul ghiaccio sotto il cofano. Preparare la gabbia con la madre e i cuccioli su un tavolo lontano dalla zona operatoria chirurgica.Metti una gabbia di recupero su un carrello. Metti una miscela di segatura prelevata dalla gabbia della madre sul fondo e metti la gabbia di recupero sotto una lampada. A parte, imposta una ghiacciaia coperta da un foglio di alluminio per l'anestesia dei cuccioli P0.Appena prima del trapianto, aggiungere un volume da 1 a 10 di soluzione di tracciante cellulare a un volume di sospensione cellulare e individuare tre microlitri del mix risultante su un pezzo di pellicola di tenuta di laboratorio. Posizionare il cucciolo sul foglio di alluminio fresco per un minuto e verificare che sia completamente anestetizzato. Nel frattempo, aspirare i 3 microlitri di iniezione mescolare nel capillare di vetro.Pulire delicatamente la testa del cucciolo anestetizzato con il 70% di etanolo. Successivamente, individuarlo sulla fibra ottica, per identificare chiaramente gli emisferi corticali. Entra nel capillare nella parte anteriore e accedi alla cavità ventricolare.Mentre lo fai, presta attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni. Per prevenire danni all'eminenza ganglionica, ruotare l'ago lateralmente di trenta gradi. Iniettare delicatamente le cellule nella cavità e monitorarne la diffusione per mezzo di Fast Green.Aspetta da cinque a dieci secondi. Rimuovere l'ago di vetro, facendo attenzione a non aspirare la sospensione cellulare e scartarla in un bidone di smaltimento adatto. Prima del recupero dei cuccioli dall'anestesia, iniettare 150 microlitri di soluzione doxy intraperitonealmente, per mantenere l'espressione transgenica ancora spenta dopo il trapianto.Dopo l'iniezione, posizionare immediatamente i cuccioli sotto la lampada per il recupero. Lascia i cuccioli lì per cinque o dieci minuti e, una volta che sono completamente svegli, mettili nella gabbia con la madre. Osserva i cuccioli operati per due o tre ore, per assicurarti che la madre li accetti.Fornire alla gabbia acqua potabile contenente 0,5 mg/mL di doxiciclina e saccarosio, per mantenere disattivata l'espressione transgenica. Sostituire la doxiciclina contenente acqua con acqua priva di ossossidi quattro giorni dopo il trapianto. Attivando così il trans-gene nei neuroni postmitotici.Tenere i topi in un regime privo diossidi per sei giorni ed eutanasiarli a P10. Riparare i cervelli dai cuccioli eutanasiati nel 4%PFA, a quattro gradi, durante la notte. Rimuovere la soluzione PFA e sostituirla con una soluzione di saccarosio al 30%.Lasciare il cervello a quattro gradi fino ad affondare sul fondo del flaconcino. Trasferire il cervello in uno stampo di incorporamento usa e getta circa la metà riempito con mezzo di crio-inclusione. Congelare il cervello incluso a 80 gradi.Tagliare sezioni coronali spesse 60 micron usando un criostato. Sezioni di processo per immunofluorescenza anti-GFP, anti-RFP e controsostenirle con soluzione DAPI. Impostare i parametri di lavoro del microscopio confocale in modo appropriato, come mostrato.Raccogli immagini di fette immunosonalisi, selezionando campi fotografici positivi ricchi di neuroni GFP ciechi di distribuzione del segnale RFP. Esportare le immagini come file ND2 e generarne il numero massimo di proiezioni z come file TIFF. Per consentire la successiva scheletrizzazione neuronale cieca del genotipo cellulare, nascondere il segnale rosso.A tale fine, aggiungere un livello di regolazione. Selezionare i livelli, selezionare rosso. Impostare l'output su zero.E salvare il file in quanto tale. La scheletrizzazione viene successivamente eseguita da un nuovo operatore, che non aveva accesso precedente ai file rossi semplici originali. Per ogni file rosso nascosto, aprite il file, aggiungete un livello di disegno all'immagine principale e selezionate lo strumento matita.Traccia l'somer sulla base del segnale GFP. Quindi, traccia i neuriti. Infine, salva il file del mutlilayer, comprese le sagome neuronali.L'analisi successiva degli scheletri neuronali può essere eseguita da entrambi gli operatori. Aprite ogni file mulitlayer, create nuovi file vuoti in scala di grigi a 16 bit con sfondo nero. Uno per neurone.Copiare e incollare singole siluenze neuronali, dall'immagine primaria, ai file in scala di grigi. Torna al file multistrato e disattiva il livello di regolazione per svelare i genotipi neuronali. Salvare i file in scala di grigi a 16 bit, annotando i genotipi neuronali corrispondenti.Importare immagini in scala di grigi in ImageJ una per una e analizzare gli scheletri tramite il plug-in NeurphologyJ. Raccogliere i dati primari selezionati di NeurofrologiaJ, l'area totale della lunghezza della neurite, i punti di attacco e i punti finali, in un foglio di calcolo e impiegarli per calcolare parametri morfometrici secondari. Il protocollo ingegneristico che proponiamo consente di cotradurre la stragrande maggioranza dei neuroni oggetto di indagine, con i set di transgeni previsti.Inoltre, consente di raggiungere una sostanziale omogeneità dei livelli di espressione transgena all'interno della popolazione cellulare trasdutta. Una caratteristica chiave della nostra procedura, è la sua configurazione accoppiata. Un test e un pool di precursori di controllo sono progettati separatamente, mescolati 1:1 e infine co-trapiantati.Questo approccio accoppiato faciliterà l'individuazione delle differenze di risultati specificamente legate a genotipi distinti. In questo esempio, abbiamo analizzato sezioni coronali di cuccioli trapiantati, dieci giorni dopo la co-iniezione intervenicolare dei precursori dei neuroni e di quelli di controllo che esprimono troppo Foxg1. Le immagini di gruppi di neuroni sono state acquisite con microscopia confocale.I file dello stack Z sono stati utilizzati per calcolare il numero massimo di proiezioni. Le sagome neuronali sono state tracciate manualmente. Qui, le sagome verdi e gialle rappresentano rispettivamente i neuroni foxg1 che esprimono e controllano troppo.Infine, i parametri primari ottenuti dall'analisi neurfrologiaJ, sono stati impiegati per il calcolo degli indici morfometrici secondari, come illustrato. Questo è un semplice protocollo che consente al ricercatore di valutare l'impatto che l'espressione mista di un dato gene, può esercitare sul controllo fine dello sviluppo di neurite darth in vivo. I principali vantaggi di questo protocollo sono due.Il numero esistente di geni coinvolti nella morfogenesi neuronale può essere funzionalmente caratterizzato in vivo, in assenza delle corrispondenti linee teratogeniche. E sono necessari meno animali per l'analisi per ottenere i risultati statistici significativi.

Research

JoVE Journal

Genetics

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