Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

私たちは、この手順の早期設定に彼の貢献のためにMihn Duc Doに感謝します。

ここに記載されているすべての方法および手順は、SISSAオルガニスト・アル・ベネッセア・アニマル(SISSA IACUC)によって承認されています。
1. エンジニアリングされた「グリーン」前駆子プールの生成
<ol><li>「緑」プールの準備
	<ol>
<li>MtaptEGFP/+創設者16と野生型 CD1 メスを合致します。12.5日後の子宮頸部脱臼により妊娠中の?...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

この手順の特定の側面/手順は重要であり、特別な注意が必要です。第一に、(a)オペレータは、BSL-2準拠のラボ環境でレンティウイルスを安全に操作するために十分な事前訓練を受ける必要があります。第二に、(b)神経製剤を混合する前に、必要に応じて2つの対応する神経球懸濁液を慎重に洗浄することが必須であり、不要なレンチウイルスによる2つの製剤の遅延クロス感染を防ぐために引?...

ここでは、ニューロン細胞構造の生体内遺伝子制御を解剖するために開発した簡単な方法について述述びます。神経前駆体のインビトロ工学に基づいて、新生児脳への移植と「テスト」および「制御」細胞の対化形態評価に基づいて、ニューロン形態の細かい制御における試験遺伝子の機能的影響を明らかにすることができる。高速かつ手頃な価格の方法。ニューロンアーキテクチャの生体内遺伝子制御を調べるには、(1)適切にパターン化された遺伝子(GOI)発現と正確な定量的制御の達成という3つの重要な技術的課題に取り組む必要があります。(2)異なるニューロンシルエットの適切にセグメント化された可視化を得ること。(3)限られた数の動物を用いながら、結果の統計的有意性を引き出す。
利用可能な場合、テトラサイクリン(tet)制御トランスジーンを収容するマウス変異線は、最初の問題1に対処するための最良のツールである可能性があります。あるいは、体性トランスジェネシスが採用されてもよい。このような場合、トランスジーンは、エレクトロポレーション2またはウイルス伝達3を介して送達される。次に、エピソームとして保持される(例えば、標準的なエレクトロポレーション4)、またはゲノムに統合される(ランダムに、レトロウイルスインテグラーゼ5;または定義された場所に、CRISPR促進相同組換え(SLENDR)6).
第二に、ニューロンシルエット可視化は、(a)まばらな均一標識または(b)緻密な差分標識を介して達成され得る。まばらな標識に関しては、高度なゴルジ様方法論7を用いてもよいし、選択されたニューロンミニセットはバイオシシン8で充填することができ、また、まばらに発現したトランスジーンのおかげで塩およびコショウ標識を得ることができる。このようなトランスジーンは、可変転写(Thy-EGFP)9を表示してもよいし、確率的組換え(MORF)10によって活性化されてもよい。(b)に関しては、最先端の戦略には、多フロキ散性フルオロプロテイントランスジーン配列(Brainbow)11内のクレ媒介確率的組換え、ならびにピギーバクトランスポサーゼ駆動のフルオロタンパク質遺伝子のゲノム統合が含まれる。体細胞トランスジェネシス(CLoNE)12を介して配信されます。
第3の問題に関しては、形態学的結果は、多くの場合、動物間の違いと細胞注入の不測の事態に起因する大きなランダム変動の影響を受けます。このため、GOI形態測定活性を評価するために必要な統計的な力を達成するために、通常、多数の動物が使用されます。
前述のアプローチは、高度な技術的スキルに依存することが多く、目立つ財源を必要とし、科学界内での拡散を制限する可能性があります。これらの問題を回避するために、我々は迅速かつ手頃な方法で生体内の神経構造の遺伝子制御を解剖するための簡単で簡単なパイプラインを考案しました。これは、抗芽細胞トランスジーン活性13の高速生体内評価のために以前に開発された同様の共同移植設計に触発される。
具体的には、インビトロで「緑色」の神経前駆体(「テスト」と「制御」細胞)を「黒」レシピエント新生児脳に同時に移植すると、上記の3つの重要な問題を同時に修正できると考えられている。実際、前駆体のインビトロレンチウイルス工学では、十分に制御された条件下で、ニューロントランスジーン発現の変動性の維持を可能にし、通常は生体内の体系操作に関連するよりもはるかに低い(以前に行われた)14歳,15と私たちの未発表の結果で)。得られた遺伝子発現の正確な制御は、tet制御トランスジェニックモデルによって達成されるものと同等である。しかし、この手順のコストは、トランスジェニックマウスラインのメンテナンスに起因するものよりもはるかに低いです。次に、自由な手の細胞注入は容易で、最低の訓練を必要とする。さらに、各脳に注入される標識された前駆体の量は、移植された動物の総数を最小限に抑えながら、まばらに分布する前駆体の十分な累積数を達成するために容易に調整することができる。最後に、異なるフルオロ標識の共注入、"テスト"と"制御"前駆体およびその後のペアワイズ統計分析は、動物間実験変動の影響を打ち消し、結果の統計的有意性は、限られた数の個人の分析でも13.
高速かつ安価であるにも関しては、この方法には2つの主な制限があることを強調する必要があります。第一に、神経構造の細胞自律遺伝子制御を調べるように設計されており、環境制御に取り組むのは適切ではない。第二に、移植された神経前駆体がヘテロクロニクススケジュールによって最終位置に達するにつれて、この方法は、過去の移行完了が起こる神経設計制御をモデル化することが好ましい。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

ニューロン細胞構造の遺伝子制御は、現在、集中的な研究の対象である。ここで説明する、新生物投影ニューロン形態の生体内遺伝子制御を研究するために開発された簡単な方法である。この方法は、(1)ニューロン前駆体の「試験」および「制御」細胞のインビトロレンチウイルス工学、(2)野生型脳へのそれらの共移植、および(3)それらの神経誘導体の対対形態評価に基づいている。具体的には、この目的のために、パンニューロン由来のE12.5pallial前駆体、遺伝的標識ドナーが用いられる。それらは選択されたプロモーターおよびtetON/OFFの技術を利用するように設計され、新生児の横心室に自由に移植される。その後、レシピエント脳の免疫蛍光プロファイリングに際して、移植されたニューロンのシルエットをNeurphologyJオープンソースソフトウェアに送り込み、それらの形態パラメータを抽出し、平均長さと分岐指数を算出する。他の方法と比較して、この1つは3つの主要な利点を提供する:それは手頃な費用でトランスジーン発現の細かい制御を達成することを可能にし、それは基本的な外科的スキルを必要とし、限られた分析の場合に統計的に信頼できる結果を提供する動物の数。しかし、その設計のため、神経アーキテクチャの非細胞自律制御に対処するには不十分です。さらに、神経移動の完了後にニューライト形態制御を調べるために好ましくは用いるべきである。本製剤では、この方法は、グルタマチング性新生物神経系統アーキテクチャの遺伝子制御を調べるために絶妙に調整されている。EGFPを発現するトランスジェニックラインを他の特定の神経細胞タイプで利用して、そのアーキテクチャの遺伝子制御に対処するために再利用することができる。

手順の主要な側面に関する有用な情報を提供する5つの主要なデータセットがあり、最初のは(1)レンチウイルスベクターによる神経前駆体の伝達および共伝導の効率である。(2)「試験遺伝子」を駆動するために用いられるプロモーターの主な特徴の一例。(3)移植準備ができている工学的細胞の例。(4)新生児脳への細胞マイクロインジェクションの主要な手続き上の詳細...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

神経前駆体のインビトロレンチウイルス工学、野生型脳への共同移植、および「テスト」および「コントロール」誘導体の対対モルモメトリック評価に基づいて、この方法は、新生児の生体内遺伝子制御における正確なモデリングを可能にするシンプルで手頃な方法でニューロン形態。

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

この技術の全体的な目的は、生体内の皮質神経細胞アーキテクチャに対する遺伝子発現操作の効果の評価である。中性エレクトロポレーションに基づくものに対するこの手順の最初の重要な利点は、遺伝子発現レベルの細かい制御です。具体的には、この統合パイプラインは、ニューロン細胞アーキテクチャの制御上の遺伝子発現の小さな変化によって高揚欠陥のin vivo評価を可能にする。さらに、移植検査の対構造は統計的に有意な結果を得るために必要な動物数の巨大な減少を可能にする。この技術は、タウEGFPトランスジェニック胚由来の前駆体プールを利用する。このプールは、2 つのレンチウイルスミックスに感染する 2 つのサブ プールに分けられます。緑のテスト プールと、共注入される黄色のコントロール プールを取得します。2日間のインビトロ拡張の後、得られた神経球は、関連付けを解除し、1対1で混合し、マウス心室空間に毛細血管を注入する。10日後、冠状動脈切片の免疫蛍光が行われ、検査と制御ニューロンの比較が可能となる。最後に、免疫染色されたセクションは、モルフォメトリクスパラメータの最終評価のために画像化および骨格化される。インビボ移植の前に、前駆体グリーンプールを準備する。以前にタウEGFPの創設者に交配された妊娠中のダムから収穫されたE12.5胚は、PBS溶液中のマルチウェルプレートの個々の井戸にセットされている。青色光灯下で目視検査を行い、素早くジェノタイプを行います。解剖された緑色の皮質を単一細胞に関連付け解除する。増殖培地中の細胞を再中断し、2つの等しいサイズのサブプールに細分化する。専用のレンチウイルスミックスで各サブプールに感染します。各ミックスは、赤いラベルウイルスや黒コントロールウイルスが含まれています。Tet-Off駆動トランスジーンまたはコントロール発現に対するウイルスと同様に、それぞれ。各レンチウイルスは、感染の多重性8で投与されなければならない。感染した細胞を、ドキシサイクリン1ミリリットル当たり2マイクログラムの増殖培地に入れなさい。細胞を培養器に移し、37度で2日間放置します。2日後、2つのサブプールは小さな神経球の懸濁液として現れなければならない。赤色蛍光タンパク質を均質に発現するかしないか。前駆体の工学の後、P0白色の実験室の子犬の移植のための評価配列を設定する。ボロケイ酸ガラスの毛細血管を、それぞれ1.5ミリメートルと1.12ミリメートルに等しい永遠の直径と内径で使用します。P1000プーラーでキャピラリーを引っ張ります。まず、引っ張るプログラムを入力します。第二に、キャピラリーをホルダーに入れ、締めます。3つ目は、プログラムを開始し、2つの引っ張られたマイクロキャピラーを取ります。毛細管先端をメスで手で切り、実体顕微鏡下で、外径200~250マイクロメートルの先端を得る。最後に、密閉したペトリ皿の中にプラスチック製の支柱に毛細血管を置き、ボンネットの下に移します。光ファイバーを消毒し、ボンネットの下に置きます。EGTAとファストグリーンのマスターミックスを混ぜて、セルトレーサー溶液を準備し、ボンネットの下に再び置きます。細胞懸濁液スポッティング用の実験室用シーリングフィルムの小片をカットします。そして最後に、0.3ミリリットルシリンジに配置したミリリットルの滅菌ドキシサイクリン当たり1ミリグラムの溶液を調製する。注入の管は2つのラテックス管から準備される。硬いプラスチック製の口の部分をラテックスチューブの一方の端に固定します。次に、キャピラリーホルダーを他のラテックスチューブの一方の端に固定します。オペレータ細菌に対する障壁として、0.45マイクロメートルの滅菌フィルターから2つのラテックスチューブの自由端を接続します。得られたアスピレーターチューブアセンブリをプラスチックホルダーの上に置き、ボンネットの下に保管します。別々のチューブで神経球を収集、テスト、制御します。遠心分離神経球懸濁液とPBSによって上清を置き換えます。このシーケンスをさらに 2 回繰り返します。遠心分離機神経球懸濁液は、トリプシン溶液により上清を交換し、細胞ペレットを上下にピペットして、4,5回行う。インキュベーターに細胞を5分間放置し、単一の細胞懸濁液を得る。トリプシン阻害剤溶液でトリプシンをブロックします。遠心分離細胞は、新たな増殖培地に再懸濁した。2つのプールの細胞を数え、増殖培地中の1マイクロリットル当たり100,000細胞に濃度を調整する。次に、試験細胞と対照細胞1:1を混合し、得られた混合を蛍光顕微鏡で確認する。最後に、ボンネットの下の氷の上にミックスを置きます。母親と子犬と一緒にケージを準備し、外科手術領域から遠く離れたテーブルの上に。カートに回復ケージを置きます。母親のケージから採取したおがくずを底に置き、回収ケージをランプの下に置きます。脇に、P0の子犬の麻酔のためのアルミ箔で覆われたアイスボックスを置きます。移植の直前に、1〜10体積の細胞トレーサー溶液を1体積の細胞懸濁液に加え、得られた混合物の3マイクロリットルを実験室のシーリングフィルムに入れる。子犬を冷たいアルミホイルの上に1分間置き、完全に麻酔が付いされていることを確認します。一方、3マイクロリットルの注入をガラスキャピラリーに吸引する。麻酔した子犬の頭を70%エタノールで静かに拭きます。次に、光ファイバー上に位置し、皮質半球を明確に同定する。前部に毛細血管を入れ、心室の空洞にアクセスする。それをしながら、血管を損傷しないように注意してください。神経節性のエミネンスの損傷を防ぐために、針を横に30度回転させます。細胞を空洞に静かに注入し、高速グリーンによる拡散を監視します。5 秒から 10 秒待ちます。ガラス針を取り外し、細胞懸濁液を吸引しないようにし、適当な処分ビンに廃棄する。麻酔から回復する前に、150マイクロリットルのドキシ溶液を腹腔内に注入し、移植後もトランスジェニック発現をオフに保つ。注射後、子犬をランプのすぐ下に置いて回復します。子犬は5〜10分間そこに残し、彼らが完全に目を覚ましたら、母親と一緒にケージに入れます。母親がそれらを受け入れることを確実にするために、2〜3時間手術された子犬を観察してください。0.5mg/mLドキシサイクリンとスクロースを含む飲料水をケージに供給し、トランスジェニック発現をオフに維持します。水を含むドキシサイクリンを、移植の4日後にドキシフリー水に交換してください。このようにポストミトティックニューロンにおけるトランス遺伝子を活性化する。マウスを6日間ドキシフリーの体制に保ち、P10で安楽死させる。4%PFAで安楽死した子犬から脳を一晩4度で固定します。PFA溶液を取り出し、30%スクロース溶液に交換してください。彼らはバイアル底に沈むまで4度で脳を残します。脳を、クライオ包み込み培地で満たされた使い捨て型に移します。含まれる脳を80度でフリーズします。クライオスタットを使用して、厚さ60ミクロンのコロナセクションをカットします。抗GFP、抗RFP免疫蛍光および逆染色のためのセクションをDAPI溶液で処理します。共焦点顕微鏡の作業パラメータを図示に応じて適宜設定する。RFPシグナル分布の盲目のGFP陽性ニューロンリッチ写真場を選択し、免疫測定スライスの写真を収集します。イメージを ND2 ファイルとしてエクスポートし、TIFF ファイルとしてそれらの最大 Z 投影を生成します。細胞遺伝子型のその後のニューロンの骨格化ブラインドを可能にするには、赤い信号を隠す。これを行うには、調整レイヤーを追加します。レベルを選択し、赤を選択します。出力をゼロに設定します。そして、そのようにファイルを保存します。スケルトン化は、元のプレーンな赤いファイルに以前アクセスがなかった新しいオペレータによって実行されます。非表示の赤いファイルごとに、ファイルを開き、プライマリ イメージに描画レイヤを追加して、鉛筆ツールを選択します。GFP 信号に基づいて、サマーをトレースします。次に、神経突起をトレースします。最後に、ニューロンのシルエットを含むマルチレイヤー ファイルを保存します。ニューロン骨格の後続の解析は、どちらのオペレータでも行うことができる。各マルチレイヤ ファイルを開き、黒の背景を持つ新しい空の 16 ビットグレースケール ファイルを作成します。ニューロンごとに1つ。プライマリ イメージからグレースケール ファイルに、単一のニューロンのシルエットをコピーして貼り付けます。多層ファイルに戻り、調整レイヤーをオフにして神経遺伝子型を明らかにします。16 ビットのグレースケール ファイルを保存し、対応するニューロンの遺伝子型に対して名前を付けます。ImageJでグレースケール画像を1つずつインポートし、NeurphologyJプラグインでスケルトンを分析します。選択したNeurophologyJのプライマリデータ、ニューライト長さの総面積、アタッチメントポイント、終点をスプレッドシートに収集し、それらを使用して二次形態測定パラメータを計算します。我々が提案する工学プロトコルは、意図されたトランス遺伝子セットと、調査の対象となるニューロンの大部分を一緒に変換することを可能にする。さらに、トランスジタナイズされた細胞集団内のトランスジーン発現レベルの実質的な均一性を達成することを可能にする。私たちの手順の重要な特徴は、ペアリングされた構成です。テストとコントロール前駆体プールは別々に設計され、1:1を混合し、最終的に共同移植される。この対になったアプローチは、特異的に異なる遺伝子型にリンクされた結果差の検出を容易にする。この例では、Foxg1過剰発現ニューロン前駆体および制御ニューロンの脳室間共注射から10日後に、移植された子犬の冠状動脈切片を分析した。ニューロンのグループの画像は共焦点顕微鏡で取得した。Z スタック ファイルは、最大投影法の計算に使用されました。ニューロンのシルエットを手動でトレースした。ここでは、緑と黄色のシルエットはそれぞれFoxg1過剰発現ニューロンと制御ニューロンを表します。最後に、NeurphologyJ解析によって得られた一次パラメータを、図示されるように二次形態測定指標の計算に用いた。これは、研究者が所定の遺伝子の混合発現がインビボでの神経突起発生の微細制御に及ぼす影響を評価することを可能にする単純なプロトコルである。このプロトコルの主な利点は2です。神経形態形成に関与する既存の数の遺伝子は、対応する催奇形線の存在下で、機能的に生体内で特徴づけることができる。また、有意な統計的結果を得るために分析に必要な動物は少なくなります。

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...