Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

우리는이 절차의 초기 설정에 그의 기여에 대한 미안 덕 도 감사합니다.

여기에 설명된 모든 방법 및 절차는 SISSA Organismo preposto al Benessere Animale(SISSA IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 엔지니어링 "녹색"선조 풀의 생성
<ol><li>"녹색"풀의 준비
	<ol>
<li>MtaptEGFP/+ 설립자16과야생 형 CD1 암컷을 짝짓기 . 임신한 댐을 자궁경부 전위 후 12.5일(0일째)에서 안락사시키고 배아12.5(E12.5) 배아를 수확한다. 차가운 PBS 용?...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

이 절차의 특정 측면/단계는 매우 중요하며 특별한 주의가 필요합니다. 첫째, (a) 운영자는 BSL-2 를 준수하는 실험실 환경에서 렌티바이러스를 안전하게 조작할 수 있도록 적절하게 사전 교육을 받아야 합니다. 둘째, (b) 신경 제제를 혼합하기 전에, 설명된 바와 같이 두 개의 상응하는 신경구 현탁액을 조심스럽게 세척하여, 원치 않는 렌티바이러스로 인한 두 제제의 지연된 교차 감염을 방지하기 ?...

여기에서 우리는 우리가 신경 세포 건축의 생체 내 유전자 통제를 해부하기 위하여 개발한 간단한 방법을 기술합니다. 신경 전구체의 시험관 내 공학에 기초하여, 신생아 뇌로의 이식 및 "테스트"와 "제어"세포의 쌍 형태 평가, 그것은 에서 신경 형태학의 미세 한 제어에 테스트 유전자의 기능적 의미를 공개 할 수 있습니다 빠르고 저렴한 방법. 뉴런 아키텍처의 생체 내 유전자 제어를 조사하려면 세 가지 주요 기술적 문제를 해결해야 합니다: (1) 적절한 패턴의 유전자(GOI) 발현및 정확한 정량적 제어를 달성하는 것; (2) 뚜렷한 뉴런 실루엣의 적절히 분할된 시각화를 얻는 것; (3) 제한된 수의 동물을 고용하면서 결과의 통계적 유의성을 유도한다.
가능하면, 테트라사이클린(tet)-제어형 트랜스게네전지유전자를 항하는 마우스 돌연변이선은제1호를 해결하는 가장 좋은 도구일 수 있다. 대안적으로, 체세포 성 족제는 채택될 수 있다. 이러한 경우, 이식유전자는 전기천공2 또는 바이러스성 전달3을 통해 전달된다. 다음으로, EPIsome (예를 들어, 표준 전기 포더레이션4시) 또는 게놈에 통합됩니다 (무작위로, 레트로바이러스 인테그라제 5를 통해; 또는 정의된 위치에서, CRISPR 촉진 상동성 재조합 (SLENDR)6 ).
둘째, 뉴런 실루엣 시각화는 (a) 희소 균일 한 라벨링 또는 (b) 조밀한 차동 라벨링을 통해 달성될 수 있다. 희소라벨링에 관해서는, 고급 골지유사 방법론은 7,선택된 뉴런 미니세트는 바이오시틴8에의해 채워질 수 있고, 염-후추 라벨링은 희소하게 발현된 트랜스유전자 덕분에 얻어질 수 있다. 이러한 이식유전자는 변종 전사(Thy-EGFP) 9를 표시하거나 단층 재결합(MORF)(MORF)에의해 활성화될 수 있다. (b)에 관해서는, 최첨단 전략은 다중 플록스형 형광단백질 이식유전자 어레이(Brainbow)11,뿐만 아니라 피기박-트랜스포사아제 구동 형단백질 유전자의 게놈 통합, 이전에 내의 Cre-중재된 확률재조합을 포함한다. 체세포 전염 (CLoNE)을 통해 전달12.
세 번째 문제에 관해서는, 형태 측정 결과는 종종 동물 간 차이 및 세포 주입 사태에서 기인하는 큰 무작위 가변성에 의해 영향을 받습니다. 이 때문에, 많은 수의 동물들이 일반적으로 GOI 형태 측정 활성을 평가하는 데 필요한 통계적 힘을 달성하기 위해 사용된다.
앞서 설명한 접근법은 종종 고급 기술 기술에 의존하고 과학계 내에서 확산을 제한할 수 있는 눈에 띄는 재정 적 자원이 필요합니다. 이러한 문제를 피하기 위해, 우리는 빠르고 저렴한 방법으로 생체 내에서 신경 아키텍처의 유전자 제어를 해부하는 쉽고 간단한 파이프 라인을 구상했다. 이는 항모세포 이식 유전자 활성(13)의 빠른 생체 내 평가를 위해이전에 개발된 유사한 공동 이식 설계에서 영감을 받았다.
구체적으로, 시험관 내 설계 "녹색" 신경 전구체("테스트" 및 "대조군" 세포)를 "검정" 수용자 신생아 뇌로 동시 이식하면 위에 열거된 세 가지 주요 문제를 동시에 해결할 수 있다고 생각됩니다. 사실, 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학, 잘 제어 된 조건에서, 최소의 신경 이식 유전자 발현의 가변성의 유지 보수를 허용, 훨씬 아래 그 일반적으로 생체 내 체세포 조작과 관련된 (이전에 수행 14세 , 15 및 게시되지 않은 결과). 그 결과 유전자 발현의 정확한 제어는 테트 제어 형질전환 모델에 의해 달성된 것과 비교할 수 있다. 그러나, 이 절차의 비용은 형질전환 마우스 라인의 유지 보수에서 유래하는 그보다 훨씬 낮습니다. 다음으로, 자유 로운 손 세포 주입은 쉽고 최소한의 훈련이 필요합니다. 더욱이, 각 뇌에 주입된 표지된 전구체의 양은 이식된 동물의 총 수를 최소한으로 유지하면서, 희소하게 분포된 전구체의 충분한 누적 수를 달성하기 위해 용이하게 조정될 수 있다. 마지막으로, 상이한 불소 표지, "테스트" 및 "제어" 전구체의 공동 주사제 및 결과에 대한 후속 쌍별 통계 분석은 동물 간 실험 가변성의 효과를 중화하여 결과의 통계적 유의성, 심지어 개인의 제한된 수의 분석에 따라13.
빠르고 저렴하지만이 방법은 두 가지 주요 제한 사항이 있음을 강조해야합니다. 첫째, 뉴런 아키텍처의 세포 자율 유전자 제어를 조사하도록 설계되었으며 환경 제어를 해결하는 것은 적절하지 않습니다. 둘째, 이식된 뉴런 전구체가 이종성 스케줄에 의해 최종 위치에 도달함에 따라, 이 방법은 과거 마이그레이션 완료가 발생하는 신경설계학적 제어를 모델링하는 것이 바람직하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

신경 세포 아키텍처의 유전자 제어는 현재 집중적 인 조사의 대상이됩니다. 여기서 설명된 간단한 방법은 신피질 프로젝션 뉴런 형태학의 생체 내 유전자 조절을 연구하기 위해 개발된 간단한 방법이다. 이 방법은 (1) 신경 전구체의 시험관 내 렌티바이러스 공학을 "시험" 및 "대조군" 세포로, (2) 야생형 뇌로의 공동 이식, 및 (3) 그들의 신경 유도체의 쌍형 형태측정 평가에 기초한다. 특히, E12.5 panneuronal에서 창 구체, 유전적으로 표지 된 기증자, 이 목적을 위해 사용 됩니다. 그들은 선택된 프로모터와 tetON /OFF 기술을 활용하도록 설계되었으며 신생아 측삭 실로 자유롭게 이식됩니다. 나중에, 수신자 두뇌의 면역 형광 프로파일링시, 이식된 뉴런의 실루엣은 NeurphologyJ 오픈 소스 소프트웨어로 공급되고, 그들의 형태 측정 파라미터는 추출되고, 평균 길이 및 분기 지수는 계산됩니다. 다른 방법에 비해, 이것은 세 가지 주요 장점을 제공합니다 : 그것은 저렴한 비용으로 이식 유전자 발현의 미세 한 제어를 달성 할 수 있습니다, 그것은 단지 기본적인 수술 기술을 필요로하고, 제한된의 분석에 통계적으로 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다 동물의 수. 그것의 디자인 때문에, 그러나, 신경 건축의 비 세포 자율적인 통제를 다루기 위하여 적시이지 않습니다. 더욱이, 신경이동이 완료된 후 신경외형태 조절을 조사하는 것이 바람직하게는 사용되어야 한다. 본 제형에서, 이 방법은 글루타마테르기성 신피질 뉴런 아키텍처의 유전자 제어를 조사하기 위해 정교하게 조정된다. 다른 특정 신경 세포 유형에서 EGFP를 발현하는 형질전환 라인을 활용하면, 그들의 아키텍처의 유전자 제어를 해결하기 위해 재사용될 수 있다.

절차의 주요 양상에 대한 유용한 정보를 제공하는 5개의 기본 데이터 세트가 있는데, 첫 번째 는 (1) 렌티바이러스 벡터에 의한 신경 전구체 의 환전 및 공동 환전의 효율이다. (2) "시험 유전자"를 구동하기 위해 채용된 프로모터의 주요 특징의 예. (3) 이식 준비가 된 엔지니어링 세포의 예. (4) 신생아 뇌에 세포 미세 주사의 주요 절차 세부 사항을 포함하는 만화. (5) 전체 형?...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

이 기술의 전반적인 목표는 생체 내의 피질 뉴런 아키텍처에 대한 유전자 발현 조작의 효과의 평가입니다. 중성 전기화에 기초한 절차에 대한 이 절차의 첫 번째 주요 장점은 유전자 발현 수준의 미세한 제어입니다. 구체적으로, 이러한 통합 파이프라인은 뉴런 세포구조 조절에 대한 유전자 발현의 작은 변화에 의해 높은 결함의 생체 내 평가를 가능하게 한다.더욱이, 이식 시험의 쌍 구조는 통계적으로 유의한 결과를 얻기 위하여 필요한 동물 수에 있는 거대한 감소를 허용합니다. 이 기술은 타우 EGFP 형질전환 배아에서 유래한 전구체 풀을 이용합니다. 이 풀은 두 개의 렌티바이러스 믹스에 감염되는 두 개의 하위 풀로 세분화됩니다.녹색 테스트 풀과 공동 주입될 노란색 컨트롤 풀을 얻으려면. 체외 팽창의 이틀 후에, 결과 신경 구는 분리되고, 1대 1로 혼합되고, 마우스 심실 공간에 모세관으로 주입됩니다. 10 일 후, 관상 측면에 면역 형광은 테스트 및 제어 뉴런 사이의 비교를 허용하기 위해 수행됩니다.마지막으로, 면역스테인화된 섹션은 형태 매개변수의 최종 평가를 위해 이미지화되고 골격화됩니다. 생체 내 이식 전에 전구체 녹색 풀을 준비하십시오. 이전에 타우 EGFP 설립자와 짝을 이었던 임신 한 댐에서 수확 한 E12.5 배아는 PBS 용액에서 멀티 웰 플레이트의 개별 우물에 설정됩니다.청색 광등 아래에서 육안 검사를 통해 신속하게 유전자형. 해부된 녹색 코르티체를 단일 세포로 분리합니다. 증식 매체에서 세포를 다시 일시 중단하고 두 개의 동등하게 크기의 하위 풀로 세분화합니다.전용 렌티바이러스 믹스로 각 하위 풀을 감염시다. 각 믹스에는 빨간색 라벨 바이러스 또는 블랙 컨트롤 바이러스가 포함되어 있습니다. Tet-Off 구동 된 변형 또는 제어 발현에 대한 바이러스뿐만 아니라 각각.각 렌티바이러스는 8의 감염의 복합성에서 관리되어야 합니다. 독시사이클린의 밀리리터 당 2 마이크로그램으로 증식 배지에 감염된 세포를 플레이트. 세포를 인큐베이터로 옮기고 37도에서 2 일 동안 둡니다.2 일 후, 두 하위 풀은 작은 신경 구의 현탁액으로 나타나야합니다. 균일하게 적색 형광 단백질을 표현하거나 하지 않습니다. 전구체의 엔지니어링 후 P0 백색 실험실 새끼의 이식에 대한 평가 배열을 설정합니다.각각 1.5밀리미터와 1.12밀리미터의 영원하고 내부 직경이 있는 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용합니다. P1000 풀러로 모세관을 당깁니다. 먼저 끌어당기는 프로그램을 입력합니다.둘째, 모세관을 홀더에 넣고 조입니다. 셋째, 프로그램을 시작하고 두 개의 뽑아 낸 미세 모세 혈관을 가져 가라. 모세관 끝을 메스와 함께 손으로 자르고 스테레오 현미경 아래에서 200-250 마이크로미터의 외부 직경으로 팁을 얻습니다.마지막으로, 플라스틱 지지대위에 모세혈관을 닫은 페트리 접시에 놓고 후드 아래에 옮습니다. 광섬유를 소독하고 후드 아래에 놓습니다. EGTA 및 패스트 그린 마스터 믹스를 혼합하여 셀 트레이서 용액을 준비하고 후드 아래에 다시 놓습니다.세포 현탁액 을 위해 실험실 밀봉 필름의 작은 조각을 잘라. 그리고 마지막으로, 0.3 밀리리터 주사기에 배치 된 밀리리터 멸균 독시 사이클린 당 1 밀리그램의 용액을 준비합니다. 사출 튜브는 두 개의 라텍스 튜브에서 제조됩니다.라텍스 튜브의 한쪽 끝에 하드 플라스틱 입 조각을 고정합니다. 그런 다음 모세관 홀더를 다른 라텍스 튜브의 한쪽 끝으로 고정합니다. 운전자 세균에 대한 장벽으로 0.45 마이크로미터 멸균 필터에서 두 라텍스 튜브의 자유 끝을 연결합니다.결과 흡기 튜브 어셈블리를 플라스틱 홀더에 배치하여 후드 아래에 보관합니다. 별도의 튜브에서 신경구를 수집, 테스트 및 제어합니다. 원심 분리 신경권 현탁액및 PBS에 의해 상신을 대체한다.이 시퀀스를 두 번 더 반복합니다. 원심 분리 신경권 현탁액, 트립신 용액에 의해 상체를 교체하고, 세포 펠릿을 위아래로 피펫, 4, 5 회. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 5 분 동안 인큐베이터에 세포를 둡니다.트립신 억제제 용액으로 트립신을 차단합니다. 원심 분리기 세포, 신선한 증식 배지에서 다시 중단. 두 풀의 세포를 계산하고 증식 배지에서 마이크로리터 당 100, 000 세포로 농도를 조정합니다.그런 다음, 테스트 및 제어 세포를 혼합 1:1과 형광 현미경의 밑에 결과 혼합을 확인합니다. 마지막으로, 후드 아래에 얼음에 믹스를 놓습니다. 수술 운영자 지역에서 멀리 떨어진 테이블에 어머니와 새끼와 함께 케이지를 준비합니다.복구 케이지를 카트에 놓습니다. 어머니의 케이지에서 가져온 톱밥을 바닥에 넣고 복구 케이지를 램프 아래에 놓습니다. 옆으로, P0 새끼의 마취를위한 알루미늄 호일로 덮여 얼음 상자를 설정합니다.이식 직전에 1-10부분량의 세포 추적제 용액을 1부세포 현탁액에 추가하고, 실험실 밀봉 필름의 조각에 생성된 혼합물의 3개의 마이크로리터를 발견한다. 시원한 알루미늄 호일에 1분간 새끼를 놓고 완전히 마취되어 있는지 확인합니다. 한편, 유리 모세관에 주입 믹스의 3 마이크로 리터를 흡인.마취 된 강아지의 머리를 70 %에탄올로 부드럽게 닦으십시오. 다음으로, 광섬유에 위치하여 피질 반구를 명확하게 식별합니다. 앞쪽에 모세관을 입력하고 심실 구멍에 액세스합니다.그 일을 하는 동안, 혈관을 손상 하지 주의. 신경절 눈명성의 손상을 방지하기 위해, 30도 에 의해 측면으로 바늘을 회전. 부드럽게 구멍에 세포를 주입하고 빠른 녹색을 통해 자신의 확산을 모니터링합니다.5~10초 동안 기다립니다. 유리 바늘을 제거하고 셀 서스펜션을 흡인하지 않도록 주의하고 적절한 폐기 쓰레기통에 버리십시오. 마취에서 강아지 회복하기 전에, 이식 후 트랜스 제닉 발현을 유지하기 위해 내회적으로 독시 용액150 마이크로 리터를 주입하십시오.주입 후, 복구를 위해 램프 바로 아래에 새끼를 놓습니다. 새끼를 5~10분 동안 그곳에 두고 완전히 깨어 나면 어머니와 함께 케이지에 놓습니다. 수술된 새끼를 2~3시간 동안 관찰하여 어머니가 새끼를 받아들이도록 하십시오.0.5mg/mL 독시사이클린과 자당을 함유한 식수를 케이지에 공급하여 형질표현을 유지한다. 이식 4일 후에 물을 함유한 독시사이클린을 독시없는 물로 대체하십시오. 따라서 미상 후 뉴런에서 트랜스 유전자를 활성화시킨다.6 일 동안 독시없는 정권에 마우스를 유지하고 P10에서 안락사. 안락사 된 새끼에서 두뇌를 수정 4%PFA, 4도에서, 하룻밤. PFA 용액을 제거하고 30% 자당 용액으로 교체하십시오.뇌가 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지 뇌를 4도 로 둡니다. 극저온 배지로 채워진 일회용 임베딩 몰드로 뇌를 옮기십시오. 포함된 뇌를 80도 동결합니다.저온을 사용하여 60 미크론 두꺼운 관상 섹션을 잘라. 항-GFP, 항 RFP 면역 형광 및 DAPI 용액으로 이를 카운터스테인에 대한 공정 섹션. 표시된 대로 공초점 현미경의 작업 매개 변수를 적절히 설정합니다.면역 분석 슬라이스의 사진을 수집, RFP 신호 분포의 GFP 양성 뉴런 풍부한 사진 필드를 선택. 이미지를 ND2 파일로 내보내고 TIFF 파일로 이미지를 최대 z 프로젝션을 생성합니다. 세포 유전자형의 후속 뉴런 골격화 블라인드를 허용하려면 적색 신호를 숨깁니다.이렇게 하려면 조정 레이어를 추가합니다. 레벨을 선택하고 빨간색을 선택합니다. 출력을 0으로 설정합니다.그리고 같은 파일을 저장합니다. 골격화는 이후 원래 일반 빨간색 파일에 대한 이전에 액세스할 수 없었던 새 운영자에 의해 수행됩니다. 숨겨진 각 빨간색 파일에 대해 파일을 열고 기본 이미지에 도면 레이어를 추가하고 연필 도구를 선택합니다.GFP 신호를 기준으로 소어를 추적합니다. 그런 다음, 중성염을 추적합니다. 마지막으로, 뉴런 실루엣을 포함한 뮤틀리레이어 파일을 저장합니다.뉴런 골격의 후속 분석은 어느 작업자에 의해 수행 될 수있다. 각 mulitlayer 파일을 열고 검은 색 배경이있는 새 빈 16 비트 회색 크기 파일을 만듭니다. 뉴런 당 하나.기본 이미지에서 회색 스케일 파일에 이르기까지 단일 뉴런 실루엣을 복사하여 붙여 넣습니다. 다층 파일로 돌아가서 조정 층을 끄면 신경 유전자형을 공개하십시오. 16비트 그레이스케일 파일을 저장하여 해당 뉴런 유전자형에 추가합니다.ImageJ에서 회색 스케일 이미지를 하나씩 가져오고 NeurphologyJ 플러그인으로 골격을 분석합니다. 선택한 NeurophologyJ 기본 데이터, 중성기 길이의 총 영역, 부착 점 및 끝점을 스프레드시트에 수집하고 이차 형태 매개 변수를 계산하기 위해 사용합니다. 우리가 제안하는 엔지니어링 프로토콜은 의도 된 트랜스 게네스 세트와 함께 조사의 뉴런의 대다수를 결합 할 수 있습니다.더욱이, 그것은 변환된 세포 집단 내의 질적 발현 수준의 실질적인 균질성을 달성할 수 있다. 우리의 절차의 주요 특징은, 그것은 쌍 구성입니다. 테스트 및 제어 전구체 풀은 별도로 설계되고, 1:1을 혼합하고, 마지막으로 공동 이식됩니다.이 쌍을 이루는 접근 방식은 별개의 유전자형에 특별히 연결된 결과 차이의 검출을 용이하게 할 것입니다. 이 예에서, 우리는 이식된 새끼의 관상 단면을 분석했습니다, Foxg1의 심실 공동 주입 후에 10 일 과발 현현 신경 전구체 및 대조그들. 뉴런 그룹의 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 획득되었습니다.Z 스택 파일은 최대 투영을 계산하는 데 사용되었습니다. 뉴런 실루엣은 수동으로 추적되었습니다. 여기서, 녹색과 노란색 실루엣은 Foxg1 과발현 및 제어 뉴런을 각각 나타냅니다.마지막으로 NeurphologyJ 분석에 의해 얻은 기본 매개 변수는 그림과 같이 이차 형태지수의 계산에 사용되었습니다. 이것은 연구원이 주어진 유전자의 혼합발현이 생체 내의 중성염 발달 다트의 미세한 통제에 발휘할 수 있다는 충격을 평가할 수 있는 간단한 프로토콜입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다.뉴런 형태발생에 관여하는 유전자의 기존 수는 해당 성소 성소 선의 부재시 생체 내에서 기능적으로 특징지어질 수 있다. 그리고 중요한 통계 결과를 얻기 위해 분석에 필요한 동물수가 적습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

연구

유전학

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...