Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Vi takker Mihn Duc do for hans bidrag til tidlig oppsett av denne prosedyren.

Alle metoder og prosedyrer som er beskrevet her er godkjent av SISSA Organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering av konstruerte "grønne" Stam bassenger
<ol><li>Utarbeidelse av "grønne" basseng
	<ol>
<li>Mate en vill-type CD1 kvinne med en MtaptEGFP/+ grunnlegger16. Euthanize den gravide demningen ved cervical forvridning på 12,5 dager etter coitum (dag 0 bestemmes av vaginal plug inspeksjon) og høste d...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Spesifikke aspekter/trinn i denne prosedyren er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. Først (a) operatørene må være tilstrekkelig pretrained å trygt manipulere lentiviruses i en BSL-2 kompatibel lab miljø. For det andre, (b) før blande "test" og "kontroll" neural preparater, er det obligatorisk å nøye vaske de to tilsvarende neurosphere suspensjoner som beskrevet, for å hindre eventuelle forsinket kryss-smitte av de to forberedelsene på grunn av uønskede lentiviral bære over. For det tredje, (c) mens tr...

Her beskriver vi en enkel metode vi utviklet for å analysere in vivo gen kontroll av neuronal cytoarchitecture. Basert på in vitro engineering av neuronal forløpere, deres transplantasjon til nyfødte hjernen og sammenkoblet morphometric evaluering av "test" og "kontroll" celler, det gjør det mulig å avsløre funksjonelle implikasjoner av test gener i fin kontroll av neuronal morfologi i en rask og rimelig måte. For å undersøke i vivo gen kontroll av neuronal arkitektur må tre viktige tekniske spørsmål tas opp: (1) oppnå et tilstrekkelig mønstret gen-av-interesse-uttrykk (GOI) og en nøyaktig kvantitativ kontroll av det; (2) få en riktig segmentert visualisering av distinkte neuronal silhuetter; (3) fremlokkende statistiske betydningen av resultater mens ansette et begrenset antall dyr.
Når tilgjengelig, mus mutant linjer harboring Tetracycline (tet)-kontrollerte transgenes kan være det beste verktøyet for å løse den første utgaven1. Alternativt kan somatiske transgenesis være ansatt. I slike tilfeller leveres transgene via electroporation2 eller viral Transduction3. Neste, det er beholdt som en episome (f. eks, ved standard electroporation4), eller det er integrert i Genova (tilfeldig, via retroviral integrase5; eller i en definert plassering, via CRISPR-FORFREMMET homologe rekombinasjon (SLENDR)6 ).
For det andre kan neuronal silhuett visualisering oppnås via (a) sparsom uniform merking eller (b) tett differensial merking. Som for sparsom merking, avanserte Golgi-lignende metoder kan være ansatt7, utvalgte neuronal minisets kan fylles av biocytin8, og salt-og-pepper merking kan fås takket være et tynt uttrykt transgene. En slik transgene kan vise spraglete transkripsjon (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveres av Stokastisk REKOMBINASJON (MORF)10. Som for (b), State of Art strategier inkluderer grobunn-mediert Stokastisk rekombinasjon innenfor en multi-floxed fluoroprotein transgene array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-drevet genomisk integrering av fluoroprotein gener, tidligere leveres via somatiske transgenesis (klone)12.
Som for det tredje problemet, er morphometric utfallet ofte påvirket av en stor tilfeldig variasjon, som stammer fra Inter-dyr forskjeller og celle-injeksjon situasjoner. På grunn av dette, er et stort antall dyr vanligvis brukt for å oppnå den statistiske kraften som er nødvendig for å vurdere GOI morphometric aktivitet.
Tilnærminger tidligere beskrevet ofte stole på avanserte tekniske ferdigheter og krever iøynefallende økonomiske ressurser, som kan begrense deres diffusjon i det vitenskapelige samfunnet. For å omgå disse problemene, har vi unnfanget en enkel og grei rørledning å analysere gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på en rask og rimelig måte. Dette er inspirert av en lignende co-transplantasjon design tidligere utviklet for rask in vivo evaluering av antiblastic transgene aktivitet13.
Nærmere bestemt er det antatt at co-transplantasjon av in vitro konstruert "grønne" nevrale forløpere ("test" og "kontroll" celler) til en "svart" mottaker nyfødt hjernen kan samtidig fikse de tre sentrale spørsmålene nevnt ovenfor. Faktisk, in vitro lentiviral engineering av forløpere, i godt kontrollerte forhold, tillater vedlikehold av variasjon av neuronal transgene uttrykk på et minimum, langt under som vanligvis forbindes med in vivo somatiske manipulasjoner (utført tidligere 14 priser og priser , 15 og i våre upubliserte resultater). Den resulterende nøyaktig kontroll av genuttrykk er sammenlignbar med det som oppnås ved tet-kontrollerte transgene modeller. Men kostnadene ved denne prosedyren er langt under de som kommer fra vedlikehold av en transgene muse linje. Neste, fri hånds celle injeksjon er enkel og krever minimal trening. Videre kan mengden av navngitte prekursorer injiseres i hver hjerne enkelt stilles inn for å oppnå et tilstrekkelig kumulativ antall av tynt fordelte forløpere, samtidig som det totale antallet transplanterte dyr på et minimum. Sist men ikke minst, co-injeksjon av forskjellig fluoro-merket, "test" og "kontroll" forløpere og påfølgende parvis statistisk analyse av resultatene motvirke virkningene av Inter-dyr eksperimentell variasjon, slik at det å nå Statistisk betydning av resultatene, selv ved analyse av et begrenset antall individer13.
Det bør understrekes at, riktignok rask og billig, har denne metoden to hoved begrensninger. For det første er det designet for å undersøke celle-autonome gen kontroll av neuronal arkitektur, og det er ikke hensiktsmessig å ta miljøkontroll. For det andre, som transplantert neuronal prekursorer nå sitt endelige sted ved en heterochronic tidsplan, er denne metoden å foretrekke å modellere neuroarchitectonics kontroll oppstår tidligere migrering ferdigstillelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Gene kontroll av neuronal cytoarchitecture er i dag gjenstand for intensiv etterforskning. Beskrevet her er en enkel metode utviklet for å studere in vivo gen kontroll av neocortical projeksjon Nevron morfologi. Denne metoden er basert på (1) in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere som "test" og "kontroll" celler, (2) deres co-transplantasjon i vill-type hjerner, og (3) sammenkoblet morphometric evaluering av deres neuronal derivater. Nærmere bestemt, E 12.5 pallial forløpere fra panneuronal, genetisk merket givere, er ansatt for dette formålet. De er konstruert for å dra nytte av utvalgte arrangører og tetON/OFF-teknologi, og de er fri hånds transplantert inn nyfødte lateral ventriklene. Senere, upon immunofluorescence profilering av mottakerens hjerner, silhuetter av transplanterte neurons er matet inn NeurphologyJ åpen kildekode programvare, deres morphometric parametrene er ekstrahert, og gjennomsnittlig lengde og forgrening indeksen er beregnet. Sammenlignet med andre metoder, gir denne en tre viktigste fordeler: det tillater å oppnå fin kontroll av transgene uttrykk til rimelige kostnader, det krever bare grunnleggende kirurgiske ferdigheter, og det gir statistisk pålitelige resultater på analyse av en begrenset antall dyr. På grunn av sin design, men er det ikke tilstrekkelig å ta ikke celle-autonome kontroll av neuroarchitecture. Videre bør det fortrinnsvis brukes til å undersøke neurite morfologi kontroll etter fullføring av neuronal migrasjon. I sin nåværende formulering, er denne metoden utsøkt innstilt til å undersøke gen kontroll av glutamatergic neocortical Nevron arkitektur. Dra nytte av transgene Lines uttrykke EGFP i andre spesifikke nevrale celletyper, kan det bli re-purposed å ta gen kontroll over sin arkitektur.

Det er fem primære datasett gi nyttig informasjon om viktige aspekter ved prosedyren, den første var (1) effektiviteten av nevrale forløpere Transduction og co-Transduction av lentiviral vektorer. (2) et eksempel på viktige funksjoner i arrangørene ansatt for å drive "test genet". (3) et eksempel på konstruerte celler klare for transplantasjon. (4) en tegneserie med viktige prosessuelle detaljer om celle microinjection inn i nyfødt hjernen. (5) et sammendrag av hele morphometric r...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Basert på in vitro lentiviral engineering av neuronal forløpere, deres co-transplantasjon i vill-type hjerner og sammenkoblet morphometric evaluering av "test" og "kontroll" derivater, gir denne metoden nøyaktig modellering av in vivo gen kontroll av neocortical Nevron morfologi på en enkel og rimelig måte.

Intraventricular transplantasjon av konstruerte neuronal forløpere for in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Det overordnede målet med denne teknikken er vurderingen av effekten av genuttrykksmanipulasjoner på kortikal nevronal arkitektur in vivo. Vår første viktige fordel med denne prosedyren over de som er basert på en nøytral elektroporasjon, er den fine kontrollen av genuttrykksnivåer. Spesielt muliggjør denne integrerte rørledningen in vivo evaluering av defekt, opphøyet av små endringer i genuttrykk på kontroll av nevronal cytoarkitektur.Videre gir parstrukturen til transplantasjonstesten en stor reduksjon i dyretall som er nødvendige for å oppnå statistisk signifikante resultater. Teknikken drar nytte av et forløperbasseng med opprinnelse fra Tau EGFP transgene embryoer. Dette bassenget er delt inn i to sub bassenger som er alternativt infisert med to lentiviral blandinger.For å få en grønn test pool og en gul kontroll pool som vil bli co-injisert. Etter to dager med in vitro-utvidelse blir de resulterende nevrosfærene disassociated, blandet en til en, og injiseres med kapillær i musen ventrikulær plass. Ti dager senere utføres immunofluorescence på koronale seksjoner for å tillate sammenligningen mellom test- og kontrollnevroner.Til slutt blir de immunostained seksjonene avbildet og skeletonized for endelig evaluering av morfometriske parametere. Før in vivo transplantasjon, forberede forløperen grønt basseng. E12.5 embryoer, høstet fra en gravid demning tidligere paret til en Tau EGFP grunnlegger, er satt i individuelle brønner av en multi-brønn plate i PBS løsning.Genotype dem raskt ved visuell inspeksjon under en blått lyslampe. Disassociate dissekert grønne korttices til enkeltceller. Re-suspendere celler i proliferativt medium, og del dem i to like store underpuljer.Infisere hvert underbasseng med en dedikert lentiviral blanding. Hver blanding inneholder rød etikett virus eller svart kontroll virus. I tillegg til virus for Tet-Off drevet transgene eller kontroll uttrykk, henholdsvis.Hvert lentivirus må administreres ved infeksjonsmulkt på 8. Plate de infiserte cellene i proliferativt medium med 2 mikrogram per milliliter doxycyklin. Overfør celler til inkubatoren og la dem stå i 2 dager ved 37 grader.Etter 2 dager må de to underbassengene vises som suspensjoner av små nevrosfærer. Homogent uttrykke det røde fluorescerende protein, eller ikke. Etter prosjektering av forløpere, sett en vurdering array for transplantasjon i P0 hvite lab valper.Bruk borosilikatglasskapillærer med evig og innvendig diameter som tilsvarer henholdsvis 1,5 millimeter og 1,12 millimeter. Trekk kapillæren med en P1000-avtrekker. Først går du inn i trekkprogrammet.For det andre plasserer du kapillæren i holderne og strammer dem. Tredje, start programmet og ta de to trukket mikrokapillærer. Klipp kapillærspissen, for hånd med en skalpell, under stereomikroskopet for å oppnå et tips med en ekstern diameter på 200-250 mikrometer.Til slutt plasserer du kapillærene på plastikkstøtten i en lukket petriskål, og overfører den under panseret. Desinfiser optiske fibre og plasser dem under panseret. Bland EGTA og Fast Green master mikser, for å forberede celle tracer løsning, og plasser den igjen under panseret.Klipp små biter av laboratorietetningsfilm for cellesuspensjonsspotting. Og til slutt, forberede en løsning på 1 mg per milliliter steril doxycyklin kastes i en 0,3 milliliter sprøyte. Injeksjonsrøret er tilberedt fra to lateksrør.Fest et hardt plastmunnstykke til den ene enden av et lateksrør. Fest deretter kapillærholderen til den ene enden av det andre lateksrøret. Koble de frie endene av de to lateksrørene fra et sterilt filter på 0,45 mikrometer, som en barriere mot operatørbakterier.Plasser den resulterende aspiratorrørenheten på en plastinholder som skal oppbevares under panseret. Samle, teste og kontrollere neurosfærer i separate rør. Sentrifuge neurosphere suspensjoner og erstatte supernatant av PBS.Gjenta denne sekvensen to ganger til. Sentrifuge neurosphere suspensjoner, erstatte supernatant ved trypsin løsning, og pipette cellen pellet opp og ned, 4, 5 ganger. La celler stå i inkubatoren i fem minutter for å få en enkelt celle suspensjon.Blokker trypsin med trypsinhemmerløsning. Sentrifugeceller, og re-suspendere dem i frisk proliferativ medium. Telle celler i de to bassengene og justere konsentrasjonen til 100.000 celler per mikroliter, i proliferativt medium.Deretter blander du test- og kontrollceller 1:1 og kontrollerer den resulterende blandingen under et fluorescensmikroskop. Til slutt legger du blandingen på is under panseret. Forbered buret med moren og valpene på et bord langt borte fra det kirurgiske operatørområdet.Plasser et restitusjonsbur på en vogn. Sett en blanding av sagflis tatt fra morens bur på bunnen, og plasser restitusjonsburet under en lampe. Til side, sett en isboks dekket av en aluminiumsfolie for anestesi av P0-valpene.Like før transplantasjonen, legg til en 1 til 10 volum celle tracer løsning til ett volum celle suspensjon, og spot tre mikroliter av den resulterende blandingen på et stykke laboratorietetningsfilm. Plasser valpen på den kjølige aluminiumsfolien i ett minutt, og kontroller at den er fullstendig bedøvet. I mellomtiden aspirerer de 3 mikroliter injeksjonsblandingen inn i glasskapillæren.Tørk forsiktig hodet til den bedøvede valpen med 70% etanol. Deretter finner du den på den optiske fiberen, for å tydelig identifisere de kortikale halvkulene. Gå inn i kapillæren inn i fronten og få tilgang til ventrikulær hulrom.Mens du gjør det, vær oppmerksom på ikke å skade blodårene. For å forhindre skade på ganglionic eminens, roter nålen sidealt med tretti grader. Injiser cellene forsiktig inn i hulrommet og overvåk diffusjonen ved hjelp av Fast Green.Vent i fem til ti sekunder. Fjern glassnålen, ta vare på at du ikke aspirerer cellefjæringen, og kast den i en egnet avfallsbeholder. Før pup utvinning fra anestesi, injisere 150 mikroliter doxy løsning intraperitoneally, for å holde transgenuttrykk fortsatt av etter transplantasjon.Etter injeksjonen, plasser valpene umiddelbart under lampen for gjenoppretting. La valpene være der i fem til ti minutter, og når de er helt våkne, legg dem i buret med moren. Vær oppmerksom på de opererte valpene i to til tre timer, for å sikre at moren aksepterer dem.Forsyn buret med drikkevann som inneholder 0,5mg/ml doxycyklin og sukrose, for å opprettholde det transgene uttrykket av. Skift ut doxycyklinet som inneholder vann med doksyfritt vann fire dager etter transplantasjon. Dermed aktiverer transgenet i postmitotiske nevroner.Hold mus i et doksyfritt regime i seks dager, og euthanize dem på P10. Fiks hjerner fra eutaniserte valper i 4% PFA, ved fire grader, over natten. Fjern PFA-løsningen og erstatt den med 30 % sukroseløsning.La hjernen være på fire grader til de synker til hetteglassbunnen. Overfør hjernen til en engangsinnbyggingsform omtrent halvparten fylt med kryo-inkluderingsmedium. Frys den medfølgende hjernen ved 80 grader.Klipp 60 mikron tykke koronar seksjoner ved hjelp av en kryostat. Prosessseksjoner for anti-GFP, anti-RFP immunofluorescence og motvirke dem med DAPI-løsning. Angi arbeidsparametere for det konfokale mikroskopet på riktig måte som vist.Samle bilder av immunoassayed skiver, velge GFP positiv neuron-rike fotografiske felt blind av RFP signaldistribusjon. Eksporter bildene som ND2-filer og generer maksimale z-projeksjoner av dem som TIFF-filer. For å tillate påfølgende neuron skeletonization blind av celle genotype, skjul det røde signalet.Hvis du vil gjøre dette, legger du til et justeringslag. Velg nivåer, velg rød. Sett utgangen til null.Og lagre filen som sådan. Skeletonization utføres senere av en ny operatør, som ikke hadde noen tidligere tilgang til originale vanlige røde filer. Åpne filen for hver skjulte røde fil, legg til et tegnelag i hovedbildet og velg blyantverktøyet.Spor somer på grunnlag av GFP signal. Deretter sporer neurites. Til slutt lagrer du mutlilayer-filen, inkludert nevronale silhuetter.Etterfølgende analyse av nevronale skjeletter kan utføres av en av operatørene. Åpne hver mulitlayer fil, opprett nye tomme 16-biters gråtonefiler med svart bakgrunn. En per nevron.Kopier og lim inn enkle nevronale silhuetter, fra det primære bildet, til gråtonefilene. Gå tilbake til flerlagsfilen og slå av justeringslaget for å avdekke nevronale genotyper. Lagre 16-biters gråtonefiler, og merknader til de tilsvarende nevron genotyper.Importer gråtonebilder i ImageJ en etter en, og analyser skjeletter av NeurphologyJ plugin. Samle inn valgte NeurophologyJ primære data, totalt areal av nevrittlengde, festepunkter og sluttpunkter, i et regneark, og bruk dem til å beregne sekundære morfometriske parametere. Den tekniske protokollen vi foreslår gjør det mulig å videreføre det store flertallet av nevroner gjenstand for undersøkelse, med de tiltenkte transgenes settene.Videre gjør det det mulig å oppnå en betydelig homogenitet av transgene uttrykksnivåer innenfor den transduserte cellepopulasjonen. En viktig funksjon i vår prosedyre, er det paret konfigurasjon. En test og en kontroll forløper basseng er separat konstruert, blandet 1:1, og til slutt co-transplantert.Denne sammenkoblede tilnærmingen vil lette påvisning av resultatforskjeller spesielt knyttet til distinkte genotyper. I dette eksemplet analyserte vi koronale deler av transplanterte valper, ti dager etter den interventricular co-injeksjon av Foxg1 over-uttrykkende nevron forløpere og kontroll seg. Bilder av grupper av nevroner ble kjøpt med konfokal mikroskopi.Z-stack filer ble brukt til å beregne maksimale projeksjoner. Neuronal silhuetter ble manuelt sporet. Her representerer grønne og gule silhuetter Henholdsvis Foxg1 over-uttrykkende og kontrollerer nevroner.Til slutt ble primære parametere oppnådd ved NeurphologyJ-analyse, brukt for beregning av sekundære morfometriske indekser, som illustrert. Dette er en enkel protokoll som gjør det mulig for forskeren å vurdere virkningen som det blandede uttrykket av et gitt gen, kan utøve på fin kontroll av neurittutvikling darth in vivo. De viktigste fordelene med denne protokollen er to.Eksisterende antall gener involvert i nevronal morfogenese kan være funksjonelt preget in vivo, i fravær av de tilsvarende teratogene linjene. Og færre dyr er nødvendig for analysen for å få de betydelige statistiske resultatene.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encellede Gene Expression Profilering hjelp FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Opprinnelige celletransplantasjon for CRISPR/Cas9-baserte sprang framover i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Fosteret Microinjection og transplantasjon teknikk for Nasonia vitripennis genomet manipulasjon

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...