Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Agradecemos a Mihn Duc do pela sua contribuição para a criação precoce deste procedimento.

Todos os métodos e procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo SISSA organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. geração de pools de progenitor "verdes" projetados
<ol><li>Preparação da piscina "verde"
	<ol>
<li>Mate uma fêmea CD1 de tipo selvagem com um fundador do MtaptEGFP/+ 16. Eutanizar a represa grávida por luxação cervical em 12,5 dias após o coitum (o dia 0 é determinado pela inspeção de pl...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Aspectos específicos/etapas deste procedimento são críticos e exigem atenção especial. Primeiro, (a) os operadores devem ser adequadamente treinados para manipular com segurança Lentivirus em um ambiente de laboratório compatível com BSL-2. Em segundo lugar, (b) antes de misturar "teste" e "controle" preparações neurais, é obrigatório lavar cuidadosamente as duas suspensões de neuroesfera correspondentes, como descrito, a fim de evitar qualquer atraso na infecção cruzada das duas preparações devido a Len...

Aqui nós descrevemos um método simples que nós desenvolvemos para dissecar in vivo o controle do gene da Citoarquitetura neuronal. Com base na engenharia in vitro de precursores neuronais, seu transplante em cérebro neonatal e avaliação morfométrica pareada de células de "teste" e "controle", permite desvendar as implicações funcionais dos genes de teste no controle fino da morfologia neuronal em um forma rápida e acessível. Para investigar o controle genético in vivo da arquitetura neuronal, três questões técnicas fundamentais devem ser abordadas: (1) alcançar uma expressão de gene-de-interesse (GOI) adequadamente padronizada e um controle quantitativo exato da mesma; (2) obtenção de uma visualização segmentada adequada de silhuetas neuronais distintas; (3) elicitar a significância estatística dos resultados, empregando um número limitado de animais.
Quando disponível, as linhas mutantes do rato que abriam transgenes controlados do tetraciclina (Tet) podem ser a melhor ferramenta para endereçar a primeira edição1. Alternativamente, a transgênese somática pode ser empregada. Nesses casos, o transgene é entregado através do Electroporation2 ou da transdução viral3. Em seguida, é mantido como um episome (por exemplo, em cima do Electroporation padrão4), ou está integrado no genoma (aleatòria, através da integrase retroviral5; ou em uma posição definida, através do recombinação homous-promovido crispr (slendr)6 ).
Em segundo lugar, a visualização da silhueta neuronal pode ser conseguida através de (a) rotulagem uniforme esparsa ou (b) rotulagem diferencial densa. Quanto à rotulagem esparsa, as metodologias avançadas do tipo Golgi podem ser empregadas7, minisets neuronais selecionados podem ser preenchidos por biocitina8, e a rotulagem de sal e pimenta pode ser obtida graças a um transgene escassamente expresso. Tal transgene pode exibir a transcrição variegada (thy-EGFP)9 ou pode ser ativada por recombinação estocástica (Morf)10. Quanto a (b), as estratégias de estado de arte incluem recombinação estocástica mediada por CRE dentro de uma matriz de transgenes de fluoroproteína multifloxed (Brainbow)11, bem como a integração genômica guiada por piggyBac-transposase de genes de fluoroproteína, anteriormente entregues via transgénese somática (CLoNE)12.
Quanto à terceira questão, o desfecho morfométrico é freqüentemente afetado por uma grande variabilidade aleatória, originando-se de diferenças entre animais e contingências de injeção celular. Devido a isso, um grande número de animais geralmente é empregado para atingir o poder estatístico necessário para avaliar a atividade morfométrica GOI.
As abordagens anteriormente descritas freqüentemente dependem de habilidades técnicas avançadas e exigem recursos financeiros evidentes, o que pode limitar sua difusão dentro da comunidade científica. Para contornar essas questões, concebemos um pipeline fácil e direto para dissecar o controle genético da neuroarquitetura in vivo de forma rápida e acessível. Isto é inspirado por um projeto similar do cotransplante desenvolvido previamente para a avaliação in vivo rápida da atividade a13do transgene.
Especificamente, pensa-se que o cotransplante de in vitro projetado "verde" precursores neurais ("teste" e "controle" células) em um "preto" receptor neonatal cérebro pode simultaneamente corrigir as três principais questões listadas acima. De fato, a engenharia lentivirais in vitro de precursores, em condições bem controladas, permite a manutenção da variabilidade da expressão neuronal transgênica no mínimo, muito abaixo do que geralmente está associado com manipulações somáticas in vivo (realizadas anteriormente 14 anos de , 15 e em nossos resultados inéditos). O controle exato resultante da expressão gênica é comparável com o obtido por modelos transgênicos controlados por Tet. No entanto, os custos deste procedimento são muito inferiores àqueles provenientes da manutenção de uma linha de rato transgénica. Em seguida, a injeção livre da pilha da mão é fácil e exige o treinamento mínimo. Além disso, a quantidade de precursores rotulados injetado em cada cérebro pode ser facilmente ajustada para alcançar um número cumulativo suficiente de precursores esparsamente distribuídos, ao mesmo tempo que mantém o número total de animais transplantados no mínimo. Por último, mas não menos importante, a coinjeção de precursores de "teste" e "controle" de forma diferente, com rótulo de fluoro, e posterior análise estatística pareada dos resultados neutram os efeitos da variabilidade experimental interanimal, permitindo o alcance de significância estatística dos resultados, mesmo após a análise de um número limitado de indivíduos13.
Ressalta-se que, embora rápido e barato, esse método tem duas limitações principais. Primeiramente, é projetada investigar o controle Cell-Autonomous do gene da arquitetura neuronal, e não é apropriado endereçar o controle ambiental. Em segundo lugar, como precursores neuronais transplantados chegar a sua localização final por um cronograma heterocrônico, este método é preferível para modelar neuroarchitectonics controle ocorrendo após a conclusão da migração.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

O controle do gene da Citoarquitetura neuronal é atualmente o assunto da investigação intensiva. Descrito aqui é um método simples desenvolvido para estudar o controle genético in vivo da morfologia do neurônio da projeção neokortikalny. Este método é baseado em (1) Engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais como células de "teste" e "controle", (2) seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e (3) avaliação morfométrica pareada de seus derivados neuronais. Especificamente, os precursores paliais E 12.5 dos doadores panneuronal, geneticamente rotulados, são empregados para este fim. São projetados para tirar proveito dos promotores selecionados e da tecnologia tetON/OFF, e são transplantados à mão livre em ventrículos laterais neonatais. Mais tarde, após a criação de perfil de imunofluorescência de cérebros destinatários, silhuetas de neurônios transplantados são alimentados em software de código aberto NeurphologyJ, seus parâmetros morfométricos são extraídos, e o comprimento médio e índice de ramificação são calculados. Comparado a outros métodos, este oferece três vantagens principais: permite conseguir do controle fino da expressão do transgene a custos disponíveis, ele exige somente habilidades cirúrgicas básicas, e fornece resultados estatisticamente confiáveis em cima da análise de um limitado número de animais. Por causa de seu projeto, entretanto, não é adequado endereçar o controle não Cell-Autonomous do neuroarchitecture. Além disso, deve ser usado preferencialmente para investigar o controle da morfologia do neurite após a conclusão da migração neuronal. Em sua formulação atual, este método é afinado primorosamente para investigar o controle do gene da arquitetura neokortikalny glutamatérgico do neurônio. Aproveitando-se de linhas transgênicas expressando EGFP em outros tipos específicos de células neurais, pode ser re-purposed para abordar o controle genético de sua arquitetura.

Há cinco conjuntos de dados primários que fornecem informações úteis sobre os principais aspectos do procedimento, sendo a primeira (1) eficiência da transdução de precursores neurais e a cotransdução por vetores lentivirais. (2) um exemplo de características-chave dos promotores empregados para conduzir o "gene de teste". (3) um exemplo de células de engenharia prontas para transplante. (4) uns desenhos animados que incluem detalhes processuais chaves da microinjeção da pil...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

O objetivo geral desta técnica é a avaliação do efeito das manipulações da expressão genética na arquitetura neuronal cortical in vivo. Nossa primeira vantagem fundamental deste procedimento sobre aqueles baseados em uma eletroporação neutra, é o controle fino dos níveis de expressão genética. Especificamente, este gasoduto integrado permite a avaliação in vivo de defeito, exaltada por pequenas mudanças na expressão genética no controle da citoarquitetura neuronal.Além disso, a estrutura par do teste de transplante permite uma enorme redução no número de animais necessários para obter resultados estatisticamente significativos. A técnica aproveita uma piscina precursora originária de embriões transgênicos Tau EGFP. Esta piscina é subdividida em duas sublocos que são alternativamente infectados com duas misturas lentivirais.Para obter uma piscina de teste verde e uma piscina de controle amarela que será co-injetada. Após dois dias de expansão in vitro, as esferas neurológicas resultantes são desassociadas, misturadas de uma a uma, e injetadas com um capilar no espaço ventricular do rato. Dez dias depois, a imunofluorescência nas seções coronais é realizada para permitir a comparação entre os neurônios de teste e controle.Finalmente, as seções imunossuadas são imagens e esqueletizadas para avaliação final de parâmetros morfométricos. Antes do transplante in vivo, prepare a piscina verde precursora. Os embriões E12.5, colhidos de uma represa grávida anteriormente acoplada a um fundador da Tau EGFP, são situados em poços individuais de uma placa multi-poço em solução PBS.Genótipo-los rapidamente por inspeção visual sob uma lâmpada azul. Desassociar os cortices verdes dissecados para células únicas. Suspenda as células em meio proliferativo e subdividir-as em duas subgruas de tamanho igual.Infecte cada subcoo pool com uma mistura lentiviral dedicada. Cada mistura contém vírus de rótulo vermelho ou vírus de controle preto. Assim como os vírus para tet-off acionado transgene ou expressão de controle, respectivamente.Cada lentivírus deve ser administrado na multiplicidade de infecção de 8. Aplaque as células infectadas em meio proliferativo com 2 microgramas por mililitro de doxiciclina. Transfira as células para a incubadora e deixe-as por 2 dias a 37 graus.Após 2 dias, as duas subgrupas devem aparecer como suspensões de pequenas neuroesferas. Expressando homogeneamente a proteína fluorescente vermelha, ou não. Após a engenharia dos precursores, estabeleça uma matriz de avaliação para o transplante em filhotes de laboratório brancos P0.Utilize os capilares de vidro borossilicato com diâmetro eterno e interno igual a 1,5 milímetros e 1,12 milímetros, respectivamente. Puxe o capilar com um puxador P1000. Primeiro, entre no programa de puxar.Em segundo lugar, coloque o capilar nos suportes e aperte-os. Terceiro, inicie o programa e pegue os dois microcapillaries puxados. Corte a ponta capilar, à mão com um bisturi, sob o estereóscópio para obter uma ponta com diâmetro externo de 200-250 micrômetros.Por fim, coloque os capilares no suporte de plasticina em uma placa de Petri fechada, e transfira-o sob o capô. Desinfete as fibras ópticas e coloque-as sob o capô. Misture as misturas mestre EGTA e Fast Green, para preparar a solução de rastreador de células e coloque-a novamente sob o capô.Corte pequenos pedaços de filme de vedação de laboratório para detectar a suspensão celular. E, finalmente, prepare uma solução de 1 miligrama por mililitro estéril doxiciclina descartada em uma seringa de 0,3 mililitro. O tubo de injeção é preparado a partir de dois tubos de látex.Fixar uma peça de boca de plástico duro em uma extremidade de um tubo de látex. Em seguida, fixar o suporte capilar em uma extremidade do tubo de látex. Conecte as extremidades livres dos dois tubos de látex a partir de um filtro estéril de 0,45 micrômetros, como uma barreira contra germes do operador.Coloque o conjunto do tubo aspirador resultante em um suporte de plasticina a ser mantido sob o capô. Coletar, testar e controlar neuroesferas em tubos separados. Centrífuga suspensões neuroferas e substitua o supernatante por PBS.Repita esta sequência mais duas vezes. Centrífuga suspensões neuroferas, substitua o supernante pela solução de trippsina, e pipeta a pelota celular para cima e para baixo, 4, 5 vezes. Deixe as células na incubadora por cinco minutos para obter uma suspensão de uma única célula.Bloqueie a trippsina com a solução inibidora de trippsina. Centrífugas, e suspendê-las em meio proliferativo fresco. Conte as células das duas piscinas e ajuste sua concentração para 100.000 células por microliter, em meio proliferativo.Em seguida, misture as células de teste e controle 1:1 e verifique a mistura resultante sob um microscópio de fluorescência. Por fim, coloque a mistura no gelo sob o capô. Prepare a gaiola com a mãe e os filhotes em uma mesa muito distante da área de operador cirúrgico.Coloque uma gaiola de recuperação em um carrinho. Coloque uma mistura de serragem retirada da gaiola da mãe no fundo, e coloque a gaiola de recuperação sob uma lâmpada. À parte, reserve uma caixa de gelo coberta por uma folha de alumínio para a anestesia dos filhotes P0.Pouco antes do transplante, adicione uma solução de 1 a 10 volumes de rastreador de células a um volume de suspensão celular, e localmente três microliters da mistura resultante em um pedaço de filme de vedação de laboratório. Coloque o filhote na folha de alumínio fria por um minuto e verifique se ele está totalmente anestesiado. Enquanto isso, aspire os 3 microliters de injeção misturados no capilar de vidro.Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com 70% de etanol. Em seguida, localizá-lo na fibra óptica, para identificar claramente os hemisférios corticais. Digite o capilar na frente e acesse a cavidade ventricular.Ao fazer isso, preste atenção para não danificar os vasos sanguíneos. Para evitar danos de eminência gangliônica, gire a agulha lateralmente em trinta graus. Injete suavemente as células na cavidade e monitore sua difusão por meio do Fast Green.Espere de cinco a dez segundos. Retire a agulha de vidro, tomando cuidado para não aspirar a suspensão da célula, e descarte-a em uma lixeira adequada. Antes da recuperação do filhote da anestesia, injete 150 microliters de solução doxi intraperitoneal, para manter a expressão transgênica ainda fora após o transplante.Após a injeção, coloque os filhotes imediatamente sob a lâmpada para recuperação. Deixe os filhotes lá por cinco a dez minutos, e uma vez que eles estejam totalmente acordados, coloque-os na gaiola com a mãe. Observe os filhotes operados por duas a três horas, para garantir que a mãe os aceite.Forneça à gaiola água potável contendo doxiciclina de 0,5mg/mL e sacarose, para manter a expressão transgênica fora. Substitua a doxiciclina contendo água com água sem doxido quatro dias após o transplante. Ativando assim o trans-gene em neurônios pós-metóticos.Mantenha os ratos em um regime livre de doxi por seis dias, e eutanize-os em P10. Conserte cérebros de filhotes eutanizados em 4% PFA, a quatro graus, durante a noite. Remova a solução PFA e substitua-a por uma solução de 30%de sacarose.Deixe os cérebros a quatro graus até afundarem no fundo do frasco. Transfira os cérebros para um molde descartável de incorporação aproximadamente meio cheio de meio crio-inclusão. Congele o cérebro incluído a 80 graus.Corte 60 mícrons de seções coronais grossas usando um criostat. Seções de processo para imunofluorescência anti-GFP, anti-RFP e contratensão-as com a solução DAPI. Defina os parâmetros de trabalho do microscópio confocal apropriadamente como mostrado.Colete imagens de fatias imunoensaceradas, selecionando campos fotográficos ricos em neurônios GFP cegos da distribuição de sinal RFP. Exporte as imagens como arquivos ND2 e gere projeções máximas z deles como arquivos TIFF. Para permitir a esqueleto subsequente do neurônio cego do genótipo celular, esconda o sinal vermelho.Para isso, adicione uma camada de ajuste. Selecione níveis, selecione vermelho. Defina a saída para zero.E salve o arquivo como tal. A esqueleto é posteriormente realizada por um novo operador, que não tinha acesso prévio a arquivos originais vermelhos simples. Para cada arquivo vermelho oculto, abra o arquivo, adicione uma camada de desenho à imagem principal e selecione a ferramenta lápis.Rastreie o somer com base no sinal GFP. Então, rastreie os neurites. Finalmente, salve o arquivo de mutlilayer, incluindo silhuetas neuronais.A análise subsequente dos esqueletos neuronais pode ser realizada por qualquer operador. Abra cada arquivo mulitlayer, crie novos arquivos vazios de escala de cinza de 16 bits com fundo preto. Um por neurônio.Copie e cole silhuetas neuronais únicas, desde a imagem primária até os arquivos em escala de cinza. Volte para o arquivo multicamadas e desligue a camada de ajuste para desvendar genótipos neuronais. Salve os arquivos em escala de cinza de 16 bits, anotando os genótipos de neurônios correspondentes.Importe imagens em escala de cinza em ImageJ um a um, e analise esqueletos por plugin NeurphologyJ. Colete os dados primários selecionados da NeurophologyJ, área total de comprimento de neurite, pontos de apego e pontos finais, em uma planilha e empregue-os para calcular parâmetros morfométricos secundários. O protocolo de engenharia que propomos permite cotransduturar a grande maioria dos neurônios objeto de investigação, com os conjuntos de transgenes pretendidos.Além disso, permite alcançar uma homogeneidade substancial dos níveis de expressão transgênica dentro da população celular transduzida. Uma característica fundamental do nosso procedimento, é a configuração emparelhada. Um teste e uma piscina precursora de controle são separadamente projetados, misturados 1:1, e finalmente co-transplantados.Essa abordagem emparelhada facilitará a detecção de diferenças de resultados especificamente ligadas a genótipos distintos. Neste exemplo, analisamos seções coronais de filhotes transplantados, dez dias após a co-injeção interventricular de precursores e controle de neurônios foxg1 super-expressando. Imagens de grupos de neurônios foram adquiridas com microscopia confocal.Arquivos Z-stack foram usados para calcular projeções máximas. As silhuetas neuronais foram traçadas manualmente. Aqui, as silhuetas verde e amarela representam os neurônios foxg1 super-expressando e controlando, respectivamente.Por fim, foram utilizados parâmetros primários obtidos pela análise de NeurphologyJ para cálculo de índices morfométricos secundários, conforme ilustrado. Trata-se de um protocolo simples que permite ao pesquisador avaliar o impacto que a expressão mista de um determinado gene pode exercer sobre o controle fino do desenvolvimento de neurite darth in vivo. As principais vantagens deste protocolo são duas.O número existente de genes envolvidos na morfogênese neuronal pode ser caracterizado funcionalmente in vivo, na ausência das linhas teratogênicas correspondentes. E menos animais são necessários para a análise para obter os resultados estatísticos significativos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Genética

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...