Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Agradecemos a Mihn Duc Do por su contribución a la configuración temprana de este procedimiento.

Todos los métodos y procedimientos descritos aquí han sido aprobados por la SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Generación de piscinas de progenitores "verdes" de ingeniería
<ol><li>Preparación de la piscina "verde"
	<ol>
<li>Mate una hembra de CD1 de tipo salvaje con un fundador de MtaptEGFP/+ 16. Eutanasia la presa embarazada por luxación cervical a los 12,5 días después del coíto (el día 0 ...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Los aspectos/pasos específicos de este procedimiento son críticos y requieren una atención especial. En primer lugar, (a) los operadores deben estar adecuadamente preparados para manipular de forma segura los lentivirus en un entorno de laboratorio compatible con BSL-2. En segundo lugar, b) antes de mezclar las preparaciones neuronales de "prueba" y "control", es obligatorio lavar cuidadosamente las dos suspensiones de neuroesfera correspondientes como se describe, con el fin de prevenir cualquier infección cruzada r...

Aquí describimos un método simple que desarrollamos para diseccionar el control genético in vivo de la citoarquitectura neuronal. Basado en la ingeniería in vitro de precursores neuronales, su trasplante en cerebro neonatal y evaluación morfométrica emparejada de células de "prueba" y "control", permite revelar implicaciones funcionales de genes de prueba en el control fino de la morfología neuronal en un manera rápida y asequible. Para investigar el control genético in vivo de la arquitectura neuronal, deben abordarse tres cuestiones técnicas clave: 1) lograr una expresión genética de interés (GOI) adecuadamente modelada y un control cuantitativo preciso de la misma; (2) obtener una visualización correctamente segmentada de siluetas neuronales distintas; 3) obtener una significancia estadística de los resultados mientras se emplea un número limitado de animales.
Cuando están disponibles, las líneas mutantes de ratón que albergan transgenes controlados por tetraciclina (tet) pueden ser la mejor herramienta para abordar el primer problema1. Alternativamente, se puede emplear transgénesis somática. En tales casos, el transgén se entrega a través de la electroporación2 o la transducción viral3. A continuación, se conserva como un epísmio (por ejemplo, sobre la electroporación estándar4), o se integra en el genoma (aleatoriamente, a través de la integrasa retroviral5; o en un lugar definido, a través de la recombinación homóloga promovida por CRISPR (SLENDR)6 ).
En segundo lugar, la visualización de la silueta neuronal puede lograrse mediante (a) etiquetado uniforme disperso o (b) etiquetado diferencial denso. En cuanto al etiquetado escaso, se pueden emplearmetodologías avanzadas similares a Golgi 7, los miniconjuntos neuronales seleccionados pueden ser llenados por biocictina8,y el etiquetado de sal y pimienta se puede obtener gracias a un transgén escasamente expresado. Dicho transgén puede mostrar transcripción variada (Thy-EGFP)9 o puede activarse mediante recombinación estocástica (MORF)10. En cuanto a (b), las estrategias de vanguardia incluyen la recombinación estocástica mediada por Cre dentro de una matriz transgénica de fluoroproteínas multifloxadas (Brainbow)11,así como la integración genómica impulsada por piggyBac-transposasa de genes de fluoroproteínas, anteriormente entregada a través de la transgénesis somática (CLoNE)12.
En cuanto a la tercera cuestión, el resultado morfométrico a menudo se ve afectado por una gran variabilidad aleatoria, originada por diferencias entre animales y contingencias de inyección celular. Debido a esto, un gran número de animales se emplea generalmente para lograr el poder estadístico necesario para evaluar la actividad morfométrica GOI.
Los enfoques descritos anteriormente a menudo se basan en habilidades técnicas avanzadas y requieren recursos financieros visibles, lo que puede limitar su difusión dentro de la comunidad científica. Para eludir estos problemas, concebimos una canalización fácil y directa para diseccionar el control genético de la neuroarquitectura in vivo de una manera rápida y asequible. Esto se inspira en un diseño similar de co-trasplante previamente desarrollado para una evaluación rápida in vivo de la actividad transgén al trasgeno antiblástica13.
Específicamente, se cree que el co-trasplante de precursores neuronales "verdes" de ingeniería in vitro ("células de prueba" y "control") en un cerebro neonatal receptor "negro" puede corregir simultáneamente los tres problemas clave mencionados anteriormente. De hecho, la ingeniería lentiviral in vitro de precursores, en condiciones bien controladas, permite el mantenimiento de la variabilidad de la expresión transgénica neuronal como mínimo, muy por debajo de la generalmente asociada con manipulaciones in vivo somáticas (realizadas previamente 14 , 15 y en nuestros resultados inéditos). El control preciso resultante de la expresión génica es comparable al logrado por los modelos transgénicos controlados por tet. Sin embargo, los costes de este procedimiento están muy por debajo de los derivados del mantenimiento de una línea de ratón transgénica. A continuación, la inyección de células a mano alzada es fácil y requiere un entrenamiento mínimo. Además, la cantidad de precursores etiquetados inyectados en cada cerebro se puede ajustar fácilmente para lograr un número acumulado suficiente de precursores escasamente distribuidos, manteniendo al mismo tiempo el número total de animales trasplantados como mínimo. Por último, pero no menos importante, la coinyección de precursores de etiqueta fluorada, "prueba" y "control" de manera diferente y el posterior análisis estadístico por pares de los resultados contrarrestan los efectos de la variabilidad experimental interanimal, permitiendo alcanzar significación estadística de los resultados, incluso tras el análisis de un número limitado de individuos13.
Cabe destacar que, aunque rápido y barato, este método tiene dos limitaciones principales. En primer lugar, está diseñado para investigar el control genético autónomo celular de la arquitectura neuronal, y no es apropiado para abordar el control ambiental. En segundo lugar, a medida que los precursores neuronales trasplantados llegan a su ubicación final por un horario heterocrónico, este método es preferible a modelar el control neuroarquitectónico que se produce después de la finalización de la migración.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

El control genético de la citoarquitectura neuronal es actualmente objeto de una investigación intensiva. Aquí se describe un método simple desarrollado para estudiar el control del gen in vivo de la morfología de la neurona de proyección neocortical. Este método se basa en (1) la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales como células de "prueba" y "control", (2) su cotrasplante en cerebros de tipo salvaje, y (3) la evaluación morfométrica emparejada de sus derivados neuronales. Específicamente, e12.5 precursores palliales de panneuronal, donantes genéticamente etiquetados, se emplean para este propósito. Están diseñados para aprovechar los promotores seleccionados y la tecnología tetON/OFF, y se trasplantan a mano alzada en ventrículos laterales neonatales. Más tarde, tras el perfil de inmunofluorescencia de los cerebros receptores, las siluetas de las neuronas trasplantadas se introducen en el software de código abierto NeurphologyJ, se extraen sus parámetros morfométricos y se calculan la longitud media y el índice de ramificación. En comparación con otros métodos, este ofrece tres ventajas principales: permite lograr un control fino de la expresión transgénica a costos asequibles, sólo requiere habilidades quirúrgicas básicas, y proporciona resultados estadísticamente confiables tras el análisis de una número de animales. Debido a su diseño, sin embargo, no es adecuado para abordar el control no autónomo celular de la neuroarquitectura. Además, se debe utilizar preferentemente para investigar el control morfológico de neurita después de la finalización de la migración neuronal. En su formulación actual, este método está exquisitamente ajustado para investigar el control genético de la arquitectura de neuronas neocorticales glutamatérgicas. Aprovechando las líneas transgénicas que expresan EGFP en otros tipos específicos de células neurales, se puede reutilizar para abordar el control genético de su arquitectura.

Existen cinco conjuntos de datos principales que proporcionan información útil sobre aspectos clave del procedimiento, siendo el primero (1) la eficiencia de la transducción de precursores neuronales y la co-transducción por vectores lentivirales. (2) Un ejemplo de las características clave de los promotores empleados para impulsar el "gen de prueba". (3) Un ejemplo de células de ingeniería listas para el trasplante. (4) Una caricatura que incluye los detalles procesales clave de l...

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Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Basado en la ingeniería lentiviral in vitro de precursores neuronales, su co-trasplante en cerebros de tipo salvaje y evaluación morfométrica emparejada de derivados de "prueba" y "control", este método permite el modelado preciso del control genético in vivo del neocortical morfología de las neuronas de una manera simple y asequible.

Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

El objetivo general de esta técnica es la evaluación del efecto de las manipulaciones de expresión génica en la arquitectura neuronal cortical in vivo. Nuestra primera ventaja clave de este procedimiento sobre los basados en una electroporación neutra, es el control fino de los niveles de expresión génica. Específicamente, esta tubería integrada permite la evaluación in vivo del defecto, exaltada por pequeños cambios en la expresión génica en el control de la citoarquitectura neuronal.Además, la estructura de pares de la prueba de trasplante permite una enorme reducción en el número de animales necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos. La técnica aprovecha un grupo de precursores originarios de embriones transgénicos Tau EGFP. Esta piscina se subdivide en dos sub-pools que son alternativamente infectados con dos mezclas lentivirales.Para obtener un grupo de pruebas verde y un grupo de control amarillo que se va a co-inyectar. Después de dos días de expansión in vitro, las neuroesferas resultantes se desasocian, se mezclan uno a uno, y se inyectan con un capilar en el espacio ventricular del ratón. Diez días después, se realiza inmunofluorescencia en secciones coronales para permitir la comparación entre las neuronas de prueba y control.Por último, las secciones inmunotendémicas se tometán y esqueletizan para la evaluación final de los parámetros morfométricos. Antes del trasplante in vivo, preparar la piscina verde precursora. Los embriones E12.5, cosechados de una presa embarazada previamente acoplada a un fundador de Tau EGFP, se colocan en pozos individuales de una placa multi-pozo en solución PBS.Genotipo rápidamente mediante inspección visual bajo una lámpara de luz azul. Desasociar los cortices verdes diseccionados a células individuales. Vuelva a suspender las células en un medio proliferativo y subdividirlas en dos subgrupos de tamaño igual.Infectar cada sub-pool con una mezcla lentiviral dedicada. Cada mezcla contiene virus de etiqueta roja o virus de control negro. Así como virus para transgenes impulsados por Tet-Off o expresión de control, respectivamente.Cada lentivirus debe administrarse a una multiplicidad de infección de 8. Placar las células infectadas en medio proliferativo con 2 microgramos por mililitro de doxiciclina. Transfiera las células a la incubadora y déjelas durante 2 días a 37 grados.Después de 2 días, las dos sub-piscinas deben aparecer como suspensiones de pequeñas neuroesferas. Expresar homogéneamente la proteína fluorescente roja, o no. Después de la ingeniería de precursores, establezca una matriz de evaluación para el trasplante en cachorros de laboratorio blanco P0.Utilice los capilares de vidrio borosilicato con diámetro eterno e interno igual a 1,5 milímetros y 1,12 milímetros, respectivamente. Tire del capilar con un tirador P1000. En primer lugar, introduzca el programa de extracción.En segundo lugar, coloque el capilar en los soportes y apriételos. Tercero, inicie el programa y tome los dos microcapillarios tirados. Cortar la punta capilar, a mano con un bisturí, debajo del estereomicroscopio para obtener una punta con un diámetro externo de 200-250 micrómetros.Por último, coloque los capilares en el soporte de plastilina en un plato de Petri cerrado, y transfiéralo debajo del capó. Desinfecte las fibras ópticas y colóquelas debajo del capó. Mezcle las mezclas maestras EGTA y Fast Green, para preparar la solución de trazador celular, y colóquela de nuevo debajo del capó.Corte pequeños trozos de película de sellado de laboratorio para detectar la suspensión celular. Y finalmente, preparar una solución de 1 miligramo por mililitro de doxiciclina estéril desemida en una jeringa de 0,3 mililitros. El tubo de inyección se prepara a partir de dos tubos de látex.Fije una pieza de boca de plástico duro a un extremo de un tubo de látex. A continuación, fije el soporte capilar a un extremo del otro tubo de látex. Conecte los extremos libres de los dos tubos de látex de un filtro estéril de 0,45 micrómetros, como barrera contra los gérmenes del operador.Coloque el conjunto de tubo del aspirador resultante en un soporte de plastilina que se mantendrá debajo del capó. Recopile, pruebe y controle las neuroesferas en tubos separados. Centrifugar suspensiones de neurosfera y reemplazar el sobrenadante por PBS.Repita esta secuencia dos veces más. Centrifugar las suspensiones de la neurosfera, reemplazar el sobrenadante por solución de trippsina, y pipetear el pellet celular hacia arriba y hacia abajo, 4, 5 veces. Deje las células en la incubadora durante cinco minutos para obtener una suspensión de una sola célula.Bloquear la trippsina con solución inhibidora de la trippsina. Centrifugar las células y volver a suspenderlas en un medio proliferativo fresco. Contar las células de las dos agrupaciones y ajustar su concentración a 100.000 células por microlitro, en medio proliferativo.Luego, mezcle las células de prueba y control 1:1 y compruebe la mezcla resultante bajo un microscopio de fluorescencia. Por último, coloque la mezcla sobre hielo debajo del capó. Prepare la jaula con la madre y los cachorros en una mesa lejos del área de la operadora quirúrgica.Coloque una jaula de recuperación en un carro. Ponga una mezcla de aserrín tomado de la jaula de la madre en su fondo, y coloque la jaula de recuperación debajo de una lámpara. Aparte, establecer una caja de hielo cubierta por una lámina de aluminio para la anestesia de los cachorros P0.Justo antes del trasplante, agregue de 1 a 10 volúmenes de solución de trazador celular a un volumen de suspensión celular, y detecte tres microlitros de la mezcla resultante en una pieza de película de sellado de laboratorio. Coloque el cachorro en la lámina de aluminio fresca durante un minuto, y compruebe que está completamente anestesiado. Mientras tanto, aspirar los 3 microlitros de la mezcla de inyección en el capilar de vidrio.Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con 70%etanol. A continuación, localícelo en la fibra óptica, para identificar claramente los hemisferios corticales. Introduzca el capilar en la parte delantera y acceda a la cavidad ventricular.Al hacer eso, preste atención a no dañar los vasos sanguíneos. Para evitar daños de eminencia gangliónica, gire la aguja lateralmente unas treinta grados. Inyecte suavemente las células en la cavidad y monitoree su difusión por medio de Fast Green.Espera de cinco a diez segundos. Retire la aguja de vidrio, teniendo cuidado de no aspirar la suspensión celular, y deseche en un contenedor de eliminación adecuado. Antes de la recuperación del cachorro de la anestesia, inyecte 150 microlitros de solución de doxi por vía intraperitoneal, para mantener la expresión transgénica todavía fuera después del trasplante.Después de la inyección, coloque los cachorros inmediatamente debajo de la lámpara para su recuperación. Deja a los cachorros allí durante cinco a diez minutos, y una vez que estén completamente despiertos, colóquelos en la jaula con la madre. Observe a los cachorros operados durante dos o tres horas, para asegurarse de que la madre los acepte.Suministre a la jaula agua potable que contenga 0,5mg/ml de doxiciclina y sacarosa, para mantener la expresión transgénica. Sustituya la doxiciclina que contiene agua con agua libre de oxígeno cuatro días después del trasplante. Activando así el trans-gen en las neuronas postmitoticas.Mantenga a los ratones en un régimen libre de oxígeno durante seis días y eutanasiarlos en P10. Arreglar cerebros de cachorros eutanasiados en 4%PFA, a cuatro grados, de la noche a la mañana. Retire la solución PFA y sustitúyalo por una solución de sacarosa al 30%.Deje los cerebros a cuatro grados hasta que se hundan hasta el fondo del vial. Transfiera los cerebros a un molde de incrustación desechable aproximadamente medio lleno de medio crio-inclusión. Congela el cerebro incluido a 80 grados.Corte secciones coronales de 60 micras de espesor con un criostato. Secciones de proceso para inmunofluorescencia anti-GFP, anti-RFP y contrarrestenlas con solución DAPI. Establezca los parámetros de trabajo del microscopio confocal de forma adecuada como se muestra.Recoger imágenes de rebanadas inmunoensayadas, seleccionando GFP campos fotográficos positivos ricos en neuronas ciegas de la distribución de la señal RFP. Exporta las imágenes como archivos ND2 y genera las máximas proyecciones z de ellas como archivos TIFF. Para permitir la esqueletización posterior de la neurona ciega del genotipo celular, oculte la señal roja.Para ello, añada una capa de ajuste. Seleccione los niveles, seleccione rojo. Establezca la salida en cero.Y guarde el archivo como tal. La esqueletización la realiza posteriormente un nuevo operador, que no tenía acceso previo a los archivos rojos sin formato originales. Para cada archivo rojo oculto, abra el archivo, añada una capa de dibujo a la imagen principal y seleccione la herramienta de lápiz.Rastree el somer sobre la base de la señal GFP. Luego, rastrea las neuritas. Por último, guarde el archivo mutlilayer, incluidas las siluetas neuronales.El análisis posterior de esqueletos neuronales puede ser realizado por cualquiera de los operadores. Abra cada archivo mulitlayer, cree nuevos archivos vacíos en escala de grises de 16 bits con fondo negro. Uno por neurona.Copie y pegue siluetas neuronales individuales, desde la imagen principal, hasta los archivos en escala de grises. Vuelva al archivo multicapa y desactive la capa de ajuste para revelar genotipos neuronales. Guarde los archivos en escala de grises de 16 bits, anotando los genotipos de neurona correspondientes.Importa imágenes en escala de grises en ImageJ una por una, y analiza esqueletos por el plugin NeurphologyJ. Recopile datos primarios seleccionados de NeurophologyJ, área total de longitud de neurita, puntos de unión y puntos finales, en una hoja de cálculo y empújelos para calcular parámetros morfométricos secundarios. El protocolo de ingeniería que proponemos permite coducducir la gran mayoría de las neuronas objeto de investigación, con los conjuntos transgenes previstos.Además, permite alcanzar una homogeneidad sustancial de los niveles de expresión transgénero dentro de la población celular transducida. Una característica clave de nuestro procedimiento, es su configuración emparejada. Una prueba y un grupo de precursores de control se diseñan por separado, se mezclan 1:1 y finalmente se co-transplantan.Este enfoque emparejado facilitará la detección de diferencias de resultados específicamente vinculadas a distintos genotipos. En este ejemplo, analizamos secciones coronales de cachorros trasplantados, diez días después de la coinyección interventricular de precursores de neuronas y control de Foxg1. Las imágenes de grupos de neuronas fueron adquiridas con microscopía confocal.Los archivos Z-stack se utilizaron para calcular las proyecciones máximas. Las siluetas neuronales fueron trazadas manualmente. Aquí, las siluetas verdes y amarillas representan Foxg1 sobre-expresando y controlando las neuronas, respectivamente.Finalmente, los parámetros primarios obtenidos por el análisis de NeurphologyJ, se emplearon para el cálculo de índices morfométricos secundarios, como se ilustra. Este es un protocolo simple que permite al investigador evaluar el impacto que la expresión mixta de un gen dado, puede ejercer sobre el control fino del desarrollo de neurite darth in vivo. Las principales ventajas de este protocolo son dos.El número existente de genes implicados en la morfogénesis neuronal puede caracterizarse funcionalmente in vivo, en ausencia de las líneas teratogénicas correspondientes. Y se necesitan menos animales para el análisis para obtener los resultados estadísticos significativos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Investigación

Genética

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...