Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Vi tackar Mihn Duc göra för hans bidrag till tidig inrättandet av detta förfarande.

Alla metoder och procedurer som beskrivs här har godkänts av SISSA Organismo preposto Al Benessere animale (SISSA IACUC).
1. generering av konstruerade "gröna" progenitorceller pooler
<ol><li>Beredning av den "gröna" poolen
	<ol>
<li>Para en vild-typ CD1 hona med en Mtaptegfp/+ grundare16. Euthanize den gravida dammen av livmoderhalscancer dislokation vid 12,5 dagar efter coitum (dag 0 bestäms av vaginal plugg inspektion) och...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Specifika aspekter/steg i detta förfarande är kritiska och kräver särskild uppmärksamhet. För det första måste (a) operatörerna vara tillräckligt utbildade för att på ett säkert sätt manipulera lentivirus i en BSL-2-kompatibel labbmiljö. För det andra, (b) före blandning "test" och "kontroll" neurala preparat, är det obligatoriskt att noggrant tvätta de två motsvarande neurosphere suspensioner som beskrivs, för att förhindra fördröjd korsinfektion av de två preparaten på grund av oönskade lenti...

Här beskriver vi en enkel metod som vi utvecklat för att dissekera in vivo gen kontroll av neuronala cytoarchitecture. Baserat på in vitro-Engineering av neuronala prekursorer, deras transplantation till neonatal hjärna och Parade morfometriska utvärdering av "test" och "kontroll" celler, det gör det möjligt att avslöja funktionella konsekvenserna av test gener i fin kontroll av neuronala morfologi i en snabbt och prisvärt sätt. För att undersöka in vivo gen kontroll av neuronala arkitektur, tre viktiga tekniska frågor måste åtgärdas: (1) att uppnå en tillräckligt mönstrad gen-of-Interest (GOI) uttryck och en noggrann kvantitativ kontroll av det; (2) få en korrekt segmenterad visualisering av distinkta neuronala silhuetter; (3) framkalla statistisk signifikans av resultat samtidigt anställa ett begränsat antal djur.
När tillgängliga, mus Mutant linjer hyser tetracyklin (tet)-kontrollerade transgener kan vara det bästa verktyget för att ta itu med den första frågan1. Alternativt kan somatisk transgenes vara anställd. I sådana fall levereras transgenen via elektroporation2 eller viral signaltransduktion3. Därefter bibehålls den som en Episome (t. ex. vid standard elektroporation4), eller det är integrerat i genomet (slumpmässigt, via antiretrovirala integras5; eller på en definierad plats, via CRISPR-befordrad homolog REKOMBINATION (slendr)6 ).
För det andra kan neuronala silhuett visualisering uppnås via (a) glesa enhetliga märkning eller (b) tät differential märkning. När det gäller glesa märkning, avancerade Golgi-liknande metoder kan användas7, utvalda neuronala minisets kan fyllas med biocytin8, och salt-och peppar märkning kan erhållas tack vare en glest uttryckt Transgene. En sådan transgen kan visa brokig transkription (Thy-EGFP)9 eller kan aktiveras genom stokastisk rekombination (morf)10. När det gäller (b), State of Art strategier inkluderar CRE-medierad stokastisk rekombination inom en multi-floxed fluorprotein transgenens array (Brainbow)11, samt piggyBac-transposase-driven genomisk integration av fluorproteingener, tidigare levereras via somatisk transgenes (klon)12.
När det gäller den tredje frågan, är morphometriska resultatet ofta påverkas av en stor slumpmässig variation, som härrör från Inter-Animal skillnader och cell-injektion oförutsedda händelser. På grund av detta, är ett stort antal djur vanligtvis används för att uppnå den statistiska kraft som krävs för att bedöma GOI morfometriska aktivitet.
De metoder som tidigare beskrivits förlitar sig ofta på avancerade tekniska färdigheter och kräver iögonfallande ekonomiska resurser, vilket kan begränsa deras spridning inom forskarvärlden. För att kringgå dessa frågor, tänkte vi en enkel och enkel pipeline för att dissekera gen kontroll av neuroarchitecture in vivo på ett snabbt och prisvärt sätt. Detta är inspirerat av en liknande Co-transplantation design som tidigare utvecklats för snabb in vivo utvärdering av antiblastic transgenens aktivitet13.
Specifikt, det är tänkt att samtidig transplantation av in vitro-konstruerade "gröna" neurala prekursorer ("test" och "kontroll" celler) i en "svart" mottagare neonatal hjärna kan samtidigt fastställa de tre viktiga frågor som anges ovan. I själva verket, in vitro-lentiviral Engineering av prekursorer, i välkontrollerade förhållanden, tillåter underhåll av variationer av neuronala transgenens uttryck på ett minimum, långt under som vanligtvis förknippas med in vivo somatiska manipulationer (utförs tidigare fjorton , 15 och i våra opublicerade resultat). Den resulterande noggranna kontrollen av genuttrycket är jämförbar med den som uppnås genom tettkontrollerade transgena modeller. Kostnaderna för detta förfarande är dock långt under de som härrör från upprätthållandet av en transgen mus linje. Nästa, fri-hand cell injektion är lätt och kräver minimal träning. Dessutom kan mängden märkta prekursorer som injiceras i varje hjärna lätt justeras för att uppnå ett tillräckligt ackumulerat antal glest distribuerade prekursorer, samtidigt som det totala antalet transplanterade djur hålls på ett minimum. Sist men inte minst, samtidig injektion av olika fluoro-märkta, "test" och "kontroll" prekursorer och efterföljande Pairwise statistisk analys av resultaten motverka effekterna av Inter-Animal experimentell variation, vilket gör det möjligt att nå statistisk signifikans av resultat, även vid analys av ett begränsat antal individer13.
Det bör betonas att denna metod, om än snabb och billig, har två huvudsakliga begränsningar. För det första är den utformad för att undersöka cell-autonom gen kontroll av neuronala arkitektur, och det är inte lämpligt att ta itu med miljökontroll. För det andra, som transplanterade neuronala prekursorer nå sin slutliga plats genom ett heterokroniskt schema, är denna metod att föredra att modellera neuroarchitectonics kontroll inträffar tidigare migration slutförande.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Gen kontroll av neuronala cytoarchitecture är för närvarande föremål för intensiv utredning. Beskrivs här är en enkel metod som utvecklats för att studera in vivo gen kontroll av neokortikala projektion neuron morfologi. Denna metod är baserad på (1) in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer som "test" och "kontroll" celler, (2) deras co-transplantation till vildtyp hjärnor, och (3) Parade morfometriska utvärdering av deras neuronala derivat. Specifikt, E 12.5 pallial prekursorer från panneuronala, genetiskt märkta givare, är anställda för detta ändamål. De är konstruerade för att dra nytta av utvalda initiativtagare och tetON/OFF-teknik, och de är fria händer transplanteras in neonatal laterala ventriklar. Senare, vid immunofluorescensitering av mottagar hjärnor, silhuetter av transplanterade nervceller matas in neurphologyj programvara med öppen källkod, deras morfometriska parametrar extraheras, och genomsnittlig längd och branchning index beräknas. Jämfört med andra metoder, erbjuder detta en tre huvudsakliga fördelar: det tillåter att uppnå fin kontroll av transgenens uttryck till rimliga kostnader, det kräver bara grundläggande kirurgiska färdigheter, och det ger statistiskt tillförlitliga resultat vid analys av en begränsad antal djur. På grund av dess utformning, dock, det är inte tillräckligt för att lösa icke cell-autonom kontroll av neuroarchitecture. Dessutom, det bör företrädesvis användas för att undersöka neurit morfologi kontroll efter avslutad neuronala migration. I sin nuvarande formulering är denna metod utsökt trimmad för att undersöka gen kontroll av glutamatergic neokortikala neuron arkitektur. Dra nytta av transgena linjer som uttrycker EGFP i andra specifika neurala celltyper, det kan återanvändas för att ta itu med gen kontroll av deras arkitektur.

Det finns fem primära datauppsättningar som ger användbar information om viktiga aspekter av förfarandet, den första är (1) effektivitet neuralprekursorer transduktion och co-transduktion av lentivirala vektorer. (2) ett exempel på huvuddragen hos de projektansvariga som används för att driva "test genen". (3) ett exempel på konstruerade celler redo för transplantation. (4) en tecknad serie med viktiga processuella uppgifter om cell mikroinjektion i neonatal hjärnan. (5) en sa...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Baserat på in vitro lentiviral Engineering av neuronala prekursorer, deras samtidig transplantation till vildtyp hjärnor och Parade morfometriska utvärdering av "test" och "kontroll" derivat, denna metod möjliggör noggrann modellering av in vivo gen kontroll av neokortikala neuron morfologi på ett enkelt och prisvärt sätt.

Intraventrikulär transplantation av konstruerade neuronala prekursorer för in vivo Neuroarkitekturstudier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Det övergripande målet med denna teknik är bedömningen av effekten av genuttryck manipulationer på när neuronal arkitektur in vivo. Vår första viktiga fördel med detta förfarande jämfört med dem som bygger på en neutral elektroporation, är den fina kontrollen av genuttryck nivåer. Specifikt möjliggör denna integrerade pipeline in vivo utvärdering av defekt, upphöjd av små förändringar i genuttryck på kontroll av neuronal cytoarkitektur.Dessutom möjliggör transplantationstestets parstruktur en enorm minskning av antalet djur som är nödvändiga för att få statistiskt signifikanta resultat. Tekniken drar nytta av en föregångare pool som härstammar från Tau EGFP transgena embryon. Denna pool är indelad i två sub pooler som är alternativt infekterade med två lentiviral mixar.För att få en grön testpool och en gul kontrollpool som kommer att medinjiceras. Efter två dagars in vitro-expansion, de resulterande neuro sfärerna är disassociated, blandas en till en, och injiceras med en kapillär i musen ventrikulära rymden. Tio dagar senare, immunofluorescens på koronala sektioner utförs för att möjliggöra jämförelsen mellan test och kontroll nervceller.Slutligen är de immunstained avsnitten avbildas och skeletonized för slutlig utvärdering av morphometric parametrar. Före in vivo transplantation, förbereda föregångaren grön pool. E12.5 embryon, skördas från en gravid damm tidigare parat till en Tau EGFP grundare, ligger i enskilda brunnar av en multi-well platta i PBS lösning.Genotyp dem snabbt genom visuell inspektion under en blå ljus lampa. Ta avstånd från de dissekerade gröna corticesna till enstaka celler. Re-suspend celler i proliferative medium, och dela upp dem i två lika stora sub-pooler.Infektera varje underpool med en dedikerad lentiviral mix. Varje mix innehåller röd etikett virus eller svart kontroll virus. Samt virus för Tet-Off driven transgen eller kontrolluttryck, respektive.Varje lentivirus måste administreras vid multiplicity av infektion av 8. Plate de infekterade cellerna i proliferative medium med 2 mikrogram per milliliter av doxycyklin. Överför celler till inkubatorn och lämna dem i 2 dagar vid 37 grader.Efter 2 dagar måste de två sub-poolerna visas som suspensioner av små neurospheres. Homogent uttrycker det röda fluorescerande proteinet, eller inte. Efter tekniken för prekursorer, som en bedömning array för transplantation i P0 vita lab valpar.Använd de borosilikatglas kapillärerna med evig och inre diameter som motsvarar 1,5 millimeter respektive 1,12 millimeter. Dra kapillären med en P1000 puller. Först, ange dra programmet.För det andra, placera kapillären i hållarna och dra åt dem. Tredje, starta programmet och ta de två drog mikrokapillärerna. Skär kapillärspetsen, för hand med en skalpell, under stereomikroskopet för att få en spets med en yttre diameter på 200-250 mikrometer.Slutligen, placera kapillärerna på plasticine stöd i en sluten Petri-skålen, och överföra den under huven. Desinficera optiska fibrer och placera dem under huven. Blanda EGTA och Fast Green master mixar, för att förbereda cell spårämne lösning, och placera den igen under huven.Skär små bitar av laboratoriet tätning film för cellupphängning spotting. Och slutligen, förbereda en lösning på 1 milligram per milliliter steril doxycyklin bortskaffas i en 0,3 milliliter spruta. Injektionsröret är förberett från två latexrör.Fixa en hård plast mun bit till ena änden av en latex rör. Sedan, fixera kapillärhållaren till ena änden av den andra latexröret. Anslut de fria ändarna av de två latexrören från ett 0,45 mikrometersterilfilter, som barriär mot operatörsbakterier.Placera den resulterande aspiratorrörsenheten på en plastinhållare som ska hållas under huven. Samla, testa och kontrollera neurosfärer i separata rör. Centrifugera neurosfären suspensioner och ersätta supernatanten med PBS.Upprepa den här sekvensen två gånger till. Centrifugera neurosfär suspensioner, ersätta supernatanten genom trypsinlösning, och pipettera cellpelletsen upp och ner, 4, 5 gånger. Lämna celler i inkubatorn i fem minuter för att få en enda cell suspension.Blockera trypsin med trypsin inhibitorlösning. Centrifugceller, och åter upphäva dem i färskt proliferativt medium. Räkna celler av de två poolerna och justera deras koncentration till 100, 000 celler per mikroliter, i proliferativt medium.Blanda sedan test och kontrollceller 1:1 och kontrollera den resulterande blandningen under fluorescensmikroskop. Slutligen, placera blandningen på is under huven. Förbered buren med modern och ungarna på ett bord långt borta från operationsoperatörsområdet.Placera en återhämtningsbur på en vagn. Sätt en blandning av sågspån tas från moderns bur på det är botten, och placera återhämtning bur under en lampa. Bortsett, ställ en islåda täckt av en aluminiumfolie för anestesi av P0 valpar.Strax före transplantation, lägga till en 1 till 10 volym av cell spårämne lösning till en volym av cell suspension, och plats tre microliters av den resulterande mixen på en bit av laboratoriet tätning film. Placera valpen på den svala, aluminiumfolie i en minut, och kontrollera att den är helt sövd. Under tiden aspirera de 3 mikroliter av injektion blanda in i glas kapillären.Torka försiktigt huvudet på den sövda valpen med 70%etanol. Därefter lokalisera den på den optiska fibern, för att tydligt identifiera de kortikala halvkloten. Gå in i kapillären i fronten och komma åt ventrikulärt hålrum.Medan du gör det, uppmärksamma att inte skada blodkärlen. För att förhindra skador av ganglionic eminens, rotera nålen i laterled sett med trettio grader. Injicera försiktigt cellerna i kaviteten och övervaka deras diffusion med hjälp av Fast Green.Vänta i fem till tio sekunder. Ta bort glasnålen, var noga med att inte aspirera cellupphängningen och kasta den i en lämplig kasseringsbehållare. Före valpåterhämtning från anestesi, injicera 150 mikroliter av doxylösning intraperitonealt, för att hålla transgena uttryck fortfarande avstängd efter transplantationen.Placera ungarna omedelbart under lampan efter injektionen för återhämtning. Lämna ungarna där i fem till tio minuter, och när de är helt vakna, placera dem i buren med modern. Observera de opererade ungarna i två till tre timmar, för att säkerställa att modern accepterar dem.Förse buren med dricksvatten som innehåller 0.5mg/mL doxycyklin och sackaros, att upprätthålla den transgena uttryck av. Byt ut doxycyklin som innehåller vatten mot doxyfritt vatten fyra dagar efter transplantation. Således aktivera trans-genen i postmitotiska nervceller.Håll möss i en doxy-fri regim i sex dagar, och avliva dem på P10. Fixa hjärnor från avlivade ungar i 4%PFA, vid fyra grader, över natten. Ta bort PFA-lösningen och ersätt den med 30%sackaroslösning.Låt hjärnan vara i fyra grader tills de sjunker till injektionsflaskans botten. Överför hjärnorna till en disponibel inbäddning mögel ungefär hälften fylld med cryo-integration medium. Frys den medföljande hjärnan i 80 grader.Skär 60 mikron tjocka koronasektioner med hjälp av en kryostat. Process sektioner för anti-GFP, anti-RFP immunofluorescens och counterstain dem med DAPI lösning. Ställ in arbetsparametrar av konfokalmikroskopet på lämpligt sätt enligt bilden.Samla bilder av immunoassayed skivor, välja GFP positiva neuron-rika fotografiska fält blinda av RFP signal distribution. Exportera bilderna som ND2-filer och generera maximal z-projektioner av dem som TIFF-filer. För att möjliggöra efterföljande neuron skeletonization blind av cell genotyp, dölja den röda signalen.Det gör du genom att lägga till ett justeringslager. Välj nivåer, välj röd. Ställ in utdata till noll.Och spara filen som sådan. Skeletonization utförs därefter av en ny operatör, som inte hade någon tidigare tillgång till ursprungliga vanliga röda filer. För varje dold röd fil öppnar du filen, lägger till ett ritlager i den primära bilden och väljer pennverktyget.Spåra somer på grundval av GFP signal. Spåra sedan neuriterna. Slutligen, spara mutlilayer filen, inklusive neuronala silhuetter.Efterföljande analys av neuronala skelett kan utföras av antingen operatör. Öppna varje mulitlayerfil, skapa nya tomma 16-bitars gråskalefiler med svart bakgrund. En per neuron.Kopiera och klistra in enstaka neuronala silhuetter, från den primära bilden, till gråskalefilerna. Kom tillbaka till flerskiktsfil och stäng av justeringsskiktet för att avtäcka neuronala genotyper. Spara 16-bitars gråskalefiler, kommentera motsvarande neuron genotyper.Importera gråskalebilder i ImageJ en efter en, och analysera skelett av NeurphologyJ plugin. Samla in valda NeurophologyJ primära data, total yta av neurit längd, fästpunkter och slutpunkter, i ett kalkylblad, och anställa dem för att beräkna sekundära morfometer parametrar. Den tekniska protokoll vi föreslår gör det möjligt att cotransduce de allra flesta nervceller föremål för utredning, med den avsedda transgener uppsättningar.Dessutom gör det möjligt att uppnå en betydande homogenitet av transgena uttrycksnivåer inom den transduced cellpopulationen. En viktig funktion i vårt förfarande, är det är ihopkopplad konfiguration. Ett test och en kontroll föregångare pool är separat konstruerade, blandade 1:1, och slutligen co-transplanteras.Denna parade metoden kommer att underlätta detektering av resultat skillnader särskilt kopplade till distinkta genotyper. I detta exempel analyserade vi koronal sektioner av transplanterade ungar, tio dagar efter interventricular co-injection av Foxg1 över-uttrycker neuron prekursorer och kontroll dem. Bilder av grupper av nervceller förvärvades med confocal mikroskopi.Z-stack-filer användes för att beräkna maximala projektioner. Neuronal silhuetter spårades manuellt. Här representerar gröna och gula silhuetter Foxg1 över-uttrycker och kontroll nervceller, respektive.Slutligen primära parametrar som erhållits genom NeurphologyJ analys, var anställda för beräkning av sekundära morphometric index, som illustreras. Detta är ett enkelt protokoll som gör det möjligt för forskaren att utvärdera den inverkan som det blandade uttrycket av en viss gen, kan utöva på fin kontroll av neurit utveckling darth in vivo. De främsta fördelarna med detta protokoll är två.Befintliga antalet gener som deltar i neuronal morphogenesis kan vara funktionellt karakteriseras in vivo, i avsaknad av motsvarande teratogena linjer. Och färre djur behövs för att analysen ska få de signifikanta statistiska resultaten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiala könsceller Transplantation för CRISPR/Cas9-baserade bli ledande i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroskop och Transplantation teknik för Nasonia vitripennis genomet Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat Gene tester i klinisk kohortstudier med multiplexade genotypning och masspektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralåga ingående Genome Sequencing bibliotek förberedelse från enda Tardigrade prov

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerade, Cell typspecifika uttryck i Arabidopsis thaliana genom LhGR-medierad Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumör Organoider från genetiskt modifierade musmodeller av prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...