Name: intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Biz bu prosedürün erken kurulumu için onun katkısı için teşekkür ederiz.

Burada açıklanan tüm yöntemler ve prosedürler SıSıS Organizmo preposto al Benessere Animale (SıSAM ıERUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Mühendislik "yeşil" progenitör havuzları üretimi
<ol><li>"Yeşil" havuzun hazırlanması
	<ol>
<li>Mate bir Wild-tip CD1 kadın bir MtaptEGFP/+ kurucusu16. 12,5 gün Post-coitum (gün 0 vajinal fiş denetimi ile belirlenir) ve embriyonik gün 12,5 (e 12.5) embriyolar hasat servika...

<ol>
	<li>Kistner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-mediated+quantitative+and+tissue-specific+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice.">Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+Viral+Injection+of+the+Neonatal+Mouse+Brain+for+Persistent+and+Widespread+Neuronal+Transduction.">Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKII&#946;+2+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKII&#946; 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nature Neuroscience. , (2011).</li><li>Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Fezf2+directs+the+differentiation+of+neural+stem+cells+in+the+subventricular+zone+toward+a+cortical+phenotype.">The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).</li><li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput,+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+in+Vivo+Genome+Editing.">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing.</a> Cell. , (2016).</li><li>Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Golgi-Cox+and+immunofluorescence+using+confocal+microscopy.">Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy.</a> Brain Structure and Function. , (2011).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fezf2-Ctip2+genetic+pathway+regulates+the+fate+choice+of+subcortical+projection+neurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. , (2000).</li><li>Lu, X. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically-directed+Sparse+Neuronal+Labeling+in+BAC+Transgenic+Mice+through+Mononucleotide+Repeat+Frameshift.">Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift.</a> Scientific Reports. , (2017).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nature Methods. , (2013).</li><li>Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLoNe+is+a+new+method+to+target+single+progenitors+and+study+their+progeny+in+mouse+and+chick.">CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick.</a> Development. , (2014).</li><li>Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+as+a+novel+tool+to+suppress+glioblastoma.">Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+and+Foxg1+inhibit+gliogenesis+and+promote+neuronogenesis.">Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis.</a> Stem Cells. , (2010).</li><li>Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+activation+of+haploinsufficient+Foxg1+gene+in+murine+neocortex.">RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex.</a> Scientific Reports. , (2016).</li><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development.">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nature Neuroscience. , (2001).</li><li>Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+mouse+neural+stem+cell+precursors.">Culture of mouse neural stem cell precursors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Park, J. J., Cunningham, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Sectioning+of+Slice+Preparations+for+Immunohistochemistry.">Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2007).</li><li>Puzzolo, E., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-cerebral+histogenesis+in+the+opossum+Monodelphis+domestica:+Generation+of+a+hexalaminar+neocortex+in+the+absence+of+a+basal+proliferative+compartment.">Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment.</a> Neural Development. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NeurphologyJ Manual. , (2012).</li><li>Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxg1+Overexpression+in+Neocortical+Pyramids+Stimulates+Dendrite+Elongation+Via+Hes1+and+pCreb1+Upregulation.">Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li></ol>

Bu prosedürün spesifik yönleri/adımları önemlidir ve özel dikkat gerektirir. İlk olarak, (a) operatörler, bir BSL-2 uyumlu laboratuvar ortamında lentivirüsleri güvenli bir şekilde yönetmek için yeterli derecede önceden eğitilmelidir. İkinci olarak, (b) önce Mix "test" ve "kontrol" nöral preparatlar, dikkatle açıklandığı gibi iki karşılık gelen nöroküre süspansiyonları yıkamak için zorunludur, istenmeyen lentiviral nedeniyle iki preparatların herhangi bir gecikme çapraz enfeksiyon önle...

Burada, nöronal sitonyonunda in vivo gen kontrolünü incelemek için geliştirdiğimiz basit bir yöntem açıklanmaktadır. Nöronal öncülerin in vitro mühendisliğine dayanarak, yenidoğan beynine nakli ve "test" ve "kontrol" hücrelerinin eşlenmiş morfometrik değerlendirilmesi, test genlerinin fonksiyonel etkilerini, nöronal morfolojinin ince kontrolünde bir hızlı ve uygun fiyatlı bir şekilde. Nöronal mimarinin in vivo gen kontrolünü araştırmak için, üç önemli teknik sorun ele alınmalıdır: (1) yeterince desenli gen-of-faiz (GOı) ifade ve doğru bir nicel kontrolü elde; (2) farklı nöronal siluetlerin düzgün segmentlenmiş görselleştirme elde etmek; (3) hayvanların sınırlı sayıda istihdam ederken sonuçların istatistiksel önemi eliciting.
Mevcut olduğunda, tetrasiklin (Tet) kontrollü transgenler taşıyan fare mutant hatları ilk sorunu gidermek için en iyi araç olabilir1. Alternatif olarak, somatik nakliyle istihdam edilebilir. Bu gibi durumlarda transgeni Elektroporasyon2 veya viral dönüştürücü3ile teslim edilir. Sonra, bir episome olarak korunur (örneğin, standart Elektroporasyon4), ya da GENOMA entegre edilmiştir (rasgele, retroviral integrase5ile; veya tanımlanmış bir konumda, Crispr tarafından terfi Homolog rekombinasyon (slendr)6 ).
İkinci olarak, nöronal siluet görselleştirme (a) seyrek üniforma etiketleme veya (b) yoğun diferansiyel etiketleme yoluyla elde edilebilir. Seyrek etiketleme gelince, gelişmiş Golgi benzeri metodolojiler istihdam edilebilir7, seçilmiş nöronal minisetler biocytin tarafından doldurulabilir8, ve tuz-ve-biber etiketleme seyrek ifade transgeni sayesinde elde edilebilir. Böyle bir transgeni (THY-EGFP)9 ya da Stokastik rekombinasyon (Morf)10tarafından aktive edilebilir alacalı transkripsiyon gösterebilir. Gibi (b), devlet sanat stratejileri bir multi-floxed fluoroprotein transgene dizi içinde CRE-aracılı Stokastik rekombinasyon içerir (bRainbow)11, flororoprotein genler piggyBac-transposaz odaklı genomik entegrasyonu yanı sıra, daha önce somatik nakliyle (klon)12ile teslim edilir.
Üçüncü konuya gelince, morfometrik sonuç genellikle büyük bir rasgele değişkenlik etkilenir, hayvan farklılıkları ve hücre enjeksiyon olasılıklardan kaynaklanan. Bu nedenle, çok sayıda hayvan genellikle GOı morfometrik aktivite değerlendirmek için gerekli istatistiksel güç elde etmek için istihdam edilir.
Daha önce açıklanan yaklaşımlar genellikle gelişmiş teknik becerilere güveniyor ve bilimsel toplumlarda difüzyon sınırlarını sınırlayabilen göze çarpan finansal kaynaklara ihtiyaç duyar. Bu sorunları aşmak için, biz hızlı ve uygun bir şekilde nöromimarlık in vivo gen kontrolünü parçalamak için kolay ve basit bir boru hattı tasarlanmış. Bu, daha önce antiblastik transgen aktivitesi13' ün hızlı in vivo değerlendirilmesi için geliştirilen benzer bir ortak transplantasyon tasarımından esinlenilmiştir.
Özellikle, in vitro mühendislik "yeşil" sinir öncüleri ("test" ve "kontrol" hücrelerinin) bir "siyah" alıcı yenidoğan beyin içine Co-transplantasyonu aynı anda yukarıda listelenen üç önemli sorunları düzeltebilirsiniz düşünülmektedir. Aslında, iyi kontrollü koşullarda, precursors In vitro lentiviral mühendislik, en az, genellikle in vivo somatik manipülasyonlar ile ilişkili nöronal transgen ifade değişkenlik bakım sağlar (daha önce gerçekleştirilen 14 , 15 ve bizim yayımlanmamış sonuçlar). Gen ifadesinin elde edilen doğru kontrolü, Tet kontrollü transgenik modellerde elde edilen ile karşılaştırılabilir. Ancak, bu prosedürün maliyetleri, transgenik fare çizgisinin bakımından kaynaklanan bunlardan çok daha fazladır. Sonra, serbest hücre enjeksiyonu kolaydır ve minimal eğitim gerektirir. Dahası, her beyne enjekte etiketli öncülerin miktarı kolayca seyrek dağıtılmış öncüleri yeterli birikimli sayısı elde etmek için ayarlanabilir, aynı zamanda en az nakledilen hayvanların toplam sayısını tutarak. Son olarak, Co-enjeksiyon farklı Fluoro etiketli, "test" ve "kontrol" öncüleri ve sonuçların sonraki ikili istatistiksel analiz, inter-hayvan deneysel değişkenlik etkilerini karşı, ulaşmasına izin sonuçlar istatistiksel önemi, bireylerin sınırlı sayıda Analizi bile13.
Bu, hızlı ve ucuz olsa da, bu yöntemin iki ana sınırlamalara sahip olduğu vurgulanmalıdır. İlk olarak, nöronal mimarinin hücre otonom gen kontrolünü araştırmak için tasarlanmıştır ve çevre kontrolünü ele almak uygun değildir. İkinci olarak, nakledilen nöronal öncüleri heterokronik bir program ile son konumuna ulaştığınızda, bu yöntem geçmiş göç tamamlanma oluşan nöromimarilik kontrolü modeli için tercih edilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1035px;" width="1034">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:487px;">0.3 mL syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD</td>
			<td style="width:135px;">320840</td>
			<td style="width:247px;">store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m sterile filter</td>
			<td>Millex-HV</td>
			<td>SLHU033RS</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 multiwell plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416</td>
			<td>Tebubio</td>
			<td>GTX13970</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839</td>
			<td>Antibodies Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue light lamp</td>
			<td>Nightsea</td>
			<td>BLS2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate capillaries</td>
			<td>Kwik-Fil</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">B&#252;rker chamber</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR719520</td>
			<td>0.0025 mm2, 0.100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-inclusion medium (Killik)</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>05-9801</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable embedding mold</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>07MP7070</td>
			<td>DispoMold07</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycicline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1822</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #3c</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-chicken Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rat Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin Solution</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical fibers</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CLS150X</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P1000 puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000 model</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #484 [LV_lacZ]</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td>
			<td>built in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BB515</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steromicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>store at -20 &#8451;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td>store at +4 &#8451;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraventricular transplantation of engineered neuronal precursors for in vivo neuroarchitecture studies

Nöronal sitanmiminin gen kontrolü Şu anda yoğun soruşturmanın konusu. Burada tarif edilen, neokortikal projeksiyon nöron morfolojisinin in vivo gen kontrolünü incelemek için geliştirilen basit bir yöntemdir. Bu yöntem, (1) "test" ve "kontrol" hücreleri olarak nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendislik dayanmaktadır (2) vahşi tip beyinleri içine onların Co-transplantasyonu, ve (3) onların nöronal türevleri eşleştirilmiş morfometrik değerlendirilmesi. Özellikle, e 12.5 pallial öncüleri panneuronal, genetik olarak etiketlenmiş bağışçılar, bu amaçla istihdam edilmektedir. Bunlar, seçilen organizatör ve Teton/off teknolojisinin avantajlarından yararlanmak için tasarlanmıştır ve onlar yenidoğan lateral ventrikül içine serbest el nakledilir. Daha sonra, alıcı beyinleri immünofluorescence profil üzerine, nakledilen nöronların siluetleri NeurphologyJ açık kaynaklı yazılım içine beslenir, onların morfometrik parametreleri ayıklanır, ve ortalama uzunluğu ve dallanma endeksi hesaplanır. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu üç ana avantaj sunar: uygun maliyetlerde transgen ifadesinin ince kontrolünü elde etmesini sağlar, sadece temel cerrahi becerileri gerektirir ve sınırlı bir analiz üzerine istatistiksel olarak güvenilir sonuçlar verir hayvan sayısı. Onun tasarımı nedeniyle, ancak, nöromimarlık non Cell-otonom kontrol adrese yeterli değildir. Dahası, tercihen nöronal göç tamamlandıktan sonra nörit morfoloji kontrolünü incelemek için kullanılmalıdır. Şu anki formülasyonunda, bu yöntem glutamatergik neokortikal nöron mimarisinin gen kontrolünü incelemek için zarif bir şekilde ayarlanmıştır. Diğer belirli nöral hücre türlerinde EGFP ifade transgenik hatları yararlanarak, kendi mimarisi gen kontrolünü ele almak için yeniden yapılabilir.

Prosedürün temel yönleri hakkında yararlı bilgiler sağlayan beş birincil veri kümesi vardır, ilk varlık (1) nöral öncülerin iletim ve lentiviral vektörler ile ortak Dönüştürücüsü verimliliği. (2) "test gen" sürücü için istihdam organizatörler temel özellikleri bir örnek. (3) transplantasyon için hazır tasarlanmış hücreler örneği. (4) yenidoğan beynin içine hücre Mikroenjeksiyonu anahtar usul detayları da dahil olmak üzere bir karikatür. (5) tüm m...

Watch this Scientific Journal Video about Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies at JoVE.com

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Nöronal öncülerin in vitro lentiviral mühendisliğine dayanarak, vahşi tip beyinleri ve "test" ve "kontrol" türevlerinin eş-transplantasyonu, bu yöntem, neokortikal in vivo gen kontrolünde doğru modelleme sağlar basit ve ekonomik bir şekilde nöron morfoloji.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Bu tekniğin genel amacı, gen ekspresyonu manipülasyonlarının in vivo kortikal nöronal mimari üzerindeki etkisinin değerlendirilmesidir. Bu işlemin nötr bir elektroporasyona dayalı olanlara göre ilk önemli avantajımız gen ekspresyonu seviyelerinin ince kontrolüdür. Özellikle, bu entegre boru hattı defektin in vivo değerlendirmesini sağlar, nöronal sitomimari kontrolü gen ekspresyonundaki küçük değişiklikler ile yüceltilir.Ayrıca, transplantasyon testinin çift yapısı istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gerekli hayvan sayılarında büyük bir azalmaya olanak sağlar. Bu teknik, Tau EGFP transgenik embriyolarından kaynaklanan bir öncül havuzdan yararlanır. Bu havuz alternatif iki lentiviral karışımları ile enfekte iki alt havuzlar ayrılmıştır.Yeşil bir test havuzu ve birlikte enjekte edilecek sarı bir kontrol havuzu elde etmek için. In vitro genişleme iki gün sonra, ortaya çıkan nöro küreler kesilir, bire bir karışık, ve fare ventriküler uzayda bir kılcal enjekte. On gün sonra, koronal kesitlerde immünororesans test ve kontrol nöronları arasında karşılaştırma sağlamak için yapılır.Son olarak, immünosülbölümler morfometrik parametrelerin nihai değerlendirilmesi için görüntülenir ve iskeletlenir. In vivo transplantasyon dan önce, öncülü yeşil havuzu hazırlayın. E12.5 embriyolar, hamile bir baraj daha önce bir Tau EGFP kurucusu için çiftleştirilmiş hasat, PBS çözüm çok kuyulu plaka bireysel kuyularda ayarlanır.Mavi ışık lambası altında görsel muayene ile hızlı bir şekilde genotip leyin. Parçalanmış yeşil korteksleri tek hücrelerle ayırın. Hücreleri proliferatif ortamda yeniden askıya alın ve eşit büyüklükteiki alt havuza bölün.Her alt havuza özel bir lentiviral karışım bulaştırın. Her karışım kırmızı etiket virüsü veya siyah kontrol virüsü içerir. Yanı sıra Tet-Off tahrikli transgen veya kontrol ifadesi için virüsler, sırasıyla.Her lentivirus 8 enfeksiyon çokluğu uygulanmalıdır. Plaka doksisiklin mililitre başına 2 mikrogram ile proliferatif ortamda enfekte hücreleri. Hücreleri kuvöze aktarın ve 37 derecede 2 gün bekletin.2 gün sonra, iki alt havuzları küçük nörosferlerin süspansiyonlar olarak görünmelidir. Kırmızı floresan proteini homojen bir şekilde ifade ediyor ya da ifade etmiyor. Öncüllerin mühendislik sonra, P0 beyaz laboratuvar yavruları transplantasyon için bir değerlendirme dizisi ayarlayın.Sırasıyla 1,5 milimetre ve 1,12 milimetreye eşit ebedi ve iç çapı olan borosilikat cam kılcal damarları kullanın. P1000 çekmecesi ile kılcal damarı çekin. İlk olarak, çekme programına girin.İkincisi, tutucular içine kılcal yerleştirin ve onları sıkın. Üçüncü olarak, programı başlatmak ve iki çekti mikrocapiller almak. 200-250 mikrometre harici çapı ile bir ipucu elde etmek için stereomikroskop altında, bir neşter ile elle, kılcal ucu kesin.Son olarak, kapalı bir Petri kabında plastik destek üzerine kılcal damarları yerleştirin ve kaputun altına aktarın. Optik lifleri dezenfekte edin ve kaputun altına yerleştirin. EGTA ve Fast Green ana karışımları karıştırın, hücre izleyici çözeltisi hazırlamak için, ve kaputun altına tekrar yerleştirin.Hücre süspansiyon tespit için laboratuvar sızdırmazlık filmi küçük parçalar kesin. Ve son olarak, bir 0.3 mililitre şırınga atılır mililitre steril doksisiklin başına 1 miligram bir çözüm hazırlamak. Enjeksiyon tüpü iki lateks tüpten hazırlanır.Bir lateks tüp bir ucuna sert bir plastik ağız parçası sabit. Daha sonra, diğer lateks tüpbir ucuna kapiller tutucu düzeltmek. Operatör mikroplara karşı bir bariyer olarak, 0,45 mikrometre steril filtreden iki lateks tüpün serbest uçlarını bağlayın.Ortaya çıkan aspiratör tüp montajını kaputun altında tutulacak plastik bir tutucuüzerine yerleştirin. Nörosferleri ayrı tüplerde toplayın, test edin ve kontrol edin. Santrifüj nörosfer süspansiyonlar ve PBS tarafından supernatant değiştirin.Bu sırayı iki kez daha tekrarlayın. Santrifüj nörosfer süspansiyonlar, tripsin çözeltisi ile supernatant değiştirin, ve pipet hücre pelet yukarı ve aşağı, 4, 5 kez. Tek bir hücre süspansiyonu almak için hücreleri beş dakika kuvözde bırakın.Tripsin inhibitörü çözeltisi ile trypsin'i bloke edin. Santrifüj hücreleri, ve taze proliferatif ortamda onları yeniden askıya. İki havuzun hücrelerini sayın ve konsantrasyonlarını proliferatif ortamda mikrolitre başına 100,000 hücreye ayarlayın.Daha sonra, test ve kontrol hücreleri 1:1 karıştırın ve bir floresan mikroskop altında ortaya çıkan karışımı kontrol edin. Son olarak, kaputun altında buz üzerinde karışımı yerleştirin. Anne ve yavrular ile birlikte kafesi cerrahi operatörlük alanından uzaktaki bir masada hazırlayın.Bir kurtarma kafesi bir sepet e yerleştirin. Annenin kafesinden alınan talaş karışımını dibine koyun ve iyileşme kafesini bir lambanın altına yerleştirin. Kenara, P0 yavruların anestezi için alüminyum folyo ile kaplı bir buz kutusu ayarlayın.Transplantasyondan hemen önce, bir hücre süspansiyonuna 1 ila 10 hacimlik bir hücre izleyici çözeltisi ekleyin ve ortaya çıkan karışımın üç mikrolitresini laboratuvar sızdırmazlık filminin üzerinde noktalayın. Bir dakika için serin, alüminyum folyo üzerinde yavru yerleştirin ve tamamen anestezi olup olmadığını kontrol edin. Bu arada, cam kılcal içine enjeksiyon karışımı 3 mikrolitre aspire.% 70 etanol ile anestezip başını nazikçe silin. Sonra, kortikal yarımküreyi net bir şekilde tanımlamak için optik fiberüzerinde bulun. Ön içine kılcal girin ve ventriküler kavite erişin.Bunu yaparken, kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Ganglionik saygınlık zarar görmesini önlemek için, otuz derece yanal iğne döndürün. Hücreleri yavaşça kaviteye enjekte edin ve Fast Green ile difüzyonlarını izleyin.5-10 saniye bekleyin. Hücre süspansiyonuna aspire etmemeye dikkat edin ve uygun bir bertaraf kutusuna atın. Anesteziden yavru iyileşmeden önce, transgenik ekspresyonu nakilden sonra kapalı tutmak için intraperitoneal olarak 150 mikrolitre doksi çözeltisi enjekte edin.Enjeksiyondan sonra, iyileşme için hemen lamba altında yavru yerleştirin. Yavruları 5-10 dakika orada bırakın ve tamamen uyandıklarında, onları annesiyle birlikte kafese koyun. Annenin onları kabul etmesini sağlamak için, 2-3 saat boyunca ameliyat edilen yavruları gözlemleyin.Transgenik ifadeyi korumak için kafese 0,5 mg/mL doksisiklin ve sakaroz içeren içme suyu temin edin. Su içeren doksisiklini, nakilden dört gün sonra doksisitsiz su ile değiştirin. Böylece postmitotik nöronlarda trans-gen aktive.Fareleri altı gün boyunca doksizsiz bir rejimde tutun ve P10'da ötenazi yap. Bir gecede 4 derece, 4 derece, pfa ötanazi yavrubeyinleri düzeltmek. PFA çözeltisini çıkarın ve %30 sakaroz çözeltisi ile değiştirin.Şişenin dibine batana kadar beyni dört derecede bırak. Beyinleri, kriyo-dahil etme ortamıyla dolu tek kullanımlık bir katıştırma kalıbına aktarın. Dahil olan beyni 80 derecede dondurun.Bir kriyostat kullanarak 60 mikron kalınlığında koronal kesitler kesin. Anti-GFP, anti-RFP immünoresans için proses bölümleri ve DAPI çözeltisi ile karşı leke. Konfokal mikroskobun çalışma parametrelerini gösterildiği gibi uygun şekilde ayarlayın.RFP sinyal dağılımı kör GFP pozitif nöron açısından zengin fotoğraf alanları seçerek, immünoassayed dilimlerin resimlerini toplamak. Görüntüleri ND2 dosyaları olarak dışa aktarın ve bunların en fazla z-projeksiyonlarını TIFF dosyaları olarak oluşturun. Sonraki nöron iskeletleşme hücre genotip kör izin vermek için, kırmızı sinyal gizlemek.Bunu yapmak için bir ayarlama katmanı ekleyin. Düzeyleri seçin, kırmızı seçin. Çıkışı sıfıra ayarlayın.Ve dosyayı bu şekilde kaydedin. İskeletleştirme daha sonra orijinal düz kırmızı dosyalara daha önce erişimi olmayan yeni bir işleç tarafından gerçekleştirilir. Gizli her kırmızı dosya için dosyayı açın, birincil görüntüye bir çizim katmanı ekleyin ve kalem aracını seçin.GFP sinyalitemelinde somer'ı takip edin. Sonra, nöritlerin izini sür. Son olarak, nöronal siluetler de dahil olmak üzere mutlilayer dosyasını kaydedin.Nöronal iskeletlerin sonraki analizi her iki operatör tarafından da yapılabilir. Her mulitlayer dosyayı açın, siyah arka plan ile yeni boş 16 bit gri tonlama dosyaları oluşturun. Nöron başına bir tane.Birincil görüntüden gri tonlan dosyalara tek nöronal siluetleri kopyalayın ve yapıştırın. Çok katmanlı dosyaya geri alın ve nöronal genotipleri ortaya çıkarmak için ayarlama katmanını kapatın. 16 bit gri tonlama dosyalarını kaydedin ve ilgili nöron genotiplerine açıklama ekleyin.ImageJ'de gri tonlama görüntüleri tek tek içe aktarın ve Iskeletleri NeurphologyJ eklentisi ile analiz edin. Seçili NeurophologyJ birincil verilerini, toplam neurite uzunluğu alanını, ek noktalarını ve bitiş noktalarını bir elektronik tabloya toplayın ve ikincil morfometrik parametreleri hesaplamak için bunları çalıştırın. Önerdiğimiz mühendislik protokolü, araştırmaya tabi olan nöronların büyük çoğunluğunu amaçlanan transgen kümeleriyle bir araya getirmek için izin veriyor.Ayrıca, transjene hücre popülasyonu içinde transgen ekspresyon düzeylerinin önemli bir homojenliği elde etmek için izin verir. İşlemimizin en önemli özelliği, eşleştirilmiş konfigürasyondur. Bir test ve kontrol öncül havuzu ayrı olarak tasarlanır, 1:1 karıştırılır ve son olarak birlikte nakledilir.Bu eşleştirilmiş yaklaşım, özellikle farklı genotiplerle bağlantılı sonuç farklılıklarının saptanmasını kolaylaştıracaktır. Bu örnekte, foxg1 aşırı ifade nöron öncülleri ve kontrol olanları interventriküler co-enjeksiyon on gün sonra, nakledilen yavru koronal bölümleri analiz. Konfokal mikroskopi ile nöron gruplarının görüntüleri alındı.Maksimum projeksiyonları hesaplamak için Z yığını dosyaları kullanıldı. Nöronal siluetler elle takip edildi. Burada, yeşil ve sarı siluetler Foxg1 aşırı ifade ve kontrol nöronları temsil, sırasıyla.Son olarak, NeurphologyJ analizi ile elde edilen primer parametreler, gösterildiği gibi ikincil morfometrik endekslerin hesaplanmasında kullanılmıştır. Bu araştırmacı belirli bir genin karışık ifade, in vivo nötrit gelişimi darth ince kontrol üzerinde uygulayabilir etkisini değerlendirmek için izin veren basit bir protokoldür. Bu protokolün temel avantajları ikidir.Nöronal morfogenezde yer alan mevcut gen sayısı, buna karşılık gelen teratojenik çizgilerin yokluğunda fonksiyonel olarak in vivo olarak karakterize edilebilir. Ve analiz için daha az hayvan önemli istatistiksel sonuçlar elde etmek için gereklidir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...