Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

المؤلف يود أن يشكر الدكتور أسامة الرفاعي من مختبر الدكتور راندي بلاكلي للتوجيه مع تحليل الآلي سويب. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة R01 DA042156 إلى LC.

1-إعداد الحلول ووسائل الإعلام
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت M9 بتذويب خ2بو4 ز 3.0 (22.05 مم)، غ2هبو4 ز 6.0 (42.2 مم)، وكلوريد الصوديوم 5.0 g (85.5 ملم) في 1 لتر مياه يعقم. إضافة مل 1.0 من 1 م MgSO4 (ز 12 في وحدة تخزين نهائي من 100 مل يعقم المياه.) بعد التعقيم. مزيج 100 مل من x 10 الناتج M9 مع 900 مل من ي?...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للقيام تحليل السلوكي، سويب، في C. ايليجانس. هذا البروتوكول بسيط ومباشر مع لا عقبات فنية رئيسية مما يجعل هذا الفحص المستخدم جداً ودية. ومع ذلك، هناك بعض الجوانب الهامة التي تحتاج إلى النظر فيها من أجل القيام بفعالية المقايسة.
وينبغي ال...

الحيوانات أداء مجموعة متنوعة من السلوكيات الفطرية والمعقدة التي هي توسط العصبية المختلفة في تنسيق عمليات إرسال الإشارات معقدة. الناقل العصبي الدوبامين (DA) يتوسط السلوكيات العالية حافظ عبر الأنواع، بما في ذلك التعلم ووظيفة الحركة وتجهيز مكافأة.
ديدان أسطوانية التربة C. ايليجانس، مع نظام عصبي بسيط نسبيا وكذلك معين يتكون من 302 فقط من الخلايا العصبية، يبين السلوكيات ملحوظ المعقدة، بما في ذلك العديد من التي ينظمها دا مثل التزاوج، والتعلم، والمؤن، والحركة ووضع البيض 1-من بين الميزات الأخرى، دورة حياة قصيرة، وسهولة المناولة والحفاظ على إشارات الجزيئات، تسليط الضوء على مزايا استخدام C. ايليجانس كنموذج لدراسة العصبية أساس السلوكيات مصانة.
خنثي C. ايليجانس يحتوي على ثمانية تتميز الخلايا العصبية؛ وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن الذكور ستة أزواج إضافية لأغراض التزاوج. كما هو الحال في الثدييات، وتوليف دا هذه الخلايا العصبية والتعبير عن الناقل دا (دات-1)، بروتين غشائي موجودة حصرا في تتميز الخلايا العصبية، الذي ينقل دا صدر في المشقوق متشابك العودة إلى الخلايا العصبية تتميز. وعلاوة على ذلك، معظم البروتينات المشاركة في كل خطوة من التوليف والتعبئة والتغليف والإفراج عن دا هي المحافظة جداً بين البشر والديدان، ومثل في الثدييات، دا ينظم سلوكيات التغذية والحركة في ايليجانس جيم-2.
C. ايليجانس يزحف على السطوح الصلبة وتسبح مع سلوك سحق مميزة في المياه. من المثير للاهتمام، طفرات تفتقر إلى التعبير عن دات-1 (دات-1) الزحف عادة على سطح صلب، لكنهم فشلوا في الحفاظ على السباحة عندما مغمورة بالمياه. ووصف هذا السلوك كان الشلل الناجم عن السباحة، أو سويب. التجارب السابقة أثبتت أن سويب، جزئيا، ناجم عن وجود فائض دا في المشقوق متشابك التي أوفيرستيمولاتيس في نهاية المطاف مستقبلات D2 مثل بوستسينابتيك (DOP-3). على الرغم من أن المحددة أصلاً في دات-1 خروج المغلوب الحيوانات3، سويب ويلاحظ أيضا في الحيوانات البرية من نوع التعامل مع المخدرات أن كتلة النشاط دات (مثلاً، إيميبرامين4) و/أو حمل الإصدار دا (مثل الأمفيتامين5). من ناحية أخرى، منع التلاعب دوائية أو الجينية تجنب التوليف والإفراج عن دا وحظر إعلان المبادئ-3 وظيفة مستقبلات سويب6. أخذت معا، وهذه البيانات المنشورة بالفعل أنشأت سويب كأداة موثوقة دراسة الآثار السلوكية الناتجة عن البروتينات تحور داخل تتميز نهايات3،،من47 والتي ستستخدم شاشات الجينية إلى الأمام لتحديد مسارات تنظيمية رواية المتورطين في دا مما يشير إلى7،،من89،10،،من1112. بالإضافة إلى ذلك، من خلال توفير قراءات يمكن قياسها بسهولة من السلوك الناجم عن المخدرات في الحيوانات الحية، سويب يتيح توضيح آليات عمل الأدوية مثل الأمفيتامين (أمف) وأزابيروني في تتميز سينابسيس5، 6 , 13 , 14 , 15.
وقد وصف بروتوكولات لإجراء فحوصات سويب قبل16. هنا، نحن تصف بالتفصيل المنهجية والإعداد لإجراء التحليل بهدف توفير دليل مرئي للمجتمع C. ايليجانس لفعالية أداء سويب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

مقايسة السباحة الموصوفة في هذا البروتوكول هو أداة صالحة لتحديد البروتينات التي تنظم تتميز synapses. مماثلة للثدييات، الدوبامين (DA) يتحكم في عدة مهام في C. ايليجانس بما في ذلك النشاط الحركي والتعلم. الظروف التي تحفز دا الإصدار (مثلاً، علاجات المنشطات (أمف)) أو التي تمنع إزالة دا (مثل الحيوانات التي تفتقر إلى الناقل دا (دات-1) التي هي غير قادرة على ريككومولاتينج دا إلى الخلايا العصبية) توليد فائض في دا خارج الخلية وفي نهاية المطاف أدى إلى تحول دون تنقل. هذا السلوك واضح بصورة خاصة عند الحيوانات تسبح في المياه. في الواقع، بينما لا تزال الحيوانات البرية من نوع السباحة لفترة ممتدة، طفرات فارغة دات-1 والبرية من نوع تعامل مع أمف أو مثبطات للناقل دا تنزل إلى أسفل البئر ولا تتحرك. ويطلق على هذا السلوك "الشلل الناجم عن السباحة" (سويب). على الرغم من أن التحليل سويب بشكل جيد، تفتقر إلى وصف مفصل للأسلوب. وهنا يصف لنا دليل خطوة بخطوة لتنفيذ سويب. للقيام التحليل، توضع أواخر الحيوانات 4 مرحلة اليرقات في صفيحة بقعة زجاج الذي يحتوي على محلول السكروز التحكم مع أو بدون أمف. وسجل الحيوانات لسلوكهم السباحة أما يدوياً بواسطة التصور تحت ستيريوسكوبي أو تلقائياً بتسجيل مع كاميرا محمولة على ستيريوسكوبي. ويتم تحليل أشرطة الفيديو ثم استخدام برنامج تعقب، الذي يعطي تمثيل مرئي لسحق التردد والشلل في شكل خرائط الحرارة. ضمان قراءات يمكن قياسها بسهولة من السباحة قدرة الحيوانات النظامين اليدوي والآلي ومما يسهل الفرز للحيوانات إذ تضع الطفرات داخل منظومة تتميز أو للجينات مساعدة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام سويب لتوضيح إليه العمل من المخدرات لتعاطي مثل أمف.

ونقدم مثالاً للمقايسة سويب الناجمة عن العلاج أمف. ويبين الشكل 1 تمثيل تخطيطي لإعداد المقايسة كما هو موضح أعلاه. للفحص اليدوي، وحوالي 8-10 سن L4 متزامنة أواخر المرحلة الديدان يتم جمعها مع جفن أو البلاتين بيك ووضعها في لوحة زجاج بقعة مليئة ميليلتر 40 200 السكروز ?...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

الشلل الناجم عن السباحة "تقييم إشارات الدوبامين" في ايليجانس كاينورهابديتيس

السباحة التي يسببها الشلل (سويب) مقايسة سلوكية راسخة المستخدمة لدراسة الآليات الكامنة الدوبامين إشارات في ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس). ومع ذلك، تفتقر إلى طريقة مفصلة للقيام التحليل. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة سويب.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار الشلل الناجم عن السباحة أو SWIP ، وهو مقايسة سلوكية لتقييم إشارات الدوبامين في C.elegans. SWIP يسمح بسرعة تحديد الجينات داخل أو ذات الصلة إلى المشبك الدوبامين. هذه الطريقة تسمح للتحقيق في الآثار التي تنتجها فائض من الدوبامين خارج الخلية التي تسببها على سبيل المثال من المخدرات أو الطفرات في نقل الدوبامين.لضمان أن جميع الديدان التي تم اختبارها أثناء الفحص تسبح لنفس القدر من الوقت ، يجب نقل الحيوانات بسرعة إلى المحلل. ومن بين الاجراءات سيريشا كودومالا وسيرين سوسي. كلاهما يعملان في مختبريلإعداد ثقافات بداية الدودة ، استخدم ملعقة معقمة لقطع قطع صغيرة من أجار من لوحة تحتوي على C.elegans التي تتغذى بشكل جيد ونقل قطع agar إلى لوحات NA22 E.coli الفردية. بعد احتضان اللوحات في 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام، يؤكد بصريا وجود البالغين gravid تحت مجهر ستيريو. للحصول على مجموعة متزامنة من الديدان ، وبخ الماء على لوحة كاملة من البالغين جرافيد.دوامة بلطف لوحة لإزاحة الديدان واستخدام ماصة التخلص من لنقل الديدان في أنبوب مخروطي البوليسترين 15 ملليلتر. بعد سحب الديدان من لوحة ثانية في الأنبوب ، اجمع الديدان عن طريق الطرد المركزي لثلاثة يغسل في 15 ملليلتر من الماء المصفى في كل غسل. يجب أن تظهر المياه واضحة بعد الغسيل الماضي.بعد الطرد المركزي الأخير، أضف خمسة ملليلترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم الصوديوم المعد حديثاً إلى الديدان وخلطه بسرعة مع دوامة. احتضان الأنبوب على الروك، ووضع قطرة من حل دودة على شريحة المجهر الزجاجي والتحقق من تحلل دودة تحت منظار كل دقيقتين لمدة أربع إلى ثماني دقائق. عندما تم lysed حوالي 70٪ من الديدان وكان قد تم الإفراج عن البيض، على الفور وقف التحلل مع إضافة العازلة البيض.ثم الطرد المركزي الأجنة والجثث دودة أربع مرات resuspending بيليه مع عازلة البيض الطازجة بين يغسل لإزالة أي التبييض المتبقية. بعد الغسيل الأخير، يجب أن تظهر الكريه بيضاء. Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من المياه autoclaved وخمسة ملليلتر من 60 ٪ سكروز لفصل الأجنة من الذبائح عن طريق الطرد المركزي.إزالة الأنبوب بعناية من الطرد المركزي بعد فصل التدرج الكثافة واستخدام ماصة باستور الزجاج لنقل ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الأجنة العائمة في الغضروف المفصلي العلوي في أنبوب مخروطي جديد 15 ملليلتر. اغسل الأجنة ثلاث مرات بالماء المُقلَد ذاتيًا لإزالة السكروز متبوعًا بثلاثة غسولات في المخزن المؤقت M9. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الأجنة على شاكر بين عشية وضحاها في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت M9 الطازج للسماح للبويضات بتفقس والبقاء في مرحلة يرقة L1.بعد ما لا يزيد عن 14 ساعة على شاكر، وغسل اليرقات L1 ثلاث مرات مع الماء الأوتكفا لإزالة أي الفيرومونات الصادرة عن اليرقات وإعادة تعليق بيليه اليرقات في ملليلتر واحد من الماء. تمييع aliquot من الديدان إلى نسبة 1 إلى 10 وإضافة 1:10 ميكرولتر قطرة على شريحة زجاجية وعدد الديدان تحت المجهر ستيريو. كرر للحصول على متوسط عدد الديدان.استخدام ماصة لإضافة ما يكفي من قطرات من حل دودة على درجة حرارة الغرفة NA22 لوحة لبذور ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى الديدان الثالثة للثقافة وترك لوحة نصف مفتوحة حتى قطرات تجف. ثم احتضان لوحة مغطاة ومقلوب في 20 درجة مئوية لحوالي 44 إلى 48 ساعة أو حتى الديدان تصل إلى مرحلة L4 في وقت متأخر كما أكد بصريا تحت مجهر ستيريو. للتقييم اليدوي لـ SWIP، أضف 40 ميكرولترات من محلول التحكم مع أو بدون 0.5 ميلليمولور الأمفيتامين في لوحة بقعة زجاجية.تحت منظار مجسم، واختيار ثمانية إلى 10 في وقت متأخر L4 الددان المرحلة مع اختيار رمش وغمر البيكد في البئر التي تحتوي على الحل حتى الديدان تتحرك قبالة اختيار والسباحة في الحل. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. لاحظ عدد الديدان التي تم إصدارها في البئر ولاحظ وسجل عدد الديدان التي تعرض SWIP في كل علامة دقيقة لمدة إجمالية 10 دقائق.في نهاية الإجراء، انسخ البيانات الخام في جدول بيانات وحساب نسبة الديدان المشلولة بقسمة عدد الديدان المشلولة في كل دقيقة على العدد الإجمالي للدودة التي تم اختبارها في جميع أنحاء الفحص والضرب على 100. نسخ قيم النسبة المئوية في أي برنامج الرسم البياني و الإحصائية و رسم البيانات مع قيم النسبة المئوية SWIP على المحور ص والوقت على المحور س باستخدام تنسيق الرسم البياني س ص. ويمكن إجراء تحليل إحصائي بين المجموعات الخاضعة للمراقبة والمعالجة الأمفيتامينية ووقت العلاج، وذلك مثلا باستخدام التحليل في الاتجاهين والتحليل اللاحق.للتحليل الآلي للشلل الناجم عن السباحة ، وإعداد الكاميرا ، وبرنامج تعقب دودة ، وسيناريو لتشغيل تحليل البرمجيات تتبع واستخدام اختيار رمش لوضع واحدة في وقت متأخر من مرحلة L4 دودة في لوحة الزجاج بقعة كما هو مبين في وقت سابق. ثم تسجيل أشرطة الفيديو السباحة من دودة واحدة في وقت واحد واستخدام برنامج تعقب دودة لحساب وتيرة الانحناءات الجسم، بعد السيناريو المقدمة مع برنامج تتبع للحصول على تردد الدودة سحق، وتوليد خرائط الحرارة من البيانات سحق دودة. معظم الديدان التي تم اختبارها في محلول التحكم تسبح باستمرار لمدة 10 دقائق على الأقل.لا تظهر الديدان المعرضة للتحكم أو الأمفيتامين SWIP في الدقيقة الأولى من المراقبة. ومع ذلك ، في حين أن الديدان المعالجة بمحلول التحكم تستمر في السباحة لمدة 10 دقائق ، تبدأ الديدان المعالجة مع الأمفيتامين في عرض SWIP بعد دقيقتين من العلاج. وبعد 10 دقائق، 66٪ من الحيوانات تظهر SWIP.وتوجد هنا أمثلة على خرائط الحرارة للحيوانات المعرضة للرقابة أو الأمفيتامين مع زيادة متوقعة كبيرة في الشلل الملاحظ في الحيوانات المعالجة با للامفيتامين. قبل محاولة هذا الفحص، ينبغي للمرء أن يكون على دراية جيدة مع قطف والتدريج التنموية من C.elegans. يجب تأكيد مشاركة النظام الدوبامين في سلوك SWIP باستخدام الحيوانات التي تفتقر إلى التعبير عن البروتينات الدوبامين أو عن طريق استنفاد من فديصلات الدوبامين مع ريسربين.يمكن أن يكون SWIP مفيدة في تحديد البروتينات الجديدة المشاركة في آلية عمل الأدوية التي تعمل في المشبك الدوباميني.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

خلق الصور الديناميكية لتقلبات الدوبامين قصير الأجل مع LP-ntPET: أفلام الدوبامين من تدخين السجائر

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

كشف بيت الصمم: اضطرابات كشف إيقاع مع فنجر تزامن التنصت والمهام الإدراكية التوقيت

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

إجراءات لمراقبة الناجم عن السياق تجديد مكيفة بافلوف-السلوك الكحول التماس في الجرذان

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

فحص السريع الدوبامين حيوية مع المسح الضوئي السريع Voltammetry دوري أثناء داخل الفم إدارة منبهة للذوق في الجرذان الصحوة

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

العين تتبع مراقبة لتقييم الوظائف الإدراكية في المرضى الذين يعانون من التصلب الجانبي الضموري

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

ديكتيفاتيونس عكسها المستحثة بالتبريد لدراسة المساهمات القشرية للذاكرة عقبة في القط المشي

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

طرق التحليل الميكانيكي الحيوي لتقييم أداء لاعبي كرة الريشة المحترفين

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

استخدام الكهربائي الوجه لتقييم ردود فعل عضلة الوجه لمسة عاطفية ذوي الخبرة والملاحظة في البشر

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

بروتوكول موحد لاختبار الأفضليات لتقييم رفاهية الأسماك

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

تقييم وظيفة الذاكرة في الفئران الصرع التي يسببها بيلوكاربين

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...