Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Osama Refai fra Dr. Randy Blakely lab for vejledning med automatiseret analyse af SWIP. Dette arbejde blev støttet af midler fra NIH R01 DA042156 til LC.

1. forberedelse af løsninger og medier
<ol><li>Forberede M9 buffer ved at opløse KH2PO4 3,0 g (22.05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM), og NaCl 5,0 g (85,5 mM) i 1 L autoklaveres deioniseret vand. Der tilsættes 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g i en endelige rumfang af 100 mL autoklaveres deioniseret vand) efter autoklavering. Blandes 100 mL af den resulterende 10 x M9 med 900 mL autoklaveres deioniseret vand for at gøre en 1 x løsning.</li>
	<li>For at gøre æg buffer, 6.89...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Her, beskriver vi en trinvis protokol for at udføre en adfærdsmæssige analyse, SWIP, i C. elegans. Denne protokol er enkel og ligetil med ingen store tekniske forhindringer gør dette assay meget bruger venligt. Alligevel er der nogle vigtige aspekter, der skal overvejes for at effektivt udføre analysen.
Pleje bør tages til at sikre, at ormene bruges til analysen er godt fodret, da kosten restriktioner påvirker SWIP17. Skånsom håndtering af orme mens pi...

Dyr udføre en række medfødte og komplekse adfærd, der er medieret af forskellige neurotransmittere koordineres af indviklede signaling processer. Neurotransmitteren dopamin (DA) formidler meget bevaret adfærd på tværs af arter, herunder læring, motorik og belønning behandling.
Jord nematode C. elegans, med en forholdsvis enkel og godt kortlagt nervous system bestående af kun 302 neuroner, viser markant komplekse adfærd, herunder mange, der er reguleret af DA parring, læring, fouragering, bevægelse, og æglægning 1. blandt andre funktioner, korte livscyklus, nem håndtering og bevarelse af signalering molekyler, fremhæve fordelene ved at bruge C. elegans som en model til at studere det neurale grundlag af bevarede adfærd.
Hermafrodit C. elegans indeholder otte dopaminerge neuroner; Udover disse indeholder mandlige seks ekstra par til parring formål. Pattedyr, disse neuroner syntetisere DA og express DA transporter (DAT-1), en membran protein findes udelukkende i dopaminerge neuroner, som transporterer DA udgivet i den synaptiske kløft tilbage i de dopaminerge neuroner. Desuden, de fleste af proteiner involveret i hvert trin i syntesen, emballage og frigivelse af DA er meget bevaret mellem orme og mennesker, og som i pattedyr, DA modulerer fodring adfærd og bevægelse i C. elegans2.
C. elegans kravler på faste overflader og svømmer med en karakteristisk gennemdrøfte opførsel i vand. Interessant, mutanter mangler udtryk for DAT-1 (dat-1) kravle normalt på fast overflade men undlader at opretholde svømning når nedsænket i vand. Dette problem blev kaldt svømning induceret lammelse eller SWIP. Tidligere forsøg påvist, at SWIP, delvis er forårsaget af et overskud af DA i den synaptiske kløft, der i sidste ende overstimulates D2-lignende postsynaptiske receptorer (DOP-3). Selv om oprindeligt identificeret i dat-1 knockout dyr3, SWIP til er også observeret i wild-type dyr behandlet med narkotika at blokere aktiviteten af DAT (fx imipramin4) og/eller fremkalde DA release (fx amfetamin5). På den anden side, forhindre farmakologiske eller genetiske manipulationer afværge syntese og frigivelse af DA og blokerer DOP-3 receptor funktion SWIP6. Taget sammen, har disse allerede offentliggjorte data etableret SWIP som et pålideligt redskab til at studere de adfærdsmæssige effekter forårsaget af muterede proteiner i dopaminerge synapser3,4,7 og skal anvendes til videresende genetiske skærme til identifikation af nye regulerende veje involveret i DA signalering7,8,9,10,11,12. Derudover ved at give en let kvantificerbare udlæsning af narkotika-induceret adfærd i levende dyr, SWIP giver mulighed for belysning af mekanismer for stoffer som amfetamin (Ladeeffekt) og azaperon på dopaminerge synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoller til at udføre SWIP assays har været beskrevet før16. Her, beskriver vi i detaljer den metodologi og setup til at udføre analysen med målet om at give en visuel guide til C. elegans Fællesskabet effektivt udføre SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Svømning analysen er beskrevet i denne protokol er et gyldigt redskab til at identificere proteiner regulering af dopaminerge synapser. I lighed med pattedyr, dopamin (DA) styrer flere funktioner i C. elegans herunder læring og motoriske aktivitet. Betingelser at stimulere DA release (fx amfetamin (Ladeeffekt) behandlinger) eller at forebygge DA clearance (f.eks. dyr mangler DA transporter (dat-1) som er i stand til reaccumulating DA i neuroner) generere et overskud af ekstracellulære DA i sidste ende resulterer i hæmmet locomotion. Denne adfærd er især tydeligt, når dyr svømme i vandet. I virkeligheden, mens wild-type dyr fortsætter med at svømme i en længere periode, dat-1 null mutanter og wild-type behandlet med Ladeeffekt eller hæmmere DA transportørens synker til bunden af brønden og Flyt ikke. Dette problem kaldes "Svømning induceret lammelse" (SWIP). Selvom SWIP analyse er veletableret, mangler en detaljeret beskrivelse af metoden. Her beskriver vi et trin for trin guide til at udføre SWIP. For at udføre analysen, er sent larve fase-4 dyr placeret i en spot glasplade, der indeholder kontrolelementet rørsukkeropløsning med eller uden Ladeeffekt. Dyr er scorede for deres svømning adfærd enten manuelt af visualisering under en Stereoskopet eller automatisk ved optagelse med et kamera monteret på Stereoskopet. Videoer er derefter analyseret ved hjælp af en tracking software, som giver en visuel repræsentation af prygl frekvens og lammelse i form af varme kort. Både manuel og automatiseret systemer sikrer en let kvantificerbare udlæsning af dyrenes svømning evne og dermed lette screening for dyr bærer mutationer i det dopaminerge system eller hjælpeansatte gener. Derudover kan SWIP bruges til at belyse virkningsmekanismen af medicin misbrug såsom Ladeeffekt.

Vi præsenterer et eksempel på SWIP assay induceret af Ladeeffekt behandling. Figur 1 viser et skematisk gengivelse af assay-opsætningen som beskrevet ovenfor. For manuel assay, omkring 8-10 alder synkroniserede sent L4 fase orme er indsamlet med en øjenvipper eller platinum pick og placeret i en spot glasplade, fyldt med 40 µL af 200 mOsm/L saccharose (styringsløsning) eller saccharose med 0,5 mM Ladeeffekt og testet for SWIP.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Svømning induceret lammelse at vurdere dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

Svømning induceret lammelse (SWIP) er en veletableret adfærdsmæssige analysen bruges til at studere de underliggende mekanismer af dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dog mangler der en detaljeret metode til at udføre analysen. Her, beskriver vi en trinvis protokol for SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Det overordnede mål med denne procedure er at demonstrere Svømning-induceret lammelse eller SWIP, en adfærdsmæssig analyse til at vurdere dopamin signalering i C.elegans. SWIP gør det muligt hurtigt at identificere gener inden for eller relateret til dopaminerge synapse. Denne metode gør det muligt at undersøge de virkninger, der produceres af et overskud af ekstracellulær dopamin, der er forårsaget for eksempel af narkotika eller mutationer på dopamin transportøren.For at sikre, at alle de orme, der testes under analysen svømme i samme tidsrum, skal dyrene overføres hurtigt til opløsningen. Demonstration af proceduren vil være Sirisha Kudumala og Serene Sossi. De arbejder begge i mit laboratorium.For at oprette orm starter kulturer, bruge en steril spatel til at skære små stykker agar fra en plade, der indeholder godt fodret C.elegans og overføre agar stykker i individuelle NA22 E.coli plader. Efter inkubering af pladerne ved 20 grader Celsius i tre til fire dage, visuelt bekræfte tilstedeværelsen af gravide voksne under et stereomikroskop. Hvis du vil have en synkroniseret population af orme, skal du sprøjte vand på en tallerken fuld af voksne.Drej forsigtigt pladen for at løsne ormene og bruge en bortskaffelsepipette til at overføre ormene til et 15 milliliter polystyrenkonisk rør. Efter at have trukket ormene fra en anden plade ind i røret, indsamle ormene ved centrifugering i tre vasker i 15 milliliter autoklaveret vand pr vask. Vandet skal være klart efter den sidste vask.Efter den sidste centrifugering tilsættes fem milliliter af en frisklavet natriumhypochloridhydroxidopløsning til ormene og blandes hurtigt med en vortex. Inkuber røret på en rocker, placere en dråbe orm løsning på et glas mikroskop dias og kontrollere for orm lysis under et stereoscope hvert andet minut i fire til otte minutter. Når omkring 70% af ormene er blevet lyset og æggene var blevet frigivet, straks stoppe lysis med tilsætning af æg buffer.Derefter centrifuge embryoner og orm slagtekroppe fire gange resuspending pellet med frisk æg buffer mellem vasker for at fjerne eventuelle resterende blegemiddel. Efter den sidste vask skal pelletsen fremstå hvid. Pelletsuspendrer pellet i fem milliliter autoklaveret vand og fem milliliter 60%saccharose for at adskille embryonerne fra kroppene ved centrifugering.Fjern røret forsigtigt fra centrifugen efter tætheden gradient adskillelse og bruge et glas Pasteur pipette til at overføre tre til fire milliliter af embryoner flyder på den øverste menisk i en ny 15 milliliter konisk rør. Embryonerne vaskes tre gange med autoklaveret vand for at fjerne saccharose efterfulgt af tre vaske i M9 buffer. Efter den sidste vask inkuberes embryonerne natten over i 10 milliliter frisk M9-buffer, så æggene kan klækkes og forblive på L1-larvestadiet.Efter højst 14 timer på rysteren vaskes L1-larverne tre gange med det autoklavervand for at fjerne feromoner, der frigives af larverne, og opsvar larvepellen i en milliliter vand. Fortynd en aliquot af orme til en en til 10 forholdet og tilsæt 1:10 mikroliter dråbe på et glas dias og tælle orme under stereo mikroskop. Gentag for at opnå et gennemsnitligt antal orme.Brug en pipette til at tilføje nok dråber af ormen løsning på en stuetemperatur NA22 plade til frø cirka en gange 10 til den tredje orme for kulturen og lad pladen halvt åben, indtil dråberne tørre ud. Derefter inkubere pladen dækket og på hovedet ved 20 grader Celsius i omkring 44 til 48 timer, eller indtil ormene nå sent L4 fase som bekræftet visuelt under et stereomikroskop. Ved manuel vurdering af SWIP tilsættes 40 mikroliter af kontrolopløsning med eller uden 0,5 millimolar amfetamin i en glaspotplade.Under et stereoscope skal du vælge otte til 10 sene L4-sceneorme med en øjenvippes pick og nedsænke pick i brønden, der indeholder løsningen, indtil ormene bevæger sig ud for pick og svømme ind i løsningen. Start timeren. Bemærk antallet af orme, der frigives i brønden, og observere og registrere antallet af orme, der udviser SWIP ved hvert minuts mærke i i alt 10 minutter.Ved afslutningen af proceduren, kopiere de rå data i et regneark og beregne procentdelen af orme lammet ved at dividere antallet af orme lammet i hvert minut med det samlede antal orme testet i hele analysen og multiplicere med 100. Kopiér procentværdierne til graftegnings- og statistisk software, og plot dataene med procentværdier af SWIP på y-aksen og klokkeslæt på x-aksen ved hjælp af XY-grafformatet. Statistisk analyse blandt kontrol- og amfetaminbehandlede grupper og behandlingstidsrummet kan udføres, f.eks.For automatiseret analyse af svømning-induceret lammelse, oprette kameraet, orm tracker software, og script til at køre tracking software analyse og bruge en øjenvipper pick til at placere en enkelt sen fase L4 orm i et glas spotplade som vist tidligere. Derefter optage svømning videoer af en orm ad gangen og bruge ormen tracker software til at beregne hyppigheden af kroppen bøjninger, efter scriptet leveres med tracking software til at opnå ormen prygl frekvens, og til at generere varme kort fra ormen prygl data. De fleste af de orme, der testes i kontrolopløsningen, svømmer kontinuerligt i mindst 10 minutter.Orme udsat for enten kontrol eller amfetamin viser ikke SWIP i det første minut af observation. Men mens orme behandlet med kontrol løsning fortsætte med at svømme i 10 minutter, orme behandlet med amfetamin begynder at udstille SWIP efter to minutters behandling. Og efter 10 minutter, 66% af dyrene viser SWIP.Her vises eksempler på varmekort over dyr, der udsættes for kontrol eller amfetamin, med en forventet betydelig stigning i lammelsen hos de amfetaminbehandlede dyr. Før du forsøger denne analyse, bør man være godt bekendt med plukning og udviklingsmæssige iscenesættelse af C.elegans. Inddragelsen af dopaminerge system i SWIP adfærd bør bekræftes ved hjælp af dyr, der mangler udtryk for dopaminerge proteiner eller ved udtømning af dopamin vesicles med Reserpin.SWIP kan være medvirkende til at identificere nye proteiner involveret i virkningsmekanismen af lægemidler, der handler på dopaminerge synapsis.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Skabe dynamiske billeder af kortlivede Dopamin Udsving med lp-ntPET: Dopamin film af cigaretrygning

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Afsløring beat Døvhed: Afsløring rytmeforstyrrelser med synkroniseret Finger Tapping og Sanselig Timing Opgaver

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

En procedure til at Overhold Kontekst-induceret Fornyelse af Pavlov-condition Alkohol-søger adfærd i rotter

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Undersøgelse af hurtige Dopamin Dynamics med Fast Scan Cyklisk voltammetri Under Intra-oral smagsstof Administration i Awake Rats

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking Kontrol at vurdere kognitive funktioner hos patienter med amyotrofisk lateral sklerose

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Vendbar køling-induceret deaktiveringer at studere kortikale bidrag til hindring hukommelse i den omvandrende kat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Biomekaniske analysemetoder til at vurdere professionelle badminton Players ' lunge performance

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Ved hjælp af Facial Elektromyografi at vurdere Facial muskel reaktioner til erfarne og observerede affektive Touch hos mennesker

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

En standardiseret protokol for præferencetest for at vurdere fiskenes velfærd

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Vurdering af hukommelsesfunktionen i pilocarpine-inducerede epileptiske mus

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...