Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

De auteurs bedank Dr. Osama Refai van Dr. Randy Blakely van lab voor begeleiding met de geautomatiseerde analyse van SWIP. Dit werk werd gesteund door de financiering van NIH R01 DA042156 LC.

1. bereiding van de oplossingen en Media
<ol><li>M9 buffer door ontbinding KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42.2 mM), bereiden en NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water. Voeg 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g in een eindvolume van 100 mL gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water) na autoclaaf. Mix 100 mL van de resulterende 10 x M9 met gesteriliseerde met autoclaaf 900 mL gedeïoniseerd water zodat een oplossing 1 x.</li...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een gedrags assay, SWIP, in C. elegans. Dit protocol is eenvoudig en ongecompliceerd met geen grote technische hindernissen maken van deze test zeer gebruiker vriendelijk. Er zijn echter enkele kritieke aspecten die worden genomen moeten om het effectief uitvoeren van de bepaling.
Zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de wormen gebruikt voor de assay goed gevoed, aangezien dieet beperking SWIP<sup class="x...

Dieren te vervullen, een verscheidenheid van aangeboren en complexe problemen die worden bemiddeld door verschillende neurotransmitters gecoördineerd door ingewikkelde signalering processen. De neurotransmitter dopamine (DA) bemiddelt zeer geconserveerde gedrag over soorten, waaronder learning, motor functie en verwerking van beloning.
De bodem nematode C. elegans, met een relatief eenvoudige en goed toegewezen zenuwstelsel bestaande uit alleen 302 neuronen, toont duidelijk complexe gedrag, waaronder vele die zijn geregeld bij DA zoals paring, leren, foerageren, motoriek en leggen van eieren 1. Markeer onder andere functies, korte levenscyclus, gebruiksgemak en de instandhouding van de signalering van moleculen, de voordelen van het gebruik van C. elegans als een model voor het bestuderen van de neurale basis van geconserveerde gedrag.
De hermafrodiet C. elegans bevat acht Dopaminerge neuronen; Naast deze bevat de man zes extra paren voor paring doeleinden. Zoals bij zoogdieren, deze neuronen DA synthetiseren en express de DA transporter (DAT-1), een membraan eiwit gevonden uitsluitend in Dopaminerge neuronen, waarvan transports DA vrijkomen in de synaptische gespleten terug de Dopaminerge neuronen. Bovendien, de meeste van de eiwitten die betrokken zijn bij elke stap van synthese, de verpakking en de release van DA zijn zeer bewaard tussen wormen en mens en zoals bij zoogdieren, DA moduleert voeding gedrag en motoriek in C. elegans2.
C. elegans doorzoekt op vaste oppervlakken en zwemt met een karakteristieke pak slaag gedrag in water. Interessant, mutanten expressie voor DAT-1 (dat-1) ontbreekt normaal kruipen op harde ondergrond maar niet zwemmen wanneer ondergedompeld in water te houden. Dit probleem was zwemmen geïnduceerde verlamming of SWIP genoemd. Eerdere experimenten aangetoond dat SWIP, gedeeltelijk wordt veroorzaakt door een overmaat aan DA in de synaptische spleet die uiteindelijk overstimulates de D2-achtige postsynaptisch receptoren (DOP-3). Hoewel oorspronkelijk geïdentificeerd in dat-1 knockout dieren3, SWIP is ook waargenomen in het wild-type dieren behandeld met medicijnen die de activiteit blok DAT (bijvoorbeeld imipramine4) en/of induceren DA release (bijvoorbeeld amfetamine5). Aan de andere kant, voorkomen farmacologische of genetische manipulaties afwenden van synthese en release van DA en het blokkeren van DOP-3 receptor functie SWIP6. Samen hebben deze reeds gepubliceerde gegevens SWIP opgericht als een betrouwbaar hulpmiddel te bestuderen van de gedragsmatige gevolgen veroorzaakt door gemuteerde eiwitten binnen Dopaminerge synapsen3,4,7 en kunnen worden ingezet voor voorwaartse genetische schermen voor de identificatie van nieuwe regelgevende trajecten die betrokken zijn bij DA signalering7,8,9,10,11,12. Bovendien, door het verstrekken van een gemakkelijk meetbare uitlezing van drug-geïnduceerde gedrag in levende dieren, SWIP maakt het ontrafelen van de mechanismen van de actie van drugs zoals amfetamine (AMPH) en azaperone op de Dopaminerge synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocollen voor het uitvoeren van de tests SWIP zijn vóór16beschreven. Hier beschrijven we in detail de methodologie en de setup voor het uitvoeren van de test met het doel van het verstrekken van een visuele gids voor de C. elegans -Gemeenschap voor het effectief uitvoeren van SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

De bepaling van de zwemmen beschreven in dit protocol is een geldig instrument om te identificeren eiwitten reguleren van de Dopaminerge synapses. Net als bij zoogdieren, dopamine (DA) bepaalt verscheidene functies in C. elegans met inbegrip van leren en motorische activiteit. Voorwaarden die stimuleren DA vrijkomen (bijvoorbeeld amfetamine (AMPH) behandelingen) of die voorkomen DA klaring (bijvoorbeeld dieren ontbreekt de DA vervoerder (dat-1) die zijn niet in staat van DA reaccumulating in de neuronen) genereren van een overmaat van extracellulaire DA wat uiteindelijk resulteert in geremde motoriek. Dit probleem is vooral duidelijk wanneer dieren in water zwemmen. In feite, terwijl de wild-type dieren blijven om te zwemmen voor een langere periode, dat-1 null mutanten en wild-type behandeld met AMPH of remmers van de DA vervoerder zinken naar de bodem van de put en niet verplaatst. Dit gedrag heet "Zwemmen geïnduceerde verlamming" (SWIP). Hoewel de bepaling SWIP goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de methode. Hier beschrijven we een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van SWIP. Voor het uitvoeren van de bepaling, worden laat larvale stadium-4 dieren geplaatst in een plek glasplaat met sacharose bedieningsoplossing met of zonder AMPH. Dieren worden gescoord voor hun zwemmen gedrag of handmatig door visualisatie onder een stereoscoop automatisch door opname met een camera gemonteerd op de stereoscoop. Video's worden vervolgens geanalyseerd met behulp van een tracking-software, die een visuele weergave van pak slaag frequentie en verlamming in de vorm van warmte kaarten levert. Zowel de handmatige en geautomatiseerde systemen garanderen een gemakkelijk meetbare uitlezing van de dieren zwemmen vermogen en aldus vergemakkelijken screening voor vaneenkeurmerkzĳnvoorzien mutaties binnen het Dopaminerge systeem of voor ondersteunende genen. Daarnaast kan de SWIP ophelderen van het werkingsmechanisme van drugs misbruik zoals AMPH worden gebruikt.

Presenteren we een voorbeeld van SWIP assay geïnduceerd door AMPH behandeling. Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de test setup zoals hierboven beschreven. Voor de handmatige assay, ongeveer 8-10 leeftijd gesynchroniseerde laat L4 fase wormen verzameld met een wimper of platina worden halen en geplaatst in een plek glasplaat gevuld met 40 µL van 200 mOsm/L sacharose (bedieningsoplossing) of sacharose met 0,5 mM AMPH en getest voor SWIP.
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Zwemmen geïnduceerde verlamming te beoordelen Dopamine signalering in Caenorhabditis elegans

Zwemmen geïnduceerde verlamming (SWIP) is een gevestigde gedrags test gebruikt bij het bestuderen van de onderliggende mechanismen van dopamine signalering in Caenorhabditis elegans (C. elegans). Een gedetailleerde methode voor het uitvoeren van de bepaling ontbreekt echter. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol voor SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen Zwemmen-Geïnduceerde Verlamming of SWIP, een gedragstest om dopamine signalering in C.elegans te beoordelen. SWIP maakt het mogelijk om genen binnen of gerelateerd aan de dopaminerge synapsis snel te identificeren. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek van de effecten geproduceerd door een overmaat aan extracellulaire dopamine die wordt veroorzaakt door bijvoorbeeld drugs of door mutaties bij de dopamine transporter.Om ervoor te zorgen dat alle wormen die tijdens het testen gedurende dezelfde hoeveelheid tijd zijn getest, moeten de dieren snel in de oplossing worden overgebracht. Het demonstreren van de procedure zal Sirisha Kudumala en Serene Sossi. Ze werken allebei in mijn laboratorium.Voor het opzetten van worm starter culturen, gebruik maken van een steriele spatel om kleine stukjes agar snijden van een plaat met goed gevoede C.elegans en breng de agar stukken in individuele NA22 E.coli platen. Na het uitbroeden van de platen op 20 graden Celsius gedurende drie tot vier dagen, visueel bevestigen de aanwezigheid van gravid volwassenen onder een stereo microscoop. Om een gesynchroniseerde populatie wormen te verkrijgen, spuit water op een plaat vol aangetrokken volwassenen.Draai voorzichtig de plaat om de wormen los te maken en gebruik een afvoerpipet om de wormen over te brengen in een 15 milliliter polystyreen conische buis. Na het trekken van de wormen van een tweede plaat in de buis, verzamel de wormen door centrifugatie voor drie wasbeurten in 15 milliliter autoclaved water per wasbeurt. Het water moet na de laatste wasbeurt helder lijken.Voeg na de laatste centrifugatie vijf milliliter van een vers bereide natriumdioxidestofhydroxideoplossing toe aan de wormen en meng snel met een vortex. Broed de buis op een tuimelschakelaar, plaats een druppel wormoplossing op een glazen microscoopplaat en controleer vier tot acht minuten elke twee minuten op wormlyse onder een stereoscoop. Wanneer ongeveer 70% van de wormen zijn lysed en de eieren waren vrijgegeven, onmiddellijk stoppen met de lysis met de toevoeging van ei buffer.Centrifugeer vervolgens de embryo's en wormkarkassen vier keer met het verhogen van de pellet met verse eierbuffer tussen wasbeurten om eventuele resterende bleekwater te verwijderen. Na de laatste wasbeurt moet de pellet wit lijken. Resuspend de pellet in vijf milliliter autoclaved water en vijf milliliter van 60%sucrose om de embryo's te scheiden van de karkassen door centrifugatie.Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge na de dichtheidgradiënt scheiding en gebruik een glas Pasteur pipet om drie tot vier milliliter van de embryo's drijvend op de bovenste meniscus in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Was de embryo's drie keer met autoclaved water om de sacharose te verwijderen, gevolgd door drie wasbeurten in M9 buffer. Na de laatste wasbeurt, incubeer de embryo's op een shaker 's nachts in 10 milliliter verse M9 buffer om de eieren uit te komen en blijven in de L1 larval stadium.Na niet meer dan 14 uur op de shaker, was de L1 larven drie keer met het autoclaved water om eventuele feromonen vrij te verwijderen die door de larven vrijkomen en de larvepel opnieuw in één milliliter water te verwijderen. Verdun een aliquot van wormen tot een een tot 10 verhouding en voeg 1:10 microliter druppel op een glazen glijbaan en tel de wormen onder de stereo microscoop. Herhaal dit om een gemiddeld aantal wormen te verkrijgen.Gebruik een pipet om voldoende druppels van de worm oplossing toe te voegen op een kamertemperatuur NA22 plaat te zaaien ongeveer een keer 10 tot de derde wormen voor de cultuur en laat de plaat half open totdat de druppels uitdrogen. Dan incubeer de plaat bedekt en ondersteboven op 20 graden Celsius voor ongeveer 44 tot 48 uur of totdat de wormen bereiken late L4 stadium zoals visueel bevestigd onder een stereo microscoop. Voor handmatige beoordeling van SWIP, voeg 40 microliter van de controle oplossing met of zonder 0,5 millimolar amfetamine in een glas spot plaat.Kies onder een stereoscoop acht tot tien late L4-fasewormen met een wimperp en dompel de pick onder in de put met de oplossing totdat de wormen van de pick afgaan en in de oplossing zwemmen. Start de timer. Let op het aantal wormen dat in de put wordt losgelaten en observeer en neem het aantal wormen dat SWIP vertoont op elke minuutmarkering gedurende een totaal van 10 minuten.Kopieer aan het einde van de procedure de ruwe gegevens in een spreadsheet en bereken het percentage wormen dat verlamd is door het aantal wormen dat op elke minuut verlamd is te delen door het totale aantal wormen dat tijdens de test is getest en vermenigvuldigt met 100. Kopieer de procentuele waarden in grafieken en statistische software en plot de gegevens met procentuele waarden van SWIP op de y-as en tijd op de x-as met behulp van de XY-grafiekindeling. Statistische analyse tussen de controle- en amfetaminebehandelde groepen en het tijdstip van de behandeling kan worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door gebruik te maken van tweerichtings-ANOVA- en post-hocanalyse.Voor geautomatiseerde analyse van zwemmen-geïnduceerde verlamming, het opzetten van de camera, worm tracker software, en script om de tracking software analyse uit te voeren en gebruik maken van een wimper pick om een enkel laat stadium L4 worm plaats in een glazen spot plaat zoals eerder getoond. Neem vervolgens zwemvideo's van één worm tegelijk op en gebruik de wormtrackersoftware om de frequentie van lichaamsbochten te berekenen, volgens het script dat is voorzien van de trackingsoftware om de frequentie van de worm te verkrijgen en om warmtekaarten te genereren van de wormslaaggegevens. De meeste wormen getest in de controle-oplossing zwemmen continu gedurende ten minste 10 minuten.Wormen blootgesteld aan controle of amfetamine tonen geen SWIP in de eerste minuut van observatie. Echter, terwijl wormen behandeld met de controle-oplossing blijven zwemmen voor 10 minuten, wormen behandeld met amfetamine beginnen te swip vertonen na twee minuten van de behandeling. En na 10 minuten, 66% van de dieren tonen SWIP.Hier worden voorbeelden van warmtekaarten van dieren die aan de controle of aan amfetamine zijn blootgesteld, weergegeven met een verwachte aanzienlijke toename van de verlamming bij de met amfetamine behandelde dieren. Alvorens deze test te proberen, moet men goed bekend zijn met het plukken en ontwikkelings-enscenering van C.elegans. De betrokkenheid van het dopaminerge systeem bij SWIP-gedrag moet worden bevestigd met dieren die de expressie van dopaminerge eiwitten missen of door de uitputting van dopamine-vesicles met Reserpine.SWIP kan instrumenteel zijn bij het identificeren van nieuwe eiwitten die betrokken zijn bij het werkingsmechanisme van geneesmiddelen die werken bij de dopaminerge synapsis.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Dynamische Beelden van Kortlevend Dopamine Fluctuaties met lp-ntPET: Dopamine Films van het roken van sigaretten

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Het blootleggen van Beat Doofheid: Het opsporen ritmestoornissen met gesynchroniseerde Finger tikken en Perceptuele Timing Taken

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Een procedure om-Context geïnduceerde Vernieuwing Observeer van Pavlov-geconditioneerde Alcohol-zoekend gedrag bij ratten

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Onderzoek van Rapid Dopamine Dynamics met Fast scan cyclische voltammetrie Tijdens intra-orale Tastant Administration in Awake Rats

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking Control cognitieve functies bij patiënten beoordelen met Amyotrofische Lateraal Sclerose

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Omkeerbare koeling-geïnduceerde deactiveringen te bestuderen van de corticale bijdragen aan belemmering geheugen in de wandelende kat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Biomechanische analysemethoden om de Lunge prestaties van professionele badminton spelers te beoordelen

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Met behulp van gezicht elektromyografie te beoordelen gezicht spier reacties op ervaren en waargenomen affectieve Touch bij de mens

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Een gestandaardiseerd protocol voor preferentietesten om het welzijn van vissen te beoordelen

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Beoordeling van de geheugenfunctie bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...