Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Les auteurs tiens à remercier le Dr. Osama Refai du laboratoire du Dr Randy Blakely d’orientation avec l’analyse automatique de SWIP. Ce travail a été financé par NIH R01 DA042156 à LC.

1. préparation des Solutions et des médias
<ol><li>Préparer M9 tampon en dissolvant KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) et NaCl 5,0 g (85,5 mM) dans 1 L d’eau déionisée autoclavé. Ajouter 1,0 mL de 1 M MgSO4 (12 g dans un volume final de 100 mL d’eau désionisée autoclavé) après la stérilisation. Mélanger 100 mL de 10 x qui en résulte M9 avec 900 mL d’autoclave désionisée pour faire une solution de 1 x.</li>
	<li>Pour faire le tampo...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour effectuer un test comportemental, SWIP, chez c. elegans. Ce protocole est simple et directe avec aucun obstacles techniques majeurs effectuez ce test très amical. Néanmoins, il y a certains aspects essentiels qui doivent être examinées afin de s’acquitter efficacement le dosage.
Il faut s’assurer que les vers utilisés pour l’essai sont bien nourris, puisque la restriction alimentaire affecte SWIP17</s...

Animaux exécutent une variété de comportements innés et complexes qui sont véhiculées par les différents neurotransmetteurs, coordonnés par les processus complexes de signalisation. La dopamine, un neurotransmetteur (DA) intervient dans des comportements hautement conservées à travers les espèces, y compris l’apprentissage, la fonction motrice et le traitement de la récompense.
Les nématodes du sol c. elegans, avec un système nerveux relativement simple et bien cartographiée consistant seulement 302 neurones, montre des comportements fortement complexes, dont beaucoup sont réglementées par DA comme accouplement, apprentissage, recherche de nourriture, la locomotion et la ponte 1. parmi les autres caractéristiques, cycle de vie court, facilité de manipulation et la conservation des molécules de signalisation, mettre en évidence les avantages de l’utilisation de c. elegans comme modèle pour étudier les bases neurales des comportements conservées.
L’hermaphrodite c. elegans contient huit des neurones dopaminergiques ; En outre, le mâle contient six paires supplémentaires pour fins d’accouplement. Comme les mammifères, ces neurones synthétisent DA et expriment le transporteur DA (DAT-1), une protéine de membrane trouve exclusivement dans les neurones dopaminergiques, qui transporte DA relâché dans la fente synaptique dans les neurones dopaminergiques. En outre, la plupart des protéines impliqués dans chaque étape de la synthèse, de conditionnement et de libération de DA est hautement conservée entre worms et les êtres humains et, comme chez les mammifères, DA module alimentation de comportements et de locomotion chez c. elegans2.
C. elegans se traîne sur des surfaces solides et nage avec un comportement caractéristique de s’emballer dans de l’eau. Fait intéressant, des mutants dépourvus d’expression du 1 DAT (dat-1) rampent normalement sur une surface solide, mais ne parviennent pas à maintenir la natation lorsqu’immergé dans l’eau. Ce comportement a été appelé natation induite une paralysie, ou SWIP. Des expériences précédentes ont démontré que SWIP, est en partie causée par un excès de DA dans la fente synaptique qui finalement surexcite les récepteurs postsynaptiques de D2-like (DOP-3). Bien qu’identifié à l’origine de dat-1 knockout animaux3, SWIP est également observée chez les animaux sauvage, traités avec des médicaments qui bloquent l’activité de DAT (p. ex., l’imipramine4) et/ou inciter la libération de DA (p. ex., stimulants5). En revanche, les manipulations pharmacologiques ou génétiques conjurer la synthèse et la libération de DA et bloquant la fonction des récepteurs DOP-3 empêchent SWIP6. Pris ensemble, ces données déjà publiées ont établi SWIP comme un outil fiable pour étudier les effets comportements de protéines mutées dans dopaminergique synapses3,4,7 et devant être utilisés pour avancer les écrans génétiques pour l’identification de nouvelles voies réglementaires impliquées dans DA signalisation7,8,9,10,11,12. En outre, en fournissant un affichage facilement quantifiable du comportement drogue-induite chez les individus vivants, SWIP permet à l’élucidation des mécanismes d’action des drogues comme l’amphétamine (AMPH) et azapérone à la dopaminergique synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocoles pour effectuer les dosages SWIP ont été décrits avant16. Ici, nous décrivons en détail la méthodologie et le programme d’installation pour effectuer le test avec le but de fournir un guide visuel pour la communauté de c. elegans remplir efficacement SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Le test de natation décrit dans le présent protocole est un outil valable pour identifier les protéines réglementant le dopaminergique synapses. Tout comme les mammifères, la dopamine (DA) contrôle plusieurs fonctions chez c. elegans , y compris l’activité d’apprentissage et de moteur. Conditions qui stimulent la libération de DA (p. ex., les traitements stimulants (AMPH)) ou qui empêcherait DA clearance (p. ex., les animaux dépourvus du transporteur DA (dat-1) qui sont incapables de pourraient DA dans les neurones) générer un excès de DA extracellulaire au bout du compte résultant dans la locomotion inhibée. Ce comportement est particulièrement évident lorsque les animaux nagent dans l’eau. En effet, tandis que les animaux sauvage continue à nager pendant une période prolongée, dat-1 mutants nuls et sauvage traitement avec AMPH ou inhibiteurs du transporteur DA coulent au fond du puits et ne bougent pas. Ce comportement est appelé « Paralysie due Swimming » (SWIP). Bien que l’essai SWIP est bien établie, une description détaillée de la méthode fait défaut. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour effectuer SWIP. Pour effectuer le test, fin larvaire étape-4 animaux est placés dans une spot sur plaque de verre contenant une solution de saccharose contrôle avec ou sans AMPH. Animaux est notés pour leur comportement de nage soit manuellement par la visualisation sous un stéréoscope, soit automatiquement par l’enregistrement d’une caméra montée sur le stéréoscope. Vidéos sont ensuite analysées à l’aide d’un logiciel de suivi, ce qui donne une représentation visuelle de la fréquence de volée et paralysie sous forme de cartes de la chaleur. Les systèmes manuels et automatisés garantissent un affichage facilement quantifiable de la capacité de nage des animaux et ainsi facilitent le dépistage des animaux portant des mutations au sein du système dopaminergique ou gènes auxiliaire. En outre, SWIP peut servir à élucider le mécanisme d’action des drogues d’abus comme AMPH.

Nous présentons un exemple de test SWIP induite par le traitement AMPH. La figure 1 montre une représentation schématique de l’installation d’essai tel que décrit ci-dessus. Le dosage manuel, environ 8-10 ans synchronisée fin vers stade de L4 est recueillies avec un cil ou platine et placé dans une plaque de verre spot rempli de 40 µL de 200 de saccharose mOsm/L (solution de contrôle) ou de saccharose avec 0,5 mM AMPH et testé pour SWIP.
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Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Paralysie de natation due à évaluer la Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Natation induite paralysie (SWIP) est un test comportemental bien établi utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents de la dopamine signalisation chez Caenorhabditis elegans (c. elegans). Toutefois, une méthode détaillée pour effectuer le test fait défaut. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer la paralysie induite par la natation ou SWIP, un essai comportemental pour évaluer la signalisation de dopamine dans C.elegans. Swip permet l’identification rapide des gènes à l’intérieur ou liés à la synapse dopaminergique. Cette méthode permet d’examiner les effets produits par un excès de dopamine extracellulaire qui est causé par exemple par des médicaments ou par des mutations chez le transporteur de dopamine.Pour s’assurer que tous les vers testés pendant l’essai nagent pendant le même laps de temps, les animaux doivent être transférés rapidement dans la solution. Sirisha Kudumala et Serene Sossi feront la démonstration de la procédure. Ils travaillent tous les deux dans mon laboratoire.Pour mettre en place des cultures de démarrage de vers, utilisez une spatule stérile pour couper de petits morceaux d’agar d’une plaque contenant des C.elegans bien nourris et transférer les morceaux d’agar dans des plaques individuelles de NA22 E.coli. Après avoir couvé les plaques à 20 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, confirmez visuellement la présence d’adultes gravid sous un microscope stéréo. Pour obtenir une population synchronisée de vers, gicler de l’eau sur une plaque pleine d’adultes gravid.Faites pivoter doucement la plaque pour déloger les vers et utilisez une pipette d’élimination pour transférer les vers dans un tube conique en polystyrène de 15 millilitres. Après avoir tiré les vers d’une deuxième plaque dans le tube, recueillir les vers par centrifugation pour trois lavages en 15 millilitres d’eau autoclavée par lavage. L’eau doit apparaître claire après le dernier lavage.Après la dernière centrifugation, ajouter cinq millilitres d’une solution d’hydroxyde de sodium hypochlorure de sodium fraîchement préparée aux vers et mélanger rapidement avec un vortex. Incuber le tube sur un rocker, placer une goutte de solution de ver sur une lame de microscope en verre et vérifier la lyse de ver sous un stéréoscope toutes les deux minutes pendant quatre à huit minutes. Lorsqu’environ 70 % des vers ont été lysés et que les œufs ont été relâchés, arrêtez immédiatement la lyse avec l’ajout d’un tampon pour les œufs.Ensuite, centrifugez les embryons et les carcasses de vers quatre fois en résusant la pastille avec tampon d’oeufs frais entre les lavages pour enlever tout l’eau de Javel restante. Après le dernier lavage, la pastille doit apparaître blanche. Resuspendez la pastille en cinq millilitres d’eau autoclavée et cinq millilitres de saccharose à 60 % pour séparer les embryons des carcasses par centrifugation.Retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse après la séparation du gradient de densité et utilisez une pipette pasteur en verre pour transférer de trois à quatre millilitres des embryons flottant au ménisque supérieur dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Lavez les embryons trois fois avec de l’eau autoclavée pour enlever le saccharose suivi de trois lavages dans le tampon M9. Après le dernier lavage, incuber les embryons sur un shaker pendant la nuit dans 10 millilitres de tampon M9 frais pour permettre aux œufs d’éclore et de rester au stade larvaire L1.Après pas plus de 14 heures sur le shaker, lavez les larves de L1 trois fois avec l’eau autoclavée pour enlever les phéromones libérées par les larves et résuspendez la pastille larvaire dans un millilitre d’eau. Diluer un aliquot de vers à un rapport d’un à 10 et ajouter 1:10 goutte de microlitre sur une lame de verre et compter les vers sous le microscope stéréo. Répéter pour obtenir un nombre moyen de vers.Utilisez une pipette pour ajouter suffisamment de gouttelettes de la solution de ver sur une plaque NA22 à température ambiante pour ensemencer environ une fois 10 vers au tiers vers pour la culture et laisser la plaque à moitié ouverte jusqu’à ce que les gouttes se dessèchent. Puis incuber la plaque couverte et à l’envers à 20 degrés Celsius pendant environ 44 à 48 heures ou jusqu’à ce que les vers atteignent le stade L4 tardif tel que confirmé visuellement sous un microscope stéréo. Pour l’évaluation manuelle du SWIP, ajouter 40 microlitres de solution de contrôle avec ou sans amphétamine de 0,5 millimlaire dans une plaque de verre.Sous un stéréoscope, choisissez huit à dix vers de stade L4 tardifs avec un pic de cils et submergez la pioche dans le puits contenant la solution jusqu’à ce que les vers se déplacent hors de la pioche et nager dans la solution. Démarrez la timer. Notez le nombre de vers relâchés dans le puits et observez et enregistrez le nombre de vers présentant le SWIP à chaque marque de minute pendant un total de 10 minutes.À la fin de la procédure, copiez les données brutes dans une feuille de calcul et calculez le pourcentage de vers paralysés en divisant le nombre de vers paralysés à chaque minute par le nombre total de vers testés tout au long de l’analyse et en multipliant par 100. Copiez les valeurs en pourcentage dans n’importe quel logiciel graphique et statistique et tracez les données avec des valeurs en pourcentage de SWIP sur l’axe y et le temps sur l’axe x en utilisant le format graphique XY. L’analyse statistique entre les groupes traités par le contrôle et les amphétamines et l’heure du traitement peut être effectuée, par exemple en utilisant l’ANOVA dans les deux sens et l’analyse post-hoc.Pour une analyse automatisée de la paralysie induite par la natation, configurez la caméra, le logiciel de suivi des vers et le script pour exécuter l’analyse logicielle de suivi et utiliser un pic de cils pour placer un seul ver L4 à un stade avancé dans une plaque de tache en verre comme indiqué précédemment. Enregistrez ensuite des vidéos de natation d’un ver à la fois et utilisez le logiciel de suivi des vers pour calculer la fréquence des courbures du corps, en suivant le script fourni avec le logiciel de suivi pour obtenir la fréquence de battement de ver, et pour générer des cartes thermiques à partir des données de thrashing ver. La plupart des vers testés dans la solution de contrôle nagent en continu pendant au moins 10 minutes.Les vers exposés au contrôle ou aux amphétamines ne présentent pas de SWIP dans la première minute d’observation. Cependant, alors que les vers traités avec la solution de contrôle continuent de nager pendant 10 minutes, les vers traités avec de l’amphétamine commencent à présenter swip après deux minutes de traitement. Et après 10 minutes, 66% des animaux montrent SWIP.Ici, des exemples de cartes thermiques d’animaux exposés à la lutte ou aux amphétamines sont montrés avec une augmentation considérable prévue de la paralysie observée chez les animaux traités aux amphétamines. Avant d’essayer cet essai, il faut bien connaître la cueillette et la mise en scène développementale de C.elegans. L’implication du système dopaminergique dans le comportement de SWIP devrait être confirmée utilisant des animaux manquant de l’expression des protéines dopaminergiques ou par l’épuisement des vésicules de dopamine avec reserpine.Swip peut être instrumental dans l’identification de nouvelles protéines impliquées dans le mécanisme d’action des médicaments agissant à la synapse dopaminergique.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Création d&#39;images dynamiques des fluctuations de la dopamine à court terme avec lp-ntPET: Films dopamine de la cigarette

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Recherche

Sciences du comportement

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Découvrir beat Surdité: détection des troubles du rythme avec le doigt taraudage synchronisé et tâches de temporisation perceptuelles

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Une procédure pour l&#39;observation de renouvellement induite contexte-de pavlovien conditionné alcool comportement de recherche chez le rat

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Examen de Rapid Dopamine Dynamics avec Numérisation rapide voltampérométrie cyclique cours intra-orale administration exhausteur de goût chez les rats Awake

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking Control pour évaluer les fonctions cognitives chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique

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Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Réversible par refroidissement désactivations pour étudier les Contributions corticales à Obstacle mémoire chez le chat marche

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

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Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

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Avec électromyographie faciale pour évaluer les réactions des muscles faciaux toucher affectif expérimentés et observés chez l’homme

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A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Un protocole normalisé pour les tests de préférence pour évaluer le bien-être des poissons

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Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...