Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Osama Refai von Dr. Randy Blakely Lab zur Orientierung mit der automatisierten Analyse der SWIP danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von NIH R01 DA042156, LC.

1. Vorbereitung von Lösungen und Medien
<ol><li>M9 Puffer durch Auflösen von KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) vorbereiten und NaCl 5,0 g (85,5 mM) in 1 L autoklaviert deionisiertes Wasser. Nach dem Autoklavieren 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g in einem Endvolumen von 100 mL autoklaviert deionisiertes Wasser) hinzugeben. Mix 100 mL der resultierenden 10 X M9 mit 900 mL autoklaviert deionisiertes Wasser, um eine 1 X Lösung machen.</li>
	<li>Um Ei Puffer zu ...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll um einen Verhaltens-Assay, SWIP, in C. Elegansdurchzuführen. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert ohne großen technischen Hürden, die Herstellung dieser Assay sehr benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige kritische Aspekte, die berücksichtigt werden, um effektiv den Test durchführen müssen.
Darauf sollte geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Würmer für den Assay verwendet gut genährt, da diätetische Eins...

Tiere führen eine Vielzahl von angeborenen und komplexe Verhaltensweisen, die durch verschiedene Neurotransmitter, die von komplizierten Signalisierung Prozesse koordiniert vermittelt werden. Der Neurotransmitter Dopamin (DA) vermittelt hoch konservierte Verhaltensweisen über Arten, darunter lernen, Motorik und Belohnung Verarbeitung.
Boden-Nematoden C. Elegans, zeigt mit einem relativ einfach und gut gemappten Nervensystem nur 302 Neuronen bestehend deutlich komplexe Verhaltensweisen, darunter viele, die DA wie Paarung, lernen, Nahrungssuche, Fortbewegung und Eiablage geregelt sind 1. unter anderen Funktionen, kurze Lebensdauer, einfache Handhabung und die Erhaltung der Signalmoleküle, markieren Sie die Vorteile der Verwendung von C. Elegans als Modell für die Erforschung der neuronalen Grundlagen von konservierten Verhaltensweisen.
Die Zwitter C. Elegans enthält acht dopaminergen Neuronen; Darüber hinaus enthält das Männchen sechs zusätzliche Paare zur Paarung Zwecke. Wie bei Säugetieren diese Neuronen DA zu synthetisieren und express DA Transporter (DAT-1), ein Membranprotein fand ausschließlich in dopaminergen Neuronen, die transportiert, DA in den synaptischen Spalt zurück in den dopaminergen Neuronen freigesetzt. Darüber hinaus die meisten Proteine, die in jedem Schritt der Synthese, Verpackung und Freisetzung von DA sind hoch konserviert zwischen Würmern und Menschen, und wie bei Säugetieren, DA moduliert Fütterung Verhaltensweisen und Fortbewegung in C. Elegans2.
C. Elegans kriecht auf festen Oberflächen und mit einem charakteristischen Prügel Verhalten im Wasser schwimmt. Interessanterweise Mutanten fehlt Ausdruck des DAT-1 (Dat-1) kriechen normalerweise auf festen Untergrund aber nicht schwimmen als in Wasser untergetaucht aufrecht zu erhalten. Dieses Verhalten wurde schwimmen induzierten Lähmungen oder SWIP bezeichnet. Bisherige Experimenten gezeigt, dass SWIP, teilweise durch ein Übermaß an DA in den synaptischen Spalt verursacht wird, die letztlich die postsynaptischen D2-Like-Rezeptoren (DOP-3) overstimulates. Obwohl ursprünglich in Dat-1 Ko Tiere3identifiziert, SWIP wird auch beobachtet, in Wildtyp Tiere mit Medikamenten dieser Block die Aktivität der DAT (z. B. Imipramin4) behandelt und/oder DA Version (z. B. Amphetamin5) induzieren. Auf der anderen Seite zu verhindern, dass pharmakologische oder genetische Manipulationen Abwendung Synthese und Freisetzung von DA und DOP-3-Rezeptor-Funktion sperren SWIP6. Zusammengenommen haben diese bereits veröffentlichten Daten SWIP als ein zuverlässiges Werkzeug, die Auswirkungen auf das Verhalten verursacht durch mutierte Proteine innerhalb von dopaminergen Synapsen3,4,7 zu studieren und für anzuwendende etabliert leiten Sie genetische Bildschirme für die Identifizierung der neuartige rechtliche Wege DA Signalisierung7,8,9,10,11,12beteiligt. Zusätzlich, indem eine leicht quantifizierbare Auslesen des Medikamenten-induzierten Verhalten bei lebenden Tieren SWIP ermöglicht die Aufklärung der Mechanismen der Wirkung von Drogen wie Amphetamin (AMPH) und Azaperone bei der dopaminergen Synapsen5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokolle für die Durchführung der SWIP-Assays wurden vor16beschrieben. Hier beschreiben wir ausführlich die Methodik und das Setup Ausführen des Tests mit dem Ziel, eine visuelle Anleitung für die Gemeinschaft von C. Elegans SWIP effektiv durchführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Der Swimming-Assay in diesem Protokoll beschrieben ist, dass Synapsen ein gültige Instrument zur Regulierung der dopaminergen Proteine zu identifizieren. Ähnlich wie bei Säugetieren, Dopamin (DA) steuert mehrere Funktionen in C. Elegans einschließlich Lern- und motorische Aktivität. Bedingungen, die DA Version (z. B. Amphetamin (AMPH) Behandlungen) zu stimulieren oder zu verhindern, dass DA Abstand (z. B. Tieren fehlt DA Transporter (Dat-1) die sind unfähig, reaccumulating DA in den Neuronen) erzeugen einen Überschuss an extrazellulären DA schließlich mit dem Ergebnis gehemmte Fortbewegung. Dieses Verhalten ist besonders deutlich, wenn Tiere im Wasser schwimmen. In der Tat, während Wildtyp Tiere über einen längeren Zeitraum zu schwimmen weiterhin, Dat-1 null Mutanten und Wildtyp behandelt mit AMPH oder Inhibitoren der DA-Transporter auf den Boden des Brunnens sinken und bewegen sich nicht. Dieses Verhalten wird als "Schwimmen induzierte Paralyse" (SWIP) bezeichnet. Obwohl der SWIP-Test gut etabliert ist, fehlt eine detaillierte Beschreibung der Methode. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt um SWIP durchzuführen. Um den Test durchzuführen, sind späten larvalen Phase 4 Tiere in einer Glasplatte vor Ort mit Saccharose Kontrolllösung mit oder ohne AMPH platziert. Tiere sind für ihr Verhalten schwimmen erzielte durch Visualisierung unter ein Stereoskop manuell oder automatisch durch die Aufnahme mit einer Kamera auf das Stereoskop montiert. Videos werden dann analysiert verwenden eine Tracking-Software, die eine visuelle Darstellung der Prügel Frequenz und Lähmungen in Form von Heatmaps ergibt. Die manuelle und automatisierte Systeme garantieren eine leicht quantifizierbare Auslesen der Schwimmfähigkeit der Tiere und ermöglichen so Screening für Tiere tragen Mutationen innerhalb des dopaminergen Systems oder für zusätzliche Gene. SWIP ist darüber hinaus lässt sich den Mechanismus der Wirkung von Drogen wie AMPH aufzuklären.

Wir präsentieren Ihnen ein Beispiel der SWIP Assay durch AMPH Behandlung induziert. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Assay-Installation wie oben beschrieben. Für die manuelle Assay, ca. 8-10 Alter synchronisierte Ende L4 Stadium Würmer gesammelt mit einer Wimper oder Platin sind wählen und eine Glasplatte vor Ort gefüllt mit 40 µL 200 mOsm/L Saccharose (Control-Lösung) oder Saccharose mit 0,5 mM Ladeeffekt und getestet für SWIP gele...

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Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans

Schwimmen-induziert Lähmung (SWIP) ist ein etablierter Verhaltens-Assay verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) zu studieren. Allerdings fehlt eine detaillierte Methode, um den Test durchzuführen. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt Protokoll für SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Schwimmen-induzierte Lähmung oder SWIP zu demonstrieren, ein Verhaltenstest zur Beurteilung der Dopamin-Signalisierung bei C.elegans. SWIP ermöglicht die schnelle Identifizierung von Genen innerhalb oder im Zusammenhang mit der dopaminergen Synapsis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Wirkungen, die durch einen Überschuss an extrazellulärem Dopamin erzeugt werden, das zum Beispiel durch Medikamente oder durch Mutationen am Dopamin-Transporter verursacht wird.Um sicherzustellen, dass alle Würmer, die während des Assschwimmens getestet wurden, für die gleiche Zeit schwimmen, müssen die Tiere schnell in die Lösung übertragen werden. Demonstriert werden Sirisha Kudumala und Serene Sossi. Beide arbeiten in meinem Labor.Um Schneckenstarterkulturen einzurichten, verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um kleine Agarstücke von einer Platte mit gut gefütterten C.elegans zu schneiden und die Agarstücke in einzelne NA22 E.coli-Platten zu übertragen. Nach der Inkubation der Platten bei 20 Grad Celsius für drei bis vier Tage, visuell bestätigen das Vorhandensein von gravid Erwachsenen unter einem Stereomikroskop. Um eine synchronisierte Population von Würmern zu erhalten, spritzen Sie Wasser auf eine Platte voller gravid Erwachsener.Wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um die Würmer zu lösen und verwenden Sie eine Entsorgungspipette, um die Würmer in ein 15 Milliliter Polystyrol-Konrohr zu übertragen. Nachdem Sie die Würmer von einer zweiten Platte in das Rohr gezogen haben, sammeln Sie die Würmer durch Zentrifugation für drei Wäschen in 15 Milliliter autoklaviertem Wasser pro Wäsche. Das Wasser sollte nach der letzten Wäsche klar erscheinen.Nach der letzten Zentrifugation fünf Milliliter einer frisch zubereiteten Natriumhypochlorid-Natriumhydroxidlösung zu den Würmern geben und schnell mit einem Wirbel vermischen. Inkubieren Sie die Röhre auf einer Wippe, legen Sie einen Tropfen Wurmlösung auf ein Glasmikroskop-Dia und überprüfen Sie alle zwei Minuten unter einem Stereoskop für vier bis acht Minuten auf Wurmlyse. Wenn etwa 70% der Würmer lysiert und die Eier freigesetzt wurden, stoppen Sie sofort die Lyse mit dem Zusatz von Eipuffer.Dann zentrifugieren Sie die Embryonen und Wurmkadaver viermal das Pellet mit frischem Eipuffer zwischen den Waschungen, um alle verbleibenden Bleichmittel zu entfernen. Nach der letzten Wäsche sollte das Pellet weiß erscheinen. Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter autoklaviertem Wasser und fünf Milliliter nukzessirose, um die Embryonen durch Zentrifugation von den Kadavern zu trennen.Entfernen Sie das Rohr nach der Dichtegradiententrennung vorsichtig aus der Zentrifuge und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um drei bis vier Milliliter der am oberen Meniskus schwebenden Embryonen in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen. Waschen Sie die Embryonen dreimal mit autoklaviertem Wasser, um die Saccharose zu entfernen, gefolgt von drei Wäschen im M9-Puffer. Nach der letzten Wäsche die Embryonen über Nacht auf einem Shaker in 10 Milliliter n frischer M9-Puffer brüten, damit die Eier schlüpfen und im L1-Larvenstadium bleiben.Nach nicht mehr als 14 Stunden auf dem Shaker, waschen Sie die L1 Larven dreimal mit dem autoklavierten Wasser, um alle Pheromone zu entfernen, die von den Larven freigesetzt werden, und setzen Sie das Larvenpellet in einem Milliliter Wasser wieder auf. Verdünnen Sie ein Aliquot von Würmern auf ein Verhältnis von eins zu 10 und fügen Sie 1:10 Mikroliter Tropfen auf einem Glasschlitten hinzu und zählen Sie die Würmer unter dem Stereomikroskop. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine durchschnittliche Anzahl von Würmern zu erhalten.Verwenden Sie eine Pipette, um genügend Tröpfchen der Wurmlösung auf eine Raumtemperatur NA22 Platte hinzuzufügen, um etwa ein mal 10 zu den dritten Würmern für die Kultur auszusäen und die Platte halb offen zu lassen, bis die Tropfen austrocknen. Dann inkubieren Sie die Platte bedeckt und kopfüber bei 20 Grad Celsius für etwa 44 bis 48 Stunden oder bis die Würmer späte L4-Stufe erreichen, wie visuell unter einem Stereomikroskop bestätigt. Zur manuellen Beurteilung von SWIP 40 Mikroliter Steuerlösung mit oder ohne 0,5 Millimolar Amphetamin in eine Glas-Spotplatte geben.Unter einem Stereoskop acht bis zehn späte L4-Bühnenwürmer mit einem Wimpernpick chenlassen und die Pick in den Brunnen, der die Lösung enthält, untertauchen, bis sich die Würmer von der Pick entfernen und in die Lösung schwimmen. Starten Sie den Timer. Beachten Sie die Anzahl der Würmer, die in den Brunnen freigesetzt werden, und beobachten und notieren Sie die Anzahl der Würmer, die SWIP bei jeder Minutenmarke für insgesamt 10 Minuten ausstellen.Kopieren Sie am Ende des Verfahrens die Rohdaten in eine Kalkulationstabelle und berechnen Sie den Prozentsatz der gelähmten Würmer, indem Sie die Anzahl der Würmer, die in jeder Minute gelähmt sind, durch die Gesamtzahl der Würmer dividieren, die während des Tests getestet wurden, und multiplizieren sich mit 100. Kopieren Sie die Prozentwerte in jede Grafik- und Statistiksoftware, und zeichnen Sie die Daten mit Prozentwerten von SWIP auf der y-Achse und Zeit auf der x-Achse im XY-Diagrammformat. Statistische Analysen zwischen den Kontroll- und Amphetamin-behandelten Gruppen und der Behandlungszeitpunkt können beispielsweise mittels zweiseitiger ANOVA- und Post-hoc-Analyse durchgeführt werden.Für die automatisierte Analyse der schwimminduzierten Lähmung richten Sie die Kamera, die Wurm-Tracker-Software und das Skript ein, um die Tracking-Softwareanalyse auszuführen, und verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um einen einzelnen L4-Wurm im späten Stadium in eine Glasfleckplatte zu legen, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie dann Schwimmvideos eines Wurms nach dem anderen auf und verwenden Sie die Wurm-Tracker-Software, um die Häufigkeit von Körperbiegungen zu berechnen, nach dem Skript, das mit der Tracking-Software geliefert wurde, um die Wurm-Thrashing-Frequenz zu erhalten, und um Wärmekarten aus den Wurm-Thrashing-Daten zu generieren. Die meisten der in der Steuerungslösung getesteten Würmer schwimmen mindestens 10 Minuten ununterbrochen.Würmer, die entweder der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, zeigen SWIP nicht in der ersten Minute der Beobachtung. Während würmer, die mit der Kontrolllösung behandelt werden, jedoch 10 Minuten lang schwimmen, beginnen mit Amphetamin behandelte Würmer nach zwei Minuten Behandlung SWIP auszustellen. Und nach 10 Minuten zeigen 66% der Tiere SWIP.Hier werden Beispiele für Wärmekarten von Tieren gezeigt, die der Kontrolle oder Amphetamin ausgesetzt sind, mit einer erwarteten erheblichen Zunahme der Lähmung, die bei den mit Amphetaminen behandelten Tieren beobachtet wird. Bevor man diesen Test versucht, sollte man mit der Kommissionierung und Entwicklungsinszenierung von C.elegans gut vertraut sein. Die Beteiligung des dopaminergen Systems in das SWIP-Verhalten sollte mit Tieren ohne expression von dopaminergen Proteinen oder durch die Erschöpfung von Dopaminvesikeln mit Reserpin bestätigt werden.SWIP kann bei der Identifizierung neuer Proteine, die am Wirkmechanismus von Medikamenten beteiligt sind, die bei der dopaminergen Synapsis wirken, eine wichtige Rolle spielen.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Erstellen dynamischer Bilder Kurzlebige Dopamin Schwankungen mit lp-ntPET: Dopamin Filme der Cigarette Smoking

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Forschung

Verhalten

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Aufdecken Schlag Taubheit: Entdecken Rhythmusstörungen mit Synchronized Finger Tapping und Wahrnehmungszeit Aufgaben

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Eine Vorgehensweise, um Context-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkoholsucht bei Ratten Verhalten beobachten

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Prüfung von Rapid Dopamine Dynamics mit Fast Scan Cyclovoltammetrie Während Intraorale Geschmacksträger in Verwaltung Awake Rats

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking-Steuerung zur Beurteilung kognitiver Funktionen bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversible Kühlung-induzierte Deaktivierungen kortikalen Beiträge zum Hindernis Speicher in der zu Fuß Katze zu studieren

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Biomechanische Analysemethoden zur Beurteilung der Lungenleistung professioneller Badmintonspieler

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Verwendung von Gesichts Elektromyographie Gesichtsmuskel Reaktionen auf erfahrene und beobachteten affektive Berührung beim Menschen bewerten

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Ein standardisiertes Protokoll für Präferenztests zur Bewertung des Wohlbefindens von Fischen

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Beurteilung der Gedächtnisfunktion bei Pilocarpin-induzierten epileptischen Mäusen

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...