Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

המחברים רוצה להודות ד ר אוסמה Refai מהמעבדה של ד ר רנדי בלייקלי להדרכה עם ניתוח אוטומטיות של SWIP. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NIH R01 DA042156 כדי LC.

1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>הכנת מאגר M9 על ידי המסת ח'2PO4 3.0 g (22.05 מ מ), נה2HPO4 g 6.0 (42.2 מ מ), ו- g NaCl 5.0 (85.5 מ מ) ב 1 ליטר של מים יונים בלוק. הוסף 1.0 מ"ל של 1 מ' MgSO4 (12 גרם באמצעי אחסון הסופי של 100 מ ל מים יונים בלוק) אחרי autoclaving. מיקס 100 מ"ל של x 10 וכתוצאה מכך M9 עם 900 מל של בלוק יונים מים ...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבצע וזמינותו התנהגותית, SWIP, ב- C. elegans. פרוטוקול זה הוא פשוט וישיר עם לא צבעוני טכנית ביצוע assay משתמש מאוד ידידותי. למרות זאת, ישנם כמה היבטים קריטיים זה צריכים לקחת בחשבון על מנת לבצע ביעילות וזמינותו.
צריך לקחת כדי להבטיח כי התו?...

חיות לבצע מגוון רחב של התנהגויות מולדת ומורכבים מתווכת על ידי נוירוטרנסמיטרים שונים מתואמת על ידי תהליכים מסובכים איתות. הנוירוטרנסמיטר דופמין (DA) שמתווכת התנהגויות שנשמרת מאוד על פני מינים, כולל למידה, המוטורית ועיבוד גמול.
נמטודות קרקע C. elegans, עם מערכת עצבים פשוטה יחסית וממופים היטב המורכב הנוירונים רק 302, מראה התנהגויות מורכבות בצורה ניכרת, כולל רבים שמווסתים על-ידי DA כגון ההזדווגות, למידה, שיחור מזון, גפיים, הנחת הביצה 1. בין תכונות אחרות, מחזור חיים קצר, קלות הטיפול ושימור של מולקולות איתות, להדגיש יתרונות השימוש C. elegans כמודל ללימוד הבסיס העצבי של התנהגויות ההכפלה.
ההרמפרודיט C. elegans מכיל נוירונים דופאמין שמונה; בנוסף לכך, הזכר מכיל שישה זוגות נוספים להזדווגות למטרות. כמו יונקים, הנוירונים הללו לסנתז DA ולבטא את המשגר DA (DAT-1), חלבון ממברנה נמצאו אך ורק בנוירונים דופאמין, אשר מסיע DA שפורסם החריץ הסינפטית בחזרה לתוך הנוירונים דופאמין. יתר על כן, רוב החלבונים המעורבים בכל שלב של סינתזה, אריזה ועל שחרור דא מאוד נשמרים בין תולעים ובני ו, כמו אצל יונקים, DA ממיקרו התנהגויות האכלה ובאופן C. elegans2.
C. elegans זוחל על משטחים מוצקים, שוחה עם התנהגות אופיינית בהלקאה במים. מעניין, מוטציות חסר הבעה של DAT-1 (dat-1) לזחול בדרך כלל על משטח מוצק אבל להיכשל לקיים את השחייה כאשר הושקע במים. התנהגות זו היה כינה שחייה המושרה שיתוק או SWIP. ניסויים קודמים הראו כי SWIP, בין השאר, נגרמת על ידי עודף של DA בתוך החריץ סינפטית זה בסופו של דבר מהתזונה קולטני postsynaptic כמו D2 (DOP-3). אמנם במקור שזוהתה dat-1 ההסתרה חיות3, SWIP הוא ציין גם אצל בעלי חיים פראי-סוג לטפל בתרופות שמונעים הפעילות של DAT (כגון imipramine4) ו/או לגרום שחרור דא (למשל, אמפטמין5). מצד שני, למנוע מניפולציות תרופתי או מחלה גנטית הסב סינתזה ושחרור של DA וחסימת פונקציה קולטן DOP-3 SWIP6. יחדיו, אלה נתונים שפורסמו כבר הקמנו SWIP בתור כלי אמין כדי לחקור את ההשפעות התנהגותית נגרם על ידי מוטציה חלבונים בתוך וכולינרגיים הסינפסות3,4,7 וכדי להיות מועסק העברה של מסכי גנטי לצורך זיהוי הרומן משעולים רגולטוריות מעורב DA איתות7,8,9,10,11,12. בנוסף, על ידי מתן של הבדיקה לכימות בקלות של שיכרון התנהגות בבעלי חיים, SWIP מאפשרת הבהרה של מנגנוני הפעולה של תרופות כמו אמפטמין (AMPH), azaperone-דופאמין synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
פרוטוקולים עבור ביצוע מבחני SWIP את תוארו לפני16. כאן נתאר בפירוט את המתודולוגיה ואת ההתקנה כדי לבצע את הבדיקה עם המטרה של מתן כמדריך חזותי עבור הקהילה C. elegans לבצע ביעילות SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

וזמינותו שחייה שמתואר פרוטוקול זה הוא כלי תקף כדי לזהות חלבונים ויסות של דופאמין synapses. בדומה יונקים, דופמין (DA) קובע מספר פונקציות ב- C. elegans כולל למידה ופעילות מוטורית. תנאי זה לעורר שחרור דא (למשל, אמפטמין (AMPH) טיפולים) או זה למנוע DA סיווג (למשל, חיות חסר המשגר DA (dat-1) אשר אינם מסוגלים reaccumulating DA לתוך הנוירונים) ליצור עודף של DA חוץ-תאית בסופו של דבר וכתוצאה מכך ומכניקה עכבות. תופעה זו בולטת במיוחד כאשר בעלי החיים לשחות במים. למעשה, בעוד חיות פראי-סוג להמשיך לשחות לתקופה ממושכת, מוטציות null dat-1 ופראי-סוג שטופלו AMPH או מעכבים של המשגר DA לשקוע לתחתית הבאר ואל תזוז. תופעה זו נקראת "שחייה המושרה שיתוק" (SWIP). למרות וזמינותו SWIP וותיקה, תיאור מפורט של השיטה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע SWIP. כדי לבצע את הבדיקה, מאחר חיות הבמה-4 דרגות זחל מוצבים צלחת זכוכית ספוט המכיל סוכרוז פתרון בקרת עם או בלי AMPH. בעלי חיים הם הבקיע עבור התנהגותם שחייה באופן ידני על-ידי ויזואליזציה תחת סטריאוסקופ או באופן אוטומטי על ידי הקלטה עם מצלמה רכוב על סטריאוסקופ. קטעי וידאו הם מכן נותחו באמצעות תוכנת מעקב, אשר מניב ייצוג חזותי של תדירות בהלקאה ושיתוק בצורה של מפות חום. שתי המערכות ידניים ואוטומטיים מבטיח של הבדיקה לכימות בקלות של יכולת שחייה החיה, ובכך להקל על הקרנה עבור חיות הנושאת מוטציות בתוך מערכת וכולינרגיים או גנים עזר. בנוסף, ניתן להשתמש SWIP כדי להבהיר את מנגנון הפעולה של תרופות של התעללות כגון AMPH.

נציג דוגמה SWIP assay המושרה על ידי טיפול AMPH. איור 1 מציג ייצוג סכמטי של ההתקנה assay כמתואר לעיל. עבור assay ידנית, בערך בגיל 8-10 מסונכרן תולעים בשלב מאוחר של L4 נאספים עם עפעף או פלטינה לבחור להציב לתוך צלחת ספוט זכוכית מלאים µL 40 של 200 סוכרוז mOsm/L (פתרון שליטה) או סוכרוז...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

שחייה המושרה שיתוק כדי להעריך דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans

שחייה המושרה assay התנהגותית ומבוססת חקר המנגנונים המשמשת כבסיס של דופמין איתות ב Caenorhabditis elegans (C. elegans) היא שיתוק (SWIP). עם זאת, שיטה מפורטת כדי לבצע את הבדיקה לוקה בחסר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול צעד אחר צעד עבור SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שחייה-Induced שיתוק או SWIP, הערכה התנהגותית כדי להעריך דופמין איתות C.elegans. SWIP מאפשר זיהוי מהיר של גנים בתוך או קשור סינפסת דופאמין. שיטה זו מאפשרת את חקירת ההשפעות המיוצרות על ידי עודף של דופמין חוץ תאית הנגרמת למשל על ידי תרופות או על ידי מוטציות על טרנספורטר דופמין.כדי להבטיח שכל התולעים שנבדקו במהלך המבחן ישחו במשך אותה כמות זמן, יש להעביר את בעלי החיים במהירות לפתרון. הדגימה של ההליך תהיה סירישה קודומאלה ושלווה סוסי. שניהם עובדים במעבדה שלי.כדי להקים תרבויות סטרטר תולעת, להשתמש מרית סטרילית לחתוך חתיכות קטנות של אגר מצלחת המכילה C.elegans מוזן היטב ולהעביר את חתיכות אגר לתוך צלחות NA22 E.coli בודדים. לאחר הדגירה של הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים, חזותית לאשר את נוכחותם של מבוגרים gravid תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי להשיג אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים, להשפריץ מים על צלחת מלאה מבוגרים gravid.בעדינות מערבל את הצלחת כדי לנתק את התולעים ולהשתמש פיפטה סילוק להעביר את התולעים לתוך צינור חרוט פוליסטירן 15 מיליליטר. לאחר משיכת התולעים מצלחת שנייה לתוך הצינור, לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה במשך שלוש שטיפות ב 15 מיליליטר של מים autoclaved לכל לשטוף. המים צריכים להיראות צלולים לאחר הכביסה האחרונה.לאחר הצנטריפוגה האחרונה, מוסיפים חמישה מיליליטר של פתרון נתרן hypochloride הידרוקסידי טרי לתולעים ומערבבים במהירות עם מערבולת. להדק את הצינור על נדנדה, למקם טיפה של פתרון תולעת על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית ולבדוק תות תולעת תחת סטריאוסקופ כל שתי דקות במשך ארבע עד שמונה דקות. כאשר כ-70% מהתולעים שוחררו והביצים שוחררו, עצרו מיד את התיזה עם תוספת של חיץ ביצים.ואז צנטריפוגה העוברים פגרי תולעת ארבע פעמים resuspending את גלולה עם חיץ ביצה טרי בין שוטף כדי להסיר את כל אקונומיקה שנותרה. לאחר הכביסה האחרונה, גלולה צריך להיראות לבן. תבזבזו מחדש את גלולת המים בחמישה מיליליטר של מים אוטוקלאבים וחמישה מיליליטר של 60% סוכרוז כדי להפריד את העוברים מהגסים באמצעות צנטריפוגה.הסר את הצינור בזהירות מן הצנטריפוגה לאחר הפרדת שיפוע צפיפות ולהשתמש פיפטה פסטר זכוכית להעביר שלושה עד ארבעה מיליליטר של העוברים צפים במניסקוס העליון לתוך צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם מים autoclaved כדי להסיר את סוכרוז ואחריו שלוש שטיפות במאגר M9. לאחר הכביסה האחרונה, דגירה העוברים על שייקר לילה ב 10 מיליליטר של חיץ M9 טרי כדי לאפשר את הביצים לבקוע ולהישאר בשלב זחל L1.לאחר לא יותר מ 14 שעות על שייקר, לשטוף את הזחלים L1 שלוש פעמים עם מים autoclaved כדי להסיר את כל פרומונים שפורסמו על ידי הזחלים ולתלות מחדש את גלולת הזחל במיליליטר אחד של מים. לדלל aliquot של תולעים ליחס של אחד עד 10 ולהוסיף 1:10 טיפת microliter על מגלשת זכוכית לספור את התולעים תחת מיקרוסקופ סטריאו. חזור על הפעולה כדי להשיג מספר ממוצע של תולעים.השתמש פיפטה להוסיף טיפות מספיק של פתרון התולעת על צלחת NA22 טמפרטורת החדר לזרוע בערך פעם אחת 10 לתולעים השלישית לתרבות ולהשאיר את הצלחת חצי פתוח עד טיפות להתייבש. לאחר מכן הדגירה את הצלחת מכוסה במהופך ב 20 מעלות צלזיוס במשך כ 44 עד 48 שעות או עד התולעים להגיע בשלב L4 מאוחר כפי שאושר חזותית תחת מיקרוסקופ סטריאו. להערכה ידנית של SWIP, להוסיף 40 microliters של פתרון שליטה עם או בלי אמפטמין 0.5 מילימולר לתוך צלחת ספוט זכוכית.תחת סטריאוסקופ, בחר 8 עד 10 תולעי שלב L4 מאוחרות עם פיק עפעף והשקע את הבחירה באר המכילה את הפתרון עד שהתולעים יזוזו מהבחירה וישחו לתוך הפתרון. הפעל את שעון הזמן. שים לב למספר התולעים ששוחררו לתוך הבאר ולהתבונן ולתזמן את מספר התולעים המציגות SWIP בכל סימן דקה במשך סך של 10 דקות.בסוף ההליך, להעתיק את הנתונים הגולמיים לתוך גיליון אלקטרוני ולחשב את אחוז התולעים משותק על ידי חלוקת מספר התולעים משותק בכל דקה על ידי המספר הכולל של תולעים שנבדקו לאורך הבדיקה והתרבות על ידי 100. העתק את ערכי האחוזים לכל גרפים ותוכנות סטטיסטיות והתווה את הנתונים עם ערכי אחוזים של SWIP בציר ה- y ובשעה בציר ה- x באמצעות תבנית הגרף XY. ניתוח סטטיסטי בקרב קבוצות הבקרה והאמפטמין וזמן הטיפול ניתן לבצע, למשל באמצעות ניתוח דו-כיווןי של ANOVA ופוסט הוק.לניתוח אוטומטי של שיתוק הנגרמת על ידי שחייה, הגדר את המצלמה, תוכנת מעקב התולעת והתסריט כדי להריץ את ניתוח תוכנת המעקב ולהשתמש בבחירה של עפעפיים כדי למקם תולעת L4 אחת בשלב מאוחר לתוך צלחת ספוט זכוכית כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן להקליט קטעי וידאו שחייה של תולעת אחת בכל פעם ולהשתמש בתוכנת גשש תולעת כדי לחשב את התדירות של עיקולי הגוף, בעקבות התסריט שסופק עם תוכנת המעקב כדי להשיג את תדירות תדירות התותחים תולעת, וליצור מפות חום מן הנתונים תכריעת התולעת. רוב התולעים שנבדקו בתסרון הבקרה שוחות ברציפות במשך 10 דקות לפחות.תולעים שנחשפו לשליטה או אמפטמין אינן מראות SWIP בדקה הראשונה של התצפית. עם זאת, בעוד תולעים שטופלו בתתופת הבקרה ממשיכות לשחות במשך 10 דקות, תולעים שטופלו באמפטמין מתחילות להפגין SWIP לאחר שתי דקות של טיפול. ואחרי 10 דקות, 66% מבעלי החיים מראים SWIP.כאן מוצגות דוגמאות למפות חום של בעלי חיים שנחשפו לשליטה או לאמפטמין עם עלייה ניכרת צפויה בשיתוק שנצפה בבעלי החיים שטופלו באמפטמין. לפני שתנסה את ההתמדה הזו, יש להכיר היטב את הבימוי ההתפתחותי של C.elegans. המעורבות של מערכת דופאמין בהתנהגות SWIP צריך להיות מאושר באמצעות בעלי חיים חסרים את הביטוי של חלבונים דופאמין או על ידי דלדול של וריונים דופמין עם Reserpine.SWIP יכול להיות אינסטרומנטלי בזיהוי חלבונים חדשים המעורבים במנגנון הפעולה של תרופות הפועלות בסינאפסיס הדופאמינרגית.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

יצירת תמונות דינמיות של תנודות דופמין קצרות עם LP-ntPET: סרטי דופמין של עישון סיגריות

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

חשיפת חירשות Beat: הפרעות קצב זיהוי עם אצבע מסונכרנות הקשה ומשימות תזמון תפיסתי

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

נוהל ללב התחדשות מושרה הקשר של התנהגות אלכוהול מחפשי מיזוג הפבלובית בחולדות

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

בחינת המהירה דופמין Dynamics עם הסריקה מהירה Voltammetry המחזורי במהלך פנים הפה Tastant מנהל בחולדות ערה

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

בקרת Eye-מעקב כדי להעריך תפקודים קוגניטיביים אצל חולים עם טרשת לרוחב amyotrophic

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

הפיכה Deactivations קירור-induced ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול זיכרון של החתול הליכה

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

שיטות ניתוח ביומכאני להערכת ביצועים מקצועיים לשחקני בדמינטון

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

באמצעות הפנים אלקטרומיוגרפיה כדי להעריך תגובות שרירי פנים מגע רגשית מנוסים ו נצפתה אצל בני אדם

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

פרוטוקול מתוקננת עבור בדיקות העדפה להערכת הרווחה דגים

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

הערכה של תפקוד הזיכרון בפילסוקרפיין-עכברים מבוססי אפילפסיה

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...