Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare il dottor Osama Refai dal laboratorio del Dr. Randy Blakely per guida con l'analisi automatizzata di SWIP. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da NIH R01 DA042156 LC.

1. preparazione delle soluzioni e dei Media
<ol><li>Preparare il tampone di M9 sciogliendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e NaCl 5.0 g (85,5 mM) in 1 L di acqua deionizzata in autoclave. Aggiungere 1,0 mL di 1 M MgSO4 (12 g in un volume finale di 100 mL di acqua deionizzata in autoclave) dopo la sterilizzazione in autoclave. Mix 100 mL di 10 x risultante M9 con 900 mL di sterilizzato nell'autoclave acqua deionizzata per rendere una soluzione 1x.</...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per eseguire un'analisi comportamentale, SWIP, c.elegans. Questo protocollo è semplice e lineare con nessun principali ostacoli tecnici, rendendo questo test molto facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni aspetti critici che devono essere considerati al fine di svolgere efficacemente il dosaggio.
Prestare la massima attenzione per garantire che i vermi utilizzati per il dosaggio sono ben nutriti, dal momento che la restrizione dietetica col...

Animali eseguono una serie di comportamenti innati e complessi che sono mediati da diversi neurotrasmettitori coordinati da intricati processi di segnalazione. Il neurotrasmettitore dopamina (DA) media comportamenti altamente conservati tra le specie, compreso l'apprendimento, la funzione di motore ed elaborazione di ricompensa.
C. elegans, il nematode del terreno con un sistema nervoso relativamente semplice e ben mappato consistente solo 302 neuroni, Mostra comportamenti marcatamente complessi, compreso molti che sono disciplinati DA come accoppiamento, apprendimento, foraggiamento, locomozione e deposizione delle uova 1. tra le altre caratteristiche, ciclo di vita breve, facilità di manipolazione e la conservazione delle molecole di segnalazione, evidenziare i vantaggi dell'utilizzo di c. elegans come modello per studiare le basi neurali dei comportamenti conservati.
L'Ermafrodito di c. elegans contiene otto neuroni dopaminergici; Oltre a questi, il maschio contiene sei paia supplementare per scopi di accoppiamento. Come nei mammiferi, questi neuroni sintetizzano DA ed esprimere il trasportatore DA (DAT-1), una proteina di membrana presenti esclusivamente nei neuroni dopaminergici, che trasporta DA rimessi nella fessura sinaptica in neuroni dopaminergici. Inoltre, la maggior parte delle proteine coinvolte in ogni fase di sintesi e rilascio di DA imballaggi sono altamente conservata tra vermi e gli esseri umani e, come nei mammiferi, DA modula alimentazione comportamenti e locomozione in c. elegans2.
C. elegans per indicizzazione su superfici solide e nuota con un comportamento caratteristico thrashing in acqua. È interessante notare che, mutanti privi di espressione di DAT-1 (dat-1) scansione normalmente su superficie solida ma non riescono a sostenere nuoto quando immerso in acqua. Questo comportamento è stato definito nuoto indotta paralisi o SWIP. Precedenti esperimenti hanno dimostrato che SWIP, in parte, è causata da un eccesso di DA nella fessura sinaptica che in ultima analisi overstimulates i recettori postsinaptici D2-like (DOP-3). Anche se originariamente identificato nel dat-1 knockout animali3, SWIP è osservato anche in animali trattati con farmaci che bloccano l'attività del DAT (ad es., imipramina4) e/o indurre il rilascio di DA (ad esempio, anfetamina5). D'altra parte, manipolazioni farmacologiche o genetiche evitanti la sintesi ed il rilascio di DA e blocco della funzione del recettore DOP-3 prevenire SWIP6. Presi insieme, questi dati già pubblicati hanno stabilito SWIP come uno strumento affidabile per studiare gli effetti del comportamento causati da proteine mutate entro dopaminergici sinapsi3,4,7 e possono essere impiegati per avanti schermi genetici per l'identificazione dei nuovi meccanismi normativi nei DA segnalazione7,8,9,10,11,12. Inoltre, fornendo una lettura facilmente quantificabile di comportamento farmaco-indotta in animali viventi, SWIP consente la delucidazione dei meccanismi di azione delle droghe come anfetamina (AMPH) e azaperone presso dopaminergiche sinapsi5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolli per eseguire i dosaggi SWIP sono state descritte prima16. Qui, descriviamo dettagliatamente la metodologia e il programma di installazione per eseguire l'analisi con l'obiettivo di fornire una guida visiva per la comunità di c. elegans svolgere efficacemente SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Il saggio di nuoto descritto in questo protocollo è un valido strumento per identificare le proteine che regolano il dopaminergico sinapsi. Simili ai mammiferi, dopamina (DA) controlla diverse funzioni in c. elegans , tra cui attività di apprendimento e motore. Condizioni che stimolano il rilascio di DA (per esempio, trattamenti di anfetamina (AMPH)) o che impediscono DA liquidazione (ad es., gli animali manca il trasportatore DA (dat-1) che sono in grado di reaccumulating DA nei neuroni) generare un eccesso di extracellulare DA che si traduce nella locomozione inibito. Questo comportamento è particolarmente evidente quando animali nuotare in acqua. Infatti, mentre animali di selvaggio-tipo continuano a nuotare per un periodo prolungato, dat-1 mutanti e wild-type trattati con AMPH o inibitori del trasportatore DA depositano sul fondo del pozzo e non si muovono. Questo comportamento viene definito "Nuoto indotta paralisi" (SWIP). Anche se il dosaggio SWIP è ben consolidato, una descrizione dettagliata del metodo è carente. Qui, descriviamo una guida dettagliata per eseguire SWIP. Per eseguire il test, tardi larvali fase-4 animali sono posti in una lastra di vetro posto contenente soluzione di saccarosio di controllo con o senza AMPH. Gli animali sono notati per il loro comportamento di nuoto o manualmente da visualizzazione sotto uno stereoscopio o automaticamente registrando con una telecamera montata sullo stereoscopio. Video vengono poi analizzati utilizzando un software di monitoraggio, che produce una rappresentazione visiva di frequenza thrashing e paralisi sotto forma di mappe di calore. Entrambi i sistemi manuali e automatizzati garantiscono una lettura facilmente quantificabile di abilità nel nuoto degli animali e quindi facilitano lo screening per gli animali recanti mutazioni all'interno del sistema dopaminergico o per geni ausiliari. Inoltre, SWIP utilizzabile per delucidare il meccanismo d'azione dei farmaci di abuso come AMPH.

Presentiamo un esempio di analisi SWIP indotta dal trattamento di AMPH. La figura 1 Mostra una rappresentazione schematica dell'apparato di test come descritto sopra. Per il saggio manuale, circa 8-10 anni, sincronizzato tardo L4 fase vermi vengono raccolti con una ciglia o platino pick e inseriti in una lastra di vetro posto riempito con 40 µ l di 200 mOsm/L saccarosio (soluzione di controllo) o saccarosio con 0,5 mM AMPH e testato per SWIP.
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Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Nuoto paralisi indotta a valutare dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans

Nuoto indotta paralisi (SWIP) è un'analisi comportamentale consolidata utilizzata per studiare i meccanismi di fondo di dopamina segnalazione in Caenorhabditis elegans (c. elegans). Tuttavia, manca un metodo dettagliato per eseguire il test. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la paralisi indotta dal nuoto o SWIP, un saggio comportamentale per valutare la segnalazione della dopamina nei C.elegans. L'SWIP consente la rapida identificazione dei geni all'interno o correlati alla sinapsi dopaminergica. Questo metodo consente l'indagine degli effetti prodotti da un eccesso di dopamina extracellulare che è causato ad esempio da farmaci o da mutazioni al trasportatore di dopamina.Per garantire che tutti i vermi testati durante il test nuovano per la stessa quantità di tempo, gli animali devono essere trasferiti rapidamente nella soluzione. A dimostrare la procedura saranno Sirisha Kudumala e Serene Sossi. Entrambi lavorano nel mio laboratorio.Per impostare colture di avviamento del verme, utilizzare una spatola sterile per tagliare piccoli pezzi di agar da un piatto contenente C.elegans ben nutriti e trasferire i pezzi di agar in singole piastre NA22 E.coli. Dopo aver incubato le piastre a 20 gradi Celsius per tre o quattro giorni, confermare visivamente la presenza di adulti gravidi al microscopio stereo. Per ottenere una popolazione sincronizzata di vermi, spruzzare acqua su un piatto pieno di adulti gravidi.Ruotare delicatamente la piastra per rimuovere i vermi e utilizzare una pipetta di smaltimento per trasferire i vermi in un tubo conico in polistirolo da 15 millilitri. Dopo aver tirato i vermi da una seconda piastra nel tubo, raccogliere i vermi per centrifugazione per tre lavaggi in 15 millilitri di acqua autoclavata per lavaggio. L'acqua dovrebbe apparire limpida dopo l'ultimo lavaggio.Dopo l'ultima centrifugazione, aggiungere cinque millilitri di una soluzione di idrossido di sodio ipocloruro di sodio appena preparata ai vermi e mescolare rapidamente con un vortice. Incubare il tubo su un rocker, posizionare una goccia di soluzione di verme su uno scivolo al microscopio di vetro e verificare la lisi del verme sotto uno stereoscopio ogni due minuti per quattro-otto minuti. Quando circa il 70% dei vermi è stato lisciviato e le uova erano state rilasciate, interrompere immediatamente la lisi con l'aggiunta di tampone di uova.Quindi centrifugare gli embrioni e le carcasse di vermi quattro volte rimescolando il pellet con tampone di uova fresche tra i lavaggi per rimuovere la candeggina rimanente. Dopo l'ultimo lavaggio, il pellet dovrebbe apparire bianco. Rimescolare il pellet in cinque millilitri di acqua autoclavata e cinque millilitri di saccarosio al 60% per separare gli embrioni dalle carcasse mediante centrifugazione.Rimuovere accuratamente il tubo dalla centrifuga dopo la separazione del gradiente di densità e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire da tre a quattro millilitri degli embrioni che galleggiano nel menisco superiore in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Lavare gli embrioni tre volte con acqua autoclavata per rimuovere il saccarosio seguito da tre lavaggi nel tampone M9. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare gli embrioni su uno shaker durante la notte in 10 millilitri di tampone M9 fresco per consentire alle uova di schiudersi e rimanere allo stadio larvale L1.Dopo non più di 14 ore sullo shaker, lavare le larve L1 tre volte con l'acqua autoclavata per rimuovere eventuali feromoni rilasciati dalle larve e rimescolare il pellet larvale in un millilitro d'acqua. Diluire un'aliquota di vermi a un rapporto uno a 10 e aggiungere 1:10 microlitro cadere su uno scivolo di vetro e contare i vermi al microscopio stereo. Ripetere l'evento per ottenere un numero medio di worm.Utilizzare una pipetta per aggiungere abbastanza goccioline della soluzione di verme su una piastra NA22 a temperatura ambiente per seminare circa una volta 10 al terzo verme per la coltura e lasciare la piastra semiaperta fino a quando le gocce si asciugano. Quindi incubare la piastra coperta e capovolta a 20 gradi Celsius per circa 44-48 ore o fino a quando i vermi raggiungono la fase L4 tardiva come confermato visivamente sotto un microscopio stereo. Per la valutazione manuale dell'SWIP, aggiungere 40 microlitri di soluzione di controllo con o senza anfetamina millimolare 0,5 millimolare in una piastra spot di vetro.Sotto uno stereoscopio, scegli da otto a 10 vermi in fase L4 tardiva con un piccone per ciglia e immergere il piccone nel pozzo contenente la soluzione fino a quando i vermi non si spostano dal piccone e nuotano nella soluzione. Avviare il timer. Si noti il numero di worm rilasciati nel pozzo e si osserva e si registra il numero di worm che espongono SWIP a ogni minuto per un totale di 10 minuti.Al termine della procedura, copiare i dati grezzi in un foglio di calcolo e calcolare la percentuale di worm paralizzati dividendo il numero di worm paralizzati ad ogni minuto per il numero totale di worm testati durante il test e moltiplicandosi per 100. Copiare i valori percentuali in qualsiasi software grafico e statistico e tracciare i dati con i valori percentuali di SWIP sull'asse y e il tempo sull'asse x utilizzando il formato grafico XY. L'analisi statistica tra i gruppi di controllo e trattati con anfetamine e il tempo di trattamento può essere eseguita, ad esempio utilizzando anova bi senso e analisi post hoc.Per l'analisi automatizzata della paralisi indotta dal nuoto, impostare la fotocamera, il software worm tracker e lo script per eseguire l'analisi del software di tracciamento e utilizzare un piccone per posizionare un singolo worm L4 in fase avanzata in una piastra spot di vetro, come mostrato in precedenza. Quindi registrare i video di nuoto di un worm alla volta e utilizzare il software worm tracker per calcolare la frequenza delle curve del corpo, seguendo lo script fornito con il software di tracciamento per ottenere la frequenza di thrashing del worm e per generare mappe di calore dai dati di thrashing del worm. La maggior parte dei vermi testati nella soluzione di controllo nuota continuamente per almeno 10 minuti.I vermi esposti al controllo o alle anfetamine non mostrano l'SWIP nel primo minuto di osservazione. Tuttavia, mentre i vermi trattati con la soluzione di controllo continuano a nuotare per 10 minuti, i vermi trattati con anfetamina iniziano a mostrare SWIP dopo due minuti di trattamento. E dopo 10 minuti, il 66% degli animali mostra SWIP.Qui vengono mostrati esempi di mappe di calore degli animali esposti al controllo o alle anfetamine con un previsto notevole aumento della paralisi osservata negli animali trattati con anfetamine. Prima di tentare questo saggio, si dovrebbe conoscere bene la scelta e la messa in scena dello sviluppo di C.elegans. Il coinvolgimento del sistema dopaminergico nel comportamento SWIP dovrebbe essere confermato utilizzando animali privi dell'espressione di proteine dopaminergiche o dall'esaurimento delle vescicole di dopamina con reserpina.Swip può essere strumentale nell'identificazione di nuove proteine coinvolte nel meccanismo d'azione dei farmaci che agiscono presso la sinapsi dopaminergica.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

La creazione di immagini dinamiche delle fluttuazioni della dopamina breve durata con lp-ntPET: Video della dopamina del fumo di sigaretta

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

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