Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Osama Refai do laboratório do Dr. Randy Blakely para orientação com a análise automatizada de SWIP. Este trabalho foi financiado por fundos do NIH R01 DA042156 para LC.

1. preparação de soluções e meios de comunicação
<ol><li>Preparar a M9 reserva dissolvendo KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) e g NaCl 5.0 (85,5 mM) em 1 litro de água destilada esterilizada. Adicione 1,0 mL de 1m MgSO4 (12 g em um volume final de 100 mL de água deionizada esterilizada) após a esterilização em autoclave. Mistura de 100 mL do resultante x 10 M9 com 900 mL de autoclavados deionizada para fazer uma solução de 1x.</li>
	<li>P...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para realizar um ensaio comportamental, SWIP, em c. elegans. Este protocolo é simples e direta com nenhum obstáculos técnicos tornando este usuário de ensaio muito amigável. No entanto, existem alguns aspectos essenciais que precisam ser considerados para efetivamente realizar o ensaio.
Deve ter cuidado para garantir que os vermes que usada para o ensaio são bem alimentados, desde que a restrição dietética afeta SWIP<sup class="xre...

Animais executam uma variedade de comportamentos inatos e complexas que são mediadas por neurotransmissores diferentes, coordenados por intrincados processos de sinalização. A neurotransmissor dopamina (DA) Medeia comportamentos altamente conservados entre espécies, incluindo a aprendizagem, a função motora e processamento de recompensa.
C. elegans, o nematódeo de solo com um sistema nervoso bem mapeado e relativamente simples consistindo de apenas 302 neurônios, mostra comportamentos marcadamente complexos, incluindo muitos que são regulados pelo DA como acasalamento, aprendendo, forrageamento, locomoção e postura de ovos 1. entre outras características, ciclo de vida curto, facilidade de manuseio e conservação de moléculas de sinalização, destacar as vantagens do uso de c. elegans como modelo para estudar a base neural dos comportamentos conservadas.
O hermafrodita c. elegans contém oito neurônios dopaminérgicos; Além desses, o macho contém seis pares extras para fins de acasalamento. Como em mamíferos, estes neurônios sintetizam DA e expressam o transportador DA (DAT-1), uma proteína de membrana encontrada exclusivamente em neurônios dopaminérgicos, que transporta DA liberada na fenda sináptica volta para os neurônios dopaminérgicos. Além disso, a maioria das proteínas envolvidas em cada etapa da síntese, a embalagem e a liberação DA é altamente conservada entre os vermes e os seres humanos e, como nos mamíferos, DA modula comportamentos de alimentação e locomoção em c. elegans2.
C. elegans rasteja sobre superfícies sólidas e nada com um comportamento característico de goleada na água. Curiosamente, mutantes, falta de expressão do DAT-1 (dat-1) rastejam normalmente na superfície sólida, mas não conseguem sustentar natação quando imerso em água. Este comportamento foi denominado paralisia induzida de natação, ou SWIP. Experiências anteriores demonstraram que SWIP, em parte, é causado por um excesso na fenda sináptica que, finalmente, estimula os receptores pós-sinápticos D2-like (DOP-3). Embora originalmente identificado em dat-1 nocaute animais3, SWIP também é observado no tipo selvagem animais tratados com drogas que bloqueiam a atividade de DAT (por exemplo, imipramina4) e/ou induzir DA liberação (por exemplo, anfetaminas5). Por outro lado, manipulações farmacológicas ou genéticas evitando a síntese e liberação DA e DOP-3 receptor função de bloqueio impedem SWIP6. Tomados em conjunto, estes dados já publicados estabeleceram SWIP como uma ferramenta confiável para estudar os efeitos comportamentais causados pela mutação proteínas dentro dopaminergic sinapses3,4,7 e a ser empregado para telas de genéticas para a frente para a identificação das vias reguladoras romance envolvidas em DA sinalização7,8,9,10,11,12. Além disso, fornecendo uma leitura facilmente quantificável de comportamento induzido em animais vivos, SWIP permite a elucidação dos mecanismos de ação de drogas como anfetaminas (ANF) e azaperona no dopaminérgico sinapses5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protocolos para a realização de ensaios os SWIP têm sido descritos antes16. Aqui, descrevemos em detalhe a metodologia e a instalação para realizar o ensaio com o objetivo de fornecer um guia visual para a comunidade de c. elegans executar eficazmente SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

O ensaio de natação descrito neste protocolo é uma ferramenta válida para identificar proteínas regulando o dopaminérgico sinapses. Semelhantes aos mamíferos, dopamina (DA) controla várias funções em c. elegans , incluindo atividade de aprendizagem e motor. Condições que estimulam a liberação DA (por exemplo, tratamentos de anfetamina (ANF)) ou que impedem DA autorização (por exemplo, animais faltando o transportador DA (dat-1) que são incapazes de reaccumulating para os neurônios) gerar um excesso DA extracelular em última análise, resultando em locomoção inibida. Esse comportamento é particularmente evidente quando os animais nadam na água. Na verdade, enquanto animais selvagem-tipo continuam a nadar por um longo período, dat-1 nula mutantes e selvagem-tipo tratadocom com ANF ou inibidores do transportador DA afundam até o fundo do poço e não se mexa. Esse comportamento é denominado "Natação paralisia induzida" (SWIP). Embora o ensaio SWIP está bem estabelecido, uma descrição detalhada do método está faltando. Aqui, descrevemos um guia passo a passo para executar SWIP. Para realizar o ensaio, larvas finais estágio-4 animais são colocados em uma placa de ponto de vidro contendo solução de sacarose de controle com ou sem ANF. Os animais são marcados por seu comportamento de natação ou manualmente pelo visualização sob um estereoscópio automaticamente por gravação com uma câmera montada sobre o estereoscópio. Vídeos são então analisados usando um software de rastreamento, que produz uma representação visual da frequência de debulha e paralisia na forma de mapas de calor. Ambos os sistemas manuais e automatizados garantem uma leitura facilmente quantificável de capacidade de natação dos animais e, assim, facilitam a triagem para animais com mutações dentro do sistema dopaminérgico ou para auxiliares genes. Além disso, SWIP pode ser usado para elucidar o mecanismo de ação de drogas de abuso como a ANF.

Nós apresentamos um exemplo de ensaio SWIP induzido pelo tratamento de ANF. A Figura 1 mostra uma representação esquemática da instalação do ensaio conforme descrito acima. Para o ensaio manual, aproximadamente 8-10 idade sincronizado tarde L4 palco vermes são coletados com um cílio ou platina escolher e colocado em uma placa de vidro local repleto de 40 µ l de 200 mOsm/L sacarose (solução controle) ou sacarose com 0,5 mM ANF e testado para SWIP.</...

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Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans

Natação induzida por paralisia (SWIP) é um ensaio comportamental bem estabelecido, usado para estudar os mecanismos subjacentes de dopamina sinalização em Caenorhabditis elegans (c. elegans). No entanto, falta um método detalhado para realizar o ensaio. Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar paralisia induzida pela natação ou SWIP, um ensaio comportamental para avaliar a sinalização de dopamina em C.elegans. O SWIP permite a identificação rápida de genes dentro ou relacionados à sinapse dopaminérgica. Este método permite a investigação dos efeitos produzidos por um excesso de dopamina extracelular que é causada, por exemplo, por drogas ou por mutações no transportador de dopamina.Para garantir que todos os vermes testados durante o ensaio nadassem pela mesma quantidade de tempo, os animais devem ser transferidos rapidamente para a solução. Demonstrando o procedimento serão Sirisha Kudumala e Serene Sossi. Ambos trabalham no meu laboratório.Para configurar culturas de partida de vermes, use uma espátula estéril para cortar pequenos pedaços de ágar de uma placa contendo C.elegans bem alimentados e transferir as peças de ágar em placas individuais NA22 E.coli. Depois de incubar as placas a 20 graus Celsius por três a quatro dias, confirme visualmente a presença de adultos gravid sob um microscópio estéreo. Para obter uma população sincronizada de vermes, esguiche água em um prato cheio de adultos gravid.Gire suavemente a placa para desalojar os vermes e use uma pipeta de disposição para transferir os vermes para um tubo cônico de poliestireno de 15 mililitros. Depois de puxar os vermes de uma segunda placa para o tubo, colete os vermes por centrifugação para três lavagens em 15 mililitros de água autoclavada por lavagem. A água deve parecer limpa após a última lavagem.Após a última centrifugação, adicione cinco mililitros de uma solução de hidróxido de sódio recém-preparada para os vermes e misture rapidamente com um vórtice. Incubar o tubo em um roqueiro, coloque uma gota de solução de verme em um slide de microscópio de vidro e verifique se há lise de verme sob um estereoscópio a cada dois minutos por quatro a oito minutos. Quando cerca de 70% dos vermes foram liseados e os ovos foram liberados, pare imediatamente a lise com a adição de tampão de ovos.Em seguida, centrifugar os embriões e carcaças de vermes quatro vezes resusususe a pelota com tampão de ovo fresco entre as lavagens para remover qualquer alvejante restante. Após a última lavagem, a pelota deve parecer branca. Resuspenque a pelota em cinco mililitros de água autoclavada e cinco mililitros de 60% de sacarose para separar os embriões das carcaças por centrifugação.Remova o tubo cuidadosamente da centrífuga após a separação do gradiente de densidade e use uma pipeta pasteur de vidro para transferir de três a quatro mililitros dos embriões flutuando no menisco superior em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Lave os embriões três vezes com água autoclavada para remover a sacarose seguida de três lavagens no tampão M9. Após a última lavagem, incubar os embriões em um shaker durante a noite em 10 mililitros de tampão M9 fresco para permitir que os ovos eclodam e permaneçam no estágio larval L1.Depois de não mais do que 14 horas no agitador, lave as larvas L1 três vezes com a água autoclavada para remover quaisquer feromônios liberados pelas larvas e resuspenque a pelota larval em um mililitro de água. Diluir uma alíquota de vermes para uma proporção de um a 10 e adicionar 1:10 microliter cair em um slide de vidro e contar os vermes sob o microscópio estéreo. Repita para obter um número médio de vermes.Use uma pipeta para adicionar gotículas suficientes da solução de vermes em uma placa NA22 de temperatura ambiente para semear aproximadamente uma vez 10 para o terceiro verme para a cultura e deixar a placa meio aberta até que as gotas sequem. Em seguida, incubar a placa coberta e de cabeça para baixo a 20 graus Celsius por cerca de 44 a 48 horas ou até que os vermes cheguem ao estágio L4 tardio, como confirmado visualmente sob um microscópio estéreo. Para avaliação manual do SWIP, adicione 40 microliters de solução de controle com ou sem anfetamina de 0,5 mililitro em uma placa de vidro.Sob um estereóscópio, escolha de oito a 10 vermes de estágio L4 tardios com uma picareta de cílios e submerse a picareta no poço contendo a solução até que os vermes se movam para fora da picareta e nadem para a solução. Inicie o temporizador. Observe o número de vermes lançados no poço e observe e regise o número de vermes exibindo SWIP em cada minuto marca por um total de 10 minutos.No final do procedimento, copie os dados brutos em uma planilha e calcule a porcentagem de vermes paralisados dividindo o número de vermes paralisados a cada minuto pelo número total de vermes testados ao longo do ensaio e multiplicando por 100. Copie os valores por cento em qualquer software gráfico e estatístico e plote os dados com valores percentual de SWIP no eixo y e tempo no eixo x usando o formato gráfico XY. A análise estatística entre os grupos de controle e tratamento de anfetamina e o tempo de tratamento podem ser realizadas, por exemplo, utilizando-se análises bidirecionais de ANOVA e pós-hoc.Para análise automatizada da paralisia induzida pela natação, configure a câmera, o software worm tracker e o script para executar a análise do software de rastreamento e use uma picareta de cílios para colocar um único worm L4 em um local de vidro, como mostrado anteriormente. Em seguida, grave vídeos de natação de um worm de cada vez e use o software worm tracker para calcular a frequência de dobras corporais, seguindo o script fornecido com o software de rastreamento para obter a frequência de desbaste de worm, e para gerar mapas de calor a partir dos dados de espancamento de worms. A maioria dos vermes testados na solução de controle nadam continuamente por pelo menos 10 minutos.Vermes expostos ao controle ou à anfetamina não mostram SWIP no primeiro minuto de observação. No entanto, enquanto os vermes tratados com a solução de controle continuam nadando por 10 minutos, os vermes tratados com anfetamina começam a exibir SWIP após dois minutos de tratamento. E depois de 10 minutos, 66% dos animais mostram SWIP.Aqui exemplos de mapas de calor de animais expostos ao controle ou à anfetamina são mostrados com um aumento considerável esperado na paralisia observada nos animais tratados com anfetamina. Antes de tentar este ensaio, deve-se estar bem familiarizado com a colheita e desenvolvimento de C.elegans. O envolvimento do sistema dopaminérgico no comportamento swip deve ser confirmado utilizando-se animais sem a expressão de proteínas dopaminérgicas ou pelo esgotamento de vesículas de dopamina com Reserpine.O SWIP pode ser fundamental na identificação de novas proteínas envolvidas no mecanismo de ação de medicamentos que atuam na sinápsia dopaminérgica.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Criando imagens dinâmicas de Flutuações da dopamina de curta duração com lp-ntPET: Filmes da dopamina do tabagismo

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Comportamento

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Descobrindo batida Surdez: Distúrbios Detecção de ritmo com o dedo Sincronizado Tapping e Tarefas de temporização da Percepção

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Um procedimento para Observar Renovação induzida por Contexto de pavloviano condicionado Comportamento Álcool-seeking em Ratos

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking de controle para avaliar a função cognitiva em pacientes com Esclerose Lateral Amiotrófica

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversíveis induzida pelo resfriamento desativações para estudar Cortical contribuições para a memória do obstáculo o gato ambulante

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Métodos de análise biomecânica para avaliar o desempenho Lunge dos jogadores profissionais de badminton

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Usando eletromiografia Facial para avaliar as reações do músculo Facial toque afetivo experientes e observados em seres humanos

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Um protocolo padronizado para testes de preferência para avaliar o bem-estar dos peixes

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Avaliação da função de memória em camundongos epilépticos induzidos por pilocarpina

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...