Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Доктор Осама Refai от д-р Рэнди Blakely лаборатории для руководства с автоматизированного анализа SWIP. Эта работа была поддержана финансирование из низ R01 DA042156 LC.

1. Подготовка решений и средств массовой информации
<ol><li>Подготовить M9 буфера путем растворения KH2PO4 3.0 g (22.05 мм), Na2HPO4 g 6.0 (42.2 мм) и g (85,5 мм) NaCl 5.0 в 1 Л газобетона деионизованной воды. После автоклавирования добавьте 1,0 мл 1 М MgSO4 (12 g окончательного объема газобето?...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выполнения поведенческого анализа, SWIP, в C. elegans. Этот протокол является простым и ясным с без крупных технических препятствий, сделать очень пользователя этот assay дружественные. Тем не менее есть некоторые критические аспекты, которые необх?...

Животные выполняют разнообразные врожденные и сложных поведений посредничестве различных нейромедиаторов, координируется замысловатые сигнальных процессов. Нейротрансмиттеров допамина (DA) опосредует высоко сохранены поведения различных видов, включая обучение, моторики и вознаграждение обработки.
Почвы нематоду C. elegans, с относительно простой и хорошо сопоставленных нервной системы, состоящей из всего 302 нейронов, показывает заметно сложного поведения, включая многие, которые регулируются да как спаривания, обучение, нагула, передвижения и откладки 1. среди других особенностей, короткий жизненный цикл, простота обработки и сохранения сигнальных молекул, выделить преимущества использования C. elegans как модель для изучения нейронной основе сохранившихся поведения.
Гермафродит C. elegans содержит восемь дофаминергических нейронов; Кроме того самец содержит шесть дополнительных пар для спаривания целей. Как и млекопитающие эти нейроны синтезировать да и выразить да транспортера (DAT-1), мембранный белок, найдены исключительно в дофаминергических нейронов, который перевозит Да, выпущенный в синаптическую щель обратно в дофаминергических нейронов. Кроме того большинство белков, участвующих в каждом шаге синтеза, упаковки и выпуск да высоко консервируют между червями и людей, и, как у млекопитающих, да модулирует кормления поведения и передвижения в C. elegans2.
C. elegans ползет на твердых поверхностях и плавает с характерным обмолота поведением в воде. Интересно, что мутанты, отсутствует выражение DAT-1 (dat-1) обхода обычно на твердой поверхности, но не для поддержания плавательный при погружении в воду. Это поведение был назван индуцированных плавательный паралич, или SWIP. Предыдущие эксперименты показали, что SWIP, частично вызваны избытком Да в синаптическую щель, что в конечном итоге overstimulates D2-как постсинаптических рецепторов (DOP-3). Хотя первоначально определенных в dat-1 нокаут животных3, SWIP наблюдается также в одичал тип животных, препаратами что блок деятельность DAT (например, имипрамин4) и/или побудить да выпуска (например, амфетамин,5). С другой стороны фармакологической или генетических манипуляций, предотвращения синтеза и выпуск да и блокирование DOP-3 рецепторов функция предотвращения SWIP6. Взятые вместе, эти уже опубликованных данных создали SWIP как надежный инструмент для изучения поведенческие эффекты, вызванные мутированными белков внутри дофаминергические синапсы3,4,7 и использоваться для Форвард генетических экраны для идентификации Роман регулирования пути, участвующие в DA сигнализации7,8,9,10,,1112. Кроме того путем предоставления легко количественной индикации лекарственно индуцированные поведения в живых животных, SWIP включает разъяснение механизмов действия наркотиков, как амфетамин (AMPH) и азаперон на дофаминергические синапсы5, 6 , 13 , 14 , 15.
Протоколы для выполнения анализов SWIP были описаны до16. Здесь мы подробно описать, методологии и программы установки для выполнения анализа с целью обеспечения визуального руководство для C. elegans сообщества эффективно выполнять SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Плавательный assay, указанных в настоящем Протоколе является действенным инструментом для определения белков, регулирующих дофаминергические синапсы. Подобно млекопитающих, допамин (DA) контролирует несколько функций в C. elegans , включая обучение и двигательной активности. Условия, стимулировать да выпуска (например, амфетамин (AMPH) лечения) или что предотвратить да Распродажа (например, животных, не хватает да транспортера (dat-1) которые неспособны reaccumulating Да в нейроны) генерировать избыток внеклеточного да в конечном итоге приводит в стабилизированном опорно. Это поведение особенно очевидна, когда животные плавать в воде. В самом деле хотя одичал тип животных по-прежнему плавать в течение длительного периода, dat-1 null мутантов и одичал тип относились с AMPH или ингибиторы да транспортера опускаться на дно колодца и не двигаться. Это поведение называется «Паралич индуцированных плавательный» (SWIP). Хотя SWIP assay устоявшейся, отсутствует подробное описание метода. Здесь мы опишем пошаговое руководство для выполнения SWIP. Для выполнения анализа, конце личиночной стадии-4 животных помещаются в стеклянной пластины пятно, содержащий решение управления сахарозы с или без AMPH. За их поведение плавательный, либо вручную путем визуализации под стереоскоп автоматически записи с камеры смонтированы на стереоскоп забил животных. Видео затем анализируются с помощью отслеживания программного обеспечения, которое дает визуальное представление обмолота частоты и паралич в виде тепловых карт. Ручной и автоматизированной системы гарантируют легко количественной индикации животных плавательный способности и тем самым облегчить скрининга для животных, принимая мутации в системе дофаминергической или вспомогательные генов. Кроме того SWIP может использоваться для выяснения механизма действия наркотиков например AMPH.

Мы представляем пример SWIP пробирного индуцированных AMPH лечения. Рисунок 1 показывает схематическое представление пробирного настройки, как описано выше. Для ручного анализа, около 8-10 лет, синхронизированные конце L4 стадии черви собираются с ресниц ил?...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Плавательный паралич индуцированных для оценки допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans

Плавательный вызванных паралич (SWIP) является устоявшейся поведенческих пробирного используется для изучения основных механизмов допамина сигнализации в Caenorhabditis elegans (C. elegans). Однако отсутствует подробный метод для выполнения анализа. Здесь мы опишем пошаговое протокол для SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы продемонстрировать плавание индуцированной паралич или SWIP, поведенческий анализ для оценки допамина сигнализации в C.elegans. SWIP позволяет быстро идентифицировать гены внутри или связанные с дофаминергическим синапсисом. Этот метод позволяет исследование эффектов, производимых избыток внеклеточного допамина, который вызван, например, наркотики или мутации на допамина транспортера.Для того, чтобы все черви, проверенные во время анализа плавать в течение одного и того же количества времени, животные должны быть переданы быстро в раствор. Демонстрацией процедуры будут Сириша Кудумала и Серен Сосси. Они оба работают в моей лаборатории.Чтобы создать червь стартер культур, использовать стерильный шпатель, чтобы сократить небольшие кусочки агара из пластины, содержащей хорошо кормили C.elegans и передачи агар штук в отдельных na22 E.coli пластин. После инкубации пластин при 20 градусах по Цельсию в течение трех-четырех дней, визуально подтвердить наличие gravid взрослых под стерео микроскопом. Чтобы получить синхронизированную популяцию червей, впрыскиваете воду на тарелку, полную гравидных взрослых.Аккуратно закружить пластину, чтобы выбить червей и использовать утилизацию пипетки для передачи червей в 15 миллилитров полистирола конической трубки. Потянув червей со второй тарелки в трубку, соберите червей путем центрифугации на три моет в 15 миллилитров автоклавной воды на стирку. Вода должна казаться чистой после последней стирки.После последней центрифугации добавьте пять миллилитров свежеприготовленного гипохлорида натрия гидроксидного раствора червям и быстро перемешайте с вихрем. Инкубировать трубку на рокер, поместите каплю червя раствора на стеклянный микроскоп слайд и проверить на червь лиза под стереоскоп каждые две минуты в течение четырех-восьми минут. Когда около 70% червей были lysed и яйца были освобождены, немедленно остановитьлиз с добавлением буфера яйца.Затем центрифуга эмбрионов и туш червей четыре раза resuspending гранулы со свежим буфером яйцо между моет, чтобы удалить все оставшиеся отбеливатель. После последней стирки гранулы должны казаться белыми. Повторное производство гранул в пяти миллилитров автоматической воды и пять миллилитров 60% сахарозы, чтобы отделить эмбрионы от туш центрифугации.Удалите трубку тщательно из центрифуги после разделения градиента плотности и используйте стеклянную пипетку Pasteur для переноса трех-четырех миллилитров эмбрионов, плавающих в верхнем мениска в новую 15 миллилитровую коническую трубку. Вымойте эмбрионы три раза с автоклавной водой, чтобы удалить сахарозу, а затем три моет в буфере M9. После последней стирки инкубировать эмбрионы на шейкере на ночь в 10 миллилитров свежего буфера M9, чтобы яйца люк и остаются на стадии личинки L1.После не более чем 14 часов на шейкере, мыть личинки L1 три раза с автоклавной водой, чтобы удалить любые феромоны, выпущенные личинками и повторно личинок гранулы в один миллилитр воды. Разбавить алицит червей к соотношению от одного до 10 и добавить 1:10 микролитер падение на стеклянную горку и рассчитывать червей под стерео микроскопом. Повторите, чтобы получить среднее количество червей.Используйте пипетку, чтобы добавить достаточно капель раствора червя на комнатной температуре NA22 пластины семян примерно один раз 10 до третьего червей для культуры и оставить пластину наполовину открытой, пока капли высохнут. Затем инкубировать пластины покрыты и вверх дном при 20 градусах по Цельсию в течение 44 до 48 часов или до тех пор, пока черви достичь поздней стадии L4, как это подтверждено визуально под стерео микроскопом. Для ручной оценки SWIP добавьте 40 микролитров раствора управления с или без 0,5 миллимолярный амфетамин в стеклянную тарелку пятна.Под стереоскопом, выбрать от восьми до 10 конце L4 этапе червей с ресниц забрать и погрузить забрать в хорошо содержащие раствор, пока черви сойти забрать и плавать в раствор. Запустите таймер. Обратите внимание на количество червей, выпущенных в колодец и наблюдать и записывать количество червей выставке SWIP на каждую минуту знака в общей сложности 10 минут.В конце процедуры скопировать необработанные данные в электронную таблицу и рассчитать процент червей парализована путем деления числа червей парализована каждую минуту на общее количество червей испытания на протяжении всего анализа и умножения на 100. Копировать процентные значения в любое графинг и статистическое программное обеспечение и построения данных с процентными значениями SWIP на оси и времени на x-оси с помощью формата графика XY. Статистический анализ среди контрольных и амфетамин-обработанных групп и времени лечения может быть выполнен, например, с помощью двухпутного ANOVA и пост-специального анализа.Для автоматизированного анализа паралича, вызванного плаванием, установите камеру, программное обеспечение для отслеживания червей и скрипт для запуска анализа программного обеспечения отслеживания и использования выбора ресниц для поместить одного червя поздней стадии L4 в стеклянную пластину пятна, как показано ранее. Затем записывают плавательные видео одного червя за один раз и используют программное обеспечение трекера червя для расчета частоты изгибов тела, следуя сценарию, предоставленную программным обеспечением для отслеживания для получения частоты обмолота червя, и для создания тепловых карт из данных обмолота червя. Большинство червей, протестированных в растворе управления, плавают непрерывно в течение по крайней мере 10 минут.Черви подвергаются либо контроля или амфетамина не показывают SWIP в первую минуту наблюдения. Однако, в то время как черви, обработанные раствором контроля продолжают плавать в течение 10 минут, черви, обработанные амфетамином, начинают проявлять SWIP после двух минут лечения. И через 10 минут, 66% животных показывают SWIP.Здесь приведены примеры тепловых карт животных, подвергшихся воздействию контроля или амфетамина, с ожидаемым значительным увеличением паралича, наблюдаемого у животных, обработанных амфетамином. Прежде чем пытаться этот анализ, следует быть хорошо знакомы с сбором и развития постановки C.elegans. Участие дофаминергической системы в поведении SWIP должно быть подтверждено с помощью животных, не имеющих выражения дофаминергических белков или истощения дофаминовых пузырьков с Reserpine.SWIP может играть важную роль в выявлении новых белков, участвующих в механизме действия препаратов, действующих при дофаминергическом синапсисе.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Создание динамических изображений короткоживущих Колебания Допамин с LP-ntPET: Допамин Фильмы от курения

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Раскрытие Удара Глухота: Обнаружение Нарушения ритма с синхронизацией палец нажатие и перцептивных синхронизации задач

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Процедура Соблюдать Context-индуцированной Возобновление павловской кондиционером Алкоголь на обращении у крыс

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Экспертиза Rapid допамина Dynamics с быстрого сканирования циклической вольтамперометрии Во интраоральных Tastant администрации в Пробудитесь крыс

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking управления для оценки когнитивных функций у больных с боковой амиотрофический склероз

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Реверсивные охлаждения индуцированной деактиваций учиться корковых вклад препятствие памяти в пешеходных Cat

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Методы биомеханического анализа для оценки производительности легких профессиональных бадминтонных игроков

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Использование лица электромиография для оценки реакции лицевые мышцы для опытных и наблюдаемых аффективных Touch в организме человека

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Стандартизированный протокол для тестирования предпочтений для оценки благосостояния рыб

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Оценка функции памяти у эпилептических мышей, вызванных пилокарпинами

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...