Name: swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Osama Refai från Dr Randy Blakely's lab för vägledning med automatiserad analys av SWIP. Detta arbete stöds av medel från NIH R01 DA042156 till LC.

1. beredning av lösningar och Media
<ol><li>Förbereda M9 buffert genom att lösa upp KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM), och NaCl 5.0 g (85,5 mM) i 1 L Ånghärdad avjoniserat vatten. Tillsätt 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g i en slutlig volym av 100 mL Ånghärdad avjoniserat vatten) efter autoklavering. Blanda 100 mL av den resulterande 10 x M9 med 900 mL Ånghärdad avjoniserat vatten för att göra en 1 x lösning.</li>
	<li>För att göra ägg buffert,...

<ol>
	<li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans.">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li><li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway.">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li><li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1.">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li><li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Transporter/Syntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission.">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).</li><li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li><li>Refai, O., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+and+reversal+of+swimming-induced+paralysis+in+C.+elegans+by+the+antipsychotic+and+D2-type+dopamine+receptor+antagonist+azaperone.">Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone.</a> Neurochemistry International. , (2018).</li><li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13/ERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism.">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li><li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking.">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis.">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), 961-975 (2012).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling.">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li><li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels.">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).</li><li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans.">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li><li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans.">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li><li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel.">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li><li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine+activates+/+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel.">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li><li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis.">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li><li>L&#252;ersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress.">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li><li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+(TSP-17)+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans.">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).</li><li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter.">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li></ol>

Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att utföra en beteendevetenskaplig analys, SWIP, i C. elegans. Detta protokoll är enkel och okomplicerad med inga större tekniska hinder att göra denna analys mycket användarvänlig. Det finns dock några viktiga aspekter som måste beaktas för att effektivt utföra analysen.
Försiktighet bör iakttas så att de maskar som används för analysen är välgödd, eftersom dietrestriktioner påverkar SWIP17. Skon...

Djur utför en mängd medfödda och komplexa beteenden som förmedlas av olika signalsubstanser samordnas av intrikata signalering processer. Signalsubstansen dopamin (DA) förmedlar mycket beteenden mellan arter, learning, motorik och belöning bearbetning.
Jord Nematoden C. elegans, med en relativt enkel och väl mappad nervsystemet som består av endast 302 nervceller, visar markant komplexa beteenden, inklusive många som regleras av DA såsom parning, lärande, födosökande, locomotion och äggläggning 1. bland andra funktioner, kort livslängd, enkel hantering och bevarande av signalmolekyler, lyfta fram fördelarna med att använda C. elegans som en modell för att studera personlighetens grund i bevarade beteenden.
Hermafroditt C. elegans innehåller åtta dopaminerga neuroner; Utöver dessa innehåller manlign sex extra par för parning ändamål. Precis som däggdjur, dessa nervceller syntetisera DA och express DA transportören (DAT-1), ett membranprotein som hittade uteslutande i dopaminerga neuron, som transporterar DA släppt i den synaptiska spalten tillbaka till dopaminerga nervceller. Dessutom de flesta av proteinerna som är involverade i varje steg i syntesen, förpackningar och frisättning av DA bevaras mycket mellan maskar och människor och som hos däggdjur, DA modulerar utfodring beteenden och förflyttning i C. elegans2.
C. elegans kryper på fasta ytor och simmar med en karakteristisk thrashing beteende i vatten. Intressant, mutanter saknas uttryck för DAT-1 (dat-1) krypa normalt på fast yta men misslyckas med att upprätthålla simning när nedsänkt i vatten. Detta beteende kallades simning inducerad förlamning eller SWIP. Tidigare experiment visat att SWIP, delvis orsakas av ett överskott av DA i den synaptiska spalten som slutligen overstimulates D2-liknande postsynaptiska receptorer (DOP-3). Även om ursprungligen identifierat i dat-1 knockout djur3, SWIP är också observerats i vilda djur som behandlats med läkemedel som blockerar aktiviteten av DAT (t.ex. imipramin4) och/eller inducera DA release (t.ex. amfetamin5). Däremot, hindra farmakologisk eller genetiska manipulationer avvärja syntes och frisättning av DA och blockering DOP-3 receptor funktion SWIP6. Sammantaget har dessa redan publicerade data etablerat SWIP som ett pålitligt verktyg att studera de beteendemässiga effekter som orsakas av muterade proteiner inom dopaminerga synapser3,4,7 och anställas för framåt genetiska skärmar för identifiering av nya rättsliga vägar inblandade i DA signalering7,8,9,10,11,12. Dessutom, genom att tillhandahålla ett enkelt mätbara avläsning av läkemedelsinducerad beteende i levande djur, SWIP möjliggör förtydligandet av verkningsmekanismer av droger som amfetamin (AMPH) och azaperon på dopaminerga synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoll för att utföra SWIP analyserna har beskrivits före16. Här, beskriver vi i detalj metodik och setup för att utföra analysen med målet att ge en visuell guide för C. elegans gemenskapen att effektivt utföra SWIP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:992px;" width="991">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:260px;">Reynolds wrap</td>
			<td style="width:267px;">1091835</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Amphetamine</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">51-63-8&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacterial Incubator</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:267px;">M1352-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacteriological grade, Agar</td>
			<td style="width:260px;">Lab Scientific, Inc</td>
			<td>&#160;A466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Bacto (TM) Peptone</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td>REF 211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Camera&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:267px;">U-CMAD3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Eppendorf 5810R 15amp</td>
			<td style="width:267px;">E215059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">57-88-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Deionised water</td>
			<td style="width:260px;">Millipore</td>
			<td style="width:267px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Milli-Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Depression glass spot plate</td>
			<td style="width:260px;">Corning</td>
			<td style="width:267px;">Corning, Inc. 722085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">4103-0250PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Eye lash</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Glass slide</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Graphing and statistical software</td>
			<td style="width:260px;">Prism</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Graphpad 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">HEPES</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=H3375 &#38; H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Hypochlorite</td>
			<td style="width:260px;">Hawkins</td>
			<td style="width:267px;">Sodium Hypochlorite 4-6%, USP&#34; 1 gal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium Chloride (Hexahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=M0250</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnesium sulfate (heptahydrate)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Magnetic stir bar</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">16-800-510&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:260px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:267px;">69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">NA 22 bacteria</td>
			<td style="width:260px;">CGC</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Nystatin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">1400-61-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Osmometer</td>
			<td style="width:260px;">Advanced Instruments, Inc</td>
			<td style="width:267px;">Model 3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:260px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:267px;">13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Petriplates</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Orion VersaStar Pro</td>
			<td style="width:267px;">IS-68X591202-B 0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Polystrine conical tubes</td>
			<td style="width:260px;">Falcon</td>
			<td style="width:267px;">352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:267px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - DIBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Potassium Phosphate - MONOBASIC</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:267px;">10ml=89130-898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Shaker</td>
			<td style="width:260px;">Reliable Scientific</td>
			<td>55S 12x16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td>RB=BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sodium dihydrogen Phosphate</td>
			<td style="width:260px;">Fisher</td>
			<td style="width:267px;">RB=S381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Spreadsheet</td>
			<td style="width:260px;">MS office</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td>Microsoft Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Stereo Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Zeiss</td>
			<td style="width:267px;">Model tlb3. 1 stemi2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile Pipette tips</td>
			<td style="width:260px;">Various</td>
			<td style="width:267px;">02-707-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sucrose</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:267px;">RB=S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Superglue</td>
			<td style="width:260px;">Loctite</td>
			<td style="width:267px;">1647358 .14 oz.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">SwimR sofware</td>
			<td style="width:260px;">10.18129/B9.bioc.SwimR</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:295px;">Tracker 2</td>
			<td style="width:260px;">Worm Tracker 2.0</td>
			<td style="width:267px;">www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Video recording software</td>
			<td>Virtualdub</td>
			<td style="width:267px;">http://www.virtualdub.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swimming induced paralysis to assess dopamine signaling in caenorhabditis elegans

Den simning-analysen som beskrivs i detta protokoll är ett giltigt verktyg för att identifiera proteiner som reglerar dopaminerga synapser. Liknar däggdjur, dopamin (DA) styr flera funktioner i C. elegans inklusive lärande och motorisk aktivitet. Villkor som stimulerar DA release (t.ex. amfetamin (AMPH) behandlingar) eller att hindra DA clearance (t.ex. djur saknar DA transportören (dat-1) som är oförmögna att reaccumulating DA in i nervceller) generera ett överskott av extracellulära DA i slutändan leder till hämmad locomotion. Detta är särskilt tydligt när djur simma i vatten. I själva verket medan vildtyp djur fortsätter att simma under en längre period, dat-1 null mutanter och vildtyp behandlas med AMPH eller hämmare av DA transportören sjunka till botten av brunnen och inte flytta. Detta beteende kallas ”simning inducerad förlamning” (SWIP). Även om SWIP analysen är väl etablerad, saknas en detaljerad beskrivning av metoden. Här beskriver vi en steg för steg guide för att utföra SWIP. För att utföra analysen, placerats sena larval arrangerar-4 djuren i en spot glasplatta som innehåller kontroll sackaroslösning med eller utan AMPH. Djur är gjorde för deras simning beteende antingen manuellt eller genom visualisering under ett Stereoskop automatiskt genom inspelning med en kamera monterad på Stereoskop. Videor analyseras sedan med en spårningsprogramvara, som ger en visuell representation av thrashing frekvens och förlamning i form av värmekartor. Både manuella och automatiserade system garanterar en enkelt mätbara avläsning av djurens simkunnighet och därmed underlätta screening för djur som försetts med mutationer inom det dopaminerga systemet eller extra gener. SWIP kan dessutom användas för att belysa verkningsmekanismen av missbruksdroger såsom AMPH.

Vi presenterar ett exempel på SWIP assay induceras av AMPH behandling. Figur 1 visar en schematisk representation av assay setup som beskrivs ovan. För den manuella assay, ca 8-10 år synkroniserade sena L4 scenen maskar samlas med en ögonfrans eller platina plocka och placeras i en spot glasplatta fylld med 40 µL 200 mOsm/L sackaros (kontrollösning) eller sackaros med 0,5 mM AMPH och testat för SWIP.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

Watch this Scientific Journal Video about Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Simning inducerad förlamning att bedöma dopamin signalering i Caenorhabditis elegans

Simning inducerad förlamning (SWIP) är en väletablerad beteendevetenskaplig analys används för att studera bakomliggande mekanismer av dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dock saknas en detaljerad metod för att utföra analysen. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för SWIP.

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att visa Simning-inducerad förlamning eller SWIP, en beteendeanalys för att bedöma dopamin signalering i C.elegans. SWIP möjliggör snabb identifiering av gener inom eller relaterade till den dopaminerga synapsen. Denna metod gör det möjligt att undersökningen av de effekter som produceras av ett överskott av extracellulära dopamin som orsakas till exempel av droger eller av mutationer vid dopamin transportören.För att säkerställa att alla maskar som testas under analysen simmar under samma tid måste djuren snabbt överföras in i lösningen. Att demonstrera förfarandet kommer att vara Sirisha Kudumala och Serene Sossi. Båda arbetar i mitt laboratorium.För att ställa in mask förrätt kulturer, använd en steril spatel för att skära små bitar av agar från en tallrik som innehåller välmatade C.elegans och överföra agar bitar i enskilda NA22 E.coli plattor. Efter inkubering plattorna vid 20 grader Celsius i tre till fyra dagar, visuellt bekräfta förekomsten av gravid vuxna under en stereo mikroskop. För att erhålla en synkroniserad population av maskar, spruta vatten på en platta full av gravid vuxna.Snurra försiktigt plattan för att rubba maskarna och använd en destruktionspipett för att överföra maskarna till ett koniskt rör av 15 milliliter polystyren. Efter att ha dragit maskarna från en andra platta i röret, samla maskarna genom centrifugering för tre tvättar i 15 milliliter autoklaverat vatten per tvätt. Vattnet ska framträda klart efter den sista tvätten.Tillsätt efter den sista centrifugeringen fem milliliter av en nyberedda natriumhypokloridnatriumhydroxidlösning till maskarna och blanda snabbt med en virvel. Inkubera röret på en vipp, placera en droppe mask lösning på ett glas mikroskop glida och kontrollera mask lys under ett stereoskop varannan minut i fyra till åtta minuter. När omkring 70%av maskarna har lysts och äggen hade släppts, omedelbart stoppa lysen med tillsats av ägg buffert.Sedan centrifug embryon och mask kadaver fyra gånger resuspending pelleten med färskt ägg buffert mellan tvättar för att ta bort eventuella återstående blekmedel. Efter den sista tvätten ska pelleten verka vit. Resuspend pelleten i fem milliliter autoklaverat vatten och fem milliliter av 60%sackaros för att separera embryona från slaktkropparna genom centrifugering.Ta bort röret försiktigt från centrifugen efter densitetsgradientseparationen och använd en glas Pasteurpipett för att överföra tre till fyra milliliter av embryona som flyter vid övre menisken till ett nytt 15 milliliter koniskt rör. Tvätta embryona tre gånger med autoklaverat vatten för att avlägsna sackaros följt av tre tvättar i M9 buffert. Efter den sista tvätten, ruva embryon på en shaker över natten i 10 milliliter färsk M9 buffert så att äggen att kläckas och stanna kvar på L1 larvstadiet.Efter inte mer än 14 timmar på shaker, tvätta L1 larverna tre gånger med det autoklaverade vattnet för att ta bort eventuella feromoner som frigörs av larverna och återanvänd larvpelletsen i en milliliter vatten. Späd en alikvot av maskar till ett ett till 10 förhållande och tillsätt 1:10 mikroliter droppe på ett glas bild och räkna maskarna under stereomikroskop. Upprepa för att erhålla ett genomsnittligt antal maskar.Använd en pipett för att lägga till tillräckligt droppar av masklösningen på en rumstemperatur NA22-plattan för att utsäde ungefär en gånger 10 till den tredje maskar för kulturen och lämna plattan halv öppen tills dropparna torkar ut. Sedan inkubera plattan täckt och upp och ner på 20 grader Celsius i ca 44 till 48 timmar eller tills maskarna når sent L4-stadium som bekräftats visuellt under ett stereomikroskop. För manuell bedömning av SWIP, tillsätt 40 mikroliter av kontrolllösning med eller utan 0,5 millimola amfetamin i en glasfläcksplatta.Under ett stereoskop, plocka åtta till 10 sena L4 scen maskar med en ögonfrans plocka och dränka plocka i brunnen som innehåller lösningen tills maskarna flytta bort plocka och simma in i lösningen. Starta timern. Notera antalet maskar som släpps ut i brunnen och observera och registrera antalet maskar som uppvisar SWIP vid varje minut märke för totalt 10 minuter.I slutet av förfarandet, kopiera rådata i ett kalkylblad och beräkna procent av maskar förlamad genom att dela antalet maskar förlamade vid varje minut med det totala antalet maskar testas i hela analysen och multiplicera med 100. Kopiera procentvärdena i valfri grafning och statistisk programvara och rita data med procentvärden för SWIP på y-axeln och tid på x-axeln med hjälp av XY-grafformatet. Statistisk analys bland kontroll- och amfetaminbehandlade grupperna och tiden för behandlingen kan utföras, till exempel genom att använda tvåvägs ANOVA och post hoc-analys.För automatiserad analys av simning-inducerad förlamning, ställa in kameran, mask tracker programvara och skript för att köra spårningsprogram analys och använda en ögonfrans plocka för att placera en enda sent stadium L4 mask i ett glas platsplatta som visas tidigare. Spela sedan in simning videor av en mask i taget och använda masken tracker programvara för att beräkna frekvensen av kroppen böjar, efter skriptet som tillhandahålls med spårningsprogram för att få masken stryk frekvens, och att generera värme kartor från masken stryk data. De flesta av de maskar som testas i kontrolllösningen simmar kontinuerligt i minst 10 minuter.Maskar som utsätts för antingen kontroll eller amfetamin visar inte SWIP under den första observationens minut. Men medan maskar behandlas med kontrolllösningen fortsätter att simma i 10 minuter, maskar behandlas med amfetamin börjar uppvisar SWIP efter två minuters behandling. Och efter 10 minuter, 66%av djuren visar SWIP.Här visas exempel på värmekartor över djur som exponeras för kontrollen eller för amfetamin med en förväntad avsevärd ökning av förlamning som observerats hos de amfetaminbehandlade djuren. Innan man försöker denna analys, bör man vara väl förtrogen med plockning och utvecklingsmässiga iscensättning av C.elegans. Inblandning av dopaminerga systemet i SWIP beteende bör bekräftas med hjälp av djur som saknar uttrycket av dopaminerga proteiner eller genom utarmning av dopamin vesicles med Reserpine.SWIP kan vara avgörande för att identifiera nya proteiner som är involverade i verkningsmekanismen för läkemedel som verkar vid den dopaminerga synapsen.

Research

JoVE Journal

Behavior

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Creating Dynamic Images of Short-lived Dopamine Fluctuations with lp-ntPET:  Dopamine Movies of Cigarette Smoking

Skapa dynamiska bilder av kortlivat Dopamin Fluktuationer med lp-ntPET: Dopamin Filmer av cigarettrökning

We describe experimental and statistical steps for creating dopamine movies of the brain from dynamic PET data. The movies represent minute-to-minute ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

Avslöjande Vispa Dövhet: Upptäcka rytmrubbningar med Synkroniserad Finger Tapping och Perceptuella Timing Uppgifter

A set of behavioral tasks for assessing perceptual and sensorimotor timing abilities in the general population (i.e., non-musicians) is presented here ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Ett förfarande för att observera Context-inducerad Förnyelse av Pavlovian konditione Alkohol sökande beteende hos råttor

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

Undersökning av Rapid dopamin Dynamics med snabb skanning cyklisk voltammetri Under intraoral Tastant Administration i Awake råttor

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

Eye-Tracking Control to Assess Cognitive Functions in Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis

Eye-Tracking Control för att bedöma kognitiva funktioner hos patienter med amyotrofisk lateralskleros

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder with pathological involvement of upper and lower motoneurons, subsequently leading to ...

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

Reversibel kylning-inducerad avaktiveringar att studera kortikala bidrag till hinder minne i vandrande katt

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

Biomechanical Analysis Methods to Assess Professional Badminton Players' Lunge Performance

Biomekaniska analysmetoder för att bedöma professionella badminton spelares utfall prestanda

Under the condition of simulating a badminton court in the laboratory, this study used the injury mechanism model to analyze the maximal right lunge ...

Using Facial Electromyography to Assess Facial Muscle Reactions to Experienced and Observed Affective Touch in Humans

Använda Facial Elektromyografi att bedöma ansiktet muskelreaktioner erfarna och observerade affektiv beröring i människor

"Affective" touch is believed to be processed in a manner distinct from discriminatory touch and to involve activation of C-tactile (CT) afferent fibers. ...

A Standardized Protocol for Preference Testing to Assess Fish Welfare

Ett standardiserat protokoll för preferenstester för bedömning av fiskvälfärd

Animal welfare assessment techniques try to take into consideration the specific needs and wants of the animal in question. Providing enrichment (the ...

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

Bedömning av minnesfunktion i Pilocarpin-inducerade epileptiska möss

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...