Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

يتم دعم هذا العمل بالمنح التالية: "اليابانية للعلوم" والتكنولوجيا وكالة (JST) بريكورسوري للبحوث "الجنينية العلوم" والتكنولوجيا (المعزوفة) (JPMJPR15F8، اليابان)؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS)/منح مساعدات للبحث العلمي (كاكينهي) (JP18H05414، JP17H05710، JP16K07316)، مؤسسة تأكيدا. يشكر المؤلفون هاروهيكو بيتو (جامعة طوكيو) لتوفير RCaMP2 وآرثر ج. ي هوانغ وتوماس ماك هيو (CBS بتبريد) لتوفير ناقلات إف وتعليمات بشأن إعداد إف. الكتاب أيضا يود أن يشكر المحررين في "مجلة تجارب تصور" لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

النواتج بيولوجية متنوعة تبدأ بإشارات Ca2 + . Ca2 + رسول تنوعاً مما يشير إلى داخل الخلايا. تم فك التشفير Ca2 + إشارات نواتج محددة تثير سؤالاً بيولوجية أساسية، ومطلوبة من Ca2 + تقنيات التصوير لوصف تنوع Ca2 + إشارات. البروتوكول مفصلاً حاليا يتيح الكشف عن Ca2 + إشارات مميزة في غشاء البلازما و ER (رقم 3 و رقم 4) والمحلية Ca2 + ميكرودومينس داخل خلية (الشكل 4 و الشكل 5). وهذا يسهم في وصف تنوع Ca2 + الإشارات داخل الخلايا. يشير القرار الزماني من Ca2 + تحسنت أيضا باستهداف جيسيس في غشاء البلازما و ER نظراً لأنه يمكن تجنب تأثير انتشار ثلاثي الأبعاد من Ca2 + وجيسيس أنفسهم، وأن من الممكن للكشف عن اللحظة بالذات من Ca2 + تدفق أو Ca2 + الإصدار، الذي يحدث في الغشاء.
البروتوكول على بعض القيود. المستخدمين يجب أن نضع في اعتبارنا أن الإشارات التي تم الكشف عنها هي مجموع "في الوقت الراهن من Ca2 + تدفق أو الإفراج عنه" و "Ca2 + موزع خارجاً من Ca2 + المصدر الأصلي"، خاصة بالنسبة لكاليفورنيا2 + إشارات كبيرة. على سبيل المثال، على الرغم من أن يستحضر له التحفيز في خلايا هيلا Ca2 + الإفراج عن لائحة، Ca الناتجة عن اكتشاف2 + إشارات ليس فقط باستهداف ER OER-GCaMP6f ولكن أيضا بغشاء البلازما-تستهدف لك-RCaMP2 (الشكل 3). قيد آخر أن نمط الزمانية المكانية من Ca2 + إشارات قد لا تكون العامل المحدد الوحيد لإخراج Ca2 + إشارات. توزيع البروتينات المستجيب المتلقين للمعلومات (مثل Ca2 +-تعتمد مؤنزم و phosphatases) قد يكون أيضا تحديد عامل2. تماما فك Ca2 + الإشارات داخل الخلايا، تحليل سلوك إنزيم المصب، التي لم يتم تغطيتها في هذا البروتوكول، ضروري على الإطلاق.
أحد الجوانب الأكثر أهمية لنجاح Ca2 + تصوير هو اقتناء الإعداد والصورة تصوير الأوضاع، وكذلك فيما يتعلق بدراسات أخرى تعيش-التصوير. أظهرنا سابقا أن Ca2 + الردود في الخلية تعتمد اعتماداً كبيرا على مدة وشدة الإثارة وعلى شروط اكتساب صورة، بما في ذلك التعرض الوقت واكتساب التردد16. قوة الإضاءة الإثارة هو العامل الأهم، كما أنها يمكن أن تسبب السمية الخفيفة وفوتوبليتشينج من جيسيس. ينبغي أن يكون الأمثل شروط تسجيل وقت التعرض، تسجيل تواتر وكثافة الضوء الإثارة ومدة التسجيل وفقا للغرض من هذه التجربة. نحن نوصي بتقليل زمن التعرض وشدة الضوء الإثارة قدر الإمكان لتجنب فوتوبليتشينج والضيائيه للخلية. تكرار التسجيل ومدة التسجيل ينبغي أن يكون كافياً تغطية أحداث Ca2 + ارتفاع الاهتمام ولكن ينبغي أن تظل منخفضة قدر الإمكان لتجنب فوتوبليتشينج والضيائيه أيضا. نوصي بتحديد المدة وتواتر تسجيل أولاً والاستفادة المثلى من شدة الضوء وزمن التعرض حيث أن فوتوبليتشينج من جيسيس مصغراً. هناك عامل هام آخر هو مستوى جيسيس التعبير. لقد جيسيس Ca2 +-التخزين المؤقت التأثير كما هي Ca2 +-ملزم البروتينات. ولذلك، يؤدي overexpression جيسيس التخزين المؤقت من Ca2 +، الذي من الناحية الفسيولوجية اللازمة للخلايا. وينبغي تقليل مقدار التعبير جيتشي لتجنب تصوير الخلايا معربا عن كميات عالية من جيسيس. 
  وفي الختام، تشريح Ca2 + الإشارات بدقة سوبسيلولار هي واحدة من أهم الخطوات لفك التشفير Ca2 + الإشارات داخل الخلايا التي تحدد ظاهرة الإنتاج البيولوجي. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتشريح Ca2 + إشارات لوصف التنوع فيما بين هذه الإشارات. في الوقت الحاضر، هذا الأسلوب محدود للتجارب في المختبر. بيد أن يتم بالفعل استخدام GCaMP6f لك لالمجراه في Ca2 + التصوير في الفئران17وأكدت OER-GCaMP6f لرصد Ca2 + إشارات في المجراة في الخلايا العصبية الحركية مرض جنسي في ايليجانس جيم-7. ولذلك، تستهدف جيسيس في حجرة سوبسيلولار لديه القدرة على توسيع المجراة في التصوير في المستقبل، وبالتالي تمكين Ca2 + تشريح المجراة.

Ca2 + إشارات تمثل برفع Ca2 + تركيز داخل الخلايا. Ca2 + هو الرسول الثاني العالمي للخلايا حقيقية النواة. استخدام Ca2 +, خلايا تعمل عبر مسارات الإشارات داخل الخلايا المتنوعة وحمل النواتج البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، في الخلايا العصبية، الإصدار حويصلة متشابك في محطة presynaptic، التعبير الجيني في نواة، وتحريض اللدونة متشابك في بوستسينابسي ينظمها Ca2 + إشارات مميزة التحديد تنشيط المناسبة المصب الإنزيمات في المواقع الصحيحة، ومع التوقيت الدقيق1.
أنماط الزمانية المكانية محددة من Ca2 + إشارات تنشيط الإنزيمات المتلقين للمعلومات المحددة. Ca2 + إشارات يتم إنشاؤها بواسطة التنسيق بين Ca2 + مصدرين مختلفين: Ca2 + تدفق من الفضاء خارج الخلية و Ca2 + الإصدار من هيولى (ER)، الذي يخدم كمرجع مصدق Ca داخل الخلايا2 + تخزين. معنى الزمانية المكانية Ca2 + مما يشير إلى نمط للحث على وظيفة خلية محددة أيضا معتمد من قبل نانودومينس من 10-100 ميكرون Ca2 + التي تم إنشاؤها بالقرب من Ca2 + قنوات في غشاء البلازما أو ER الغشاء2. الأهم من ذلك، مصدر Ca2 + إشارات واحد من أهم العوامل المحددة للإنتاج البيولوجي المتلقين للمعلومات. في الخلايا العصبية، قد Ca2 + تدفق و Ca2 + الإفراج عن آثار عكسية على تجميع حمض غاما – أمينوبوتيريك (GABA) مستقبلات (GABAAR) عند نهايات جابايرجيك، المسؤولة عن تثبيط 3من استثارة الخلايا العصبية. Ca2 + تدفق مصحوبة بالإثارة العصبية الضخمة يؤدي إلى تشتت متشابك GABAAR الكتل، وبينما كاليفورنيا مستمرة2 + الإصدار لائحة يشجع تجميع غابا متشابكألفروبية. مجموعات أخرى كما أفاد أن ضبط اتجاه النمو والأقماع اعتماداً على المصدر من Ca2 + الإشارة: Ca2 + تدفق يدفع النفور، بينما Ca2 + الإفراج عن أدلة الجاذبية لنمو الخلايا العصبية مخروط4. ولذلك، من المهم أن نفهم تماما Ca2 + إشارات المسارات الأساسية لنواتج محددة الخلوية، تحديد مصدر Ca2 + الإشارات بوصف Ca2 + إشارات في القرار سوبسيلولار.
في هذا البروتوكول، يصف لنا Ca2 + تصوير أسلوباً تقرير Ca2 + إشارات في القرار سوبسيلولار، الذي يسمح تقدير Ca2 + إشارة المصادر (الشكل 1). Ca2 + ميكرودومينس تحت غشاء البلازما فقط بنجاح تحت مراقبة مرمزة وراثيا Ca2 + مؤشرات (جيسيس) يستهدف غشاء البلازما عن طريق إلحاق إشارة التعريب غشاء البلازما لك داخل Src كيناز إلى N-تيرميني جيسيس5. للكشف عن نمط Ca2 + إشارة قرب لائحة بأفضل دقة المكاني والزماني، مؤخرا وضعنا OER-GCaMP6f، في أي GCaMP6f6 أهداف لائحة الغشاء الخارجي، استخدام البروتين transmembrane ER. يمكن تقرير OER-GCaMP6f إحساس مرهف Ca2 + الإصدار لائحة بأفضل دقة الزمانية المكانية من GCaMP6f نونتارجيتيد التقليدية في كوس-7 خلايا7 و الخلايا HEK2938، بتجنب نشر Ca2 + وجيسيس . أكدنا أيضا أن عفوية Ca2 + الارتفاع في astrocytes هيبوكامبال مثقف عنها OER-GCaMP6f أظهرت نمطاً الزمانية المكانية مختلفة مقارنة بالتي ترصدها GCaMP6f المستهدفة لغشاء البلازما (لك-GCaMP6f)7 ،9، مما يشير إلى أن Ca2 + التصوير مع OER-GCaMP6f في تركيبة مع GCaMP6f لك يسهم في تشريح Ca2 + إشارات في القرار سوبسيلولار لتحديد مصادرها.
في الوقت الحاضر، نحن تفاصيل البروتوكول المتعلق بتشريح Ca2 + الإشارات في خلايا هيلا والعصبية-astrocyte مختلطة الثقافات مطلي على الزجاج كوفيرسليبس. Ca2 + التصوير تقنية مع جيسيس المبين هنا، لك-GCaMP6f، مستهدفة من قبل غشاء البلازما RCaMP210 (لك-RCaMP2)، وقابلة للتطبيق على كافة الخلايا التي يمكن التعبير عن هذه جيسيس OER-GCaMP6f (الشكل 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

أيون الكالسيوم (Ca2 +) هو جزيء رسول عالمي داخل الخلايا التي تحرك مسارات إشارات متعددة، مما يؤدي إلى نواتج البيولوجية المتنوعة. التنسيق بين اثنين من Ca2 + إشارة المصادر – "Ca2 + تدفق" من خارج الخلية وتخزين "Ca2 + الإصدار" من داخل الخلايا Ca2 + هيولى (ER) – يعتبر أن تكمن وراء أنماط الزمانية المتنوعة من كاليفورنيا 2 + الإشارات التي تسبب متعددة الوظائف البيولوجية في الخلايا. والغرض من هذا البروتوكول هو وصف Ca2 + تصوير أسلوب جديد يتيح الرصد من اللحظة الأولى من "Ca2 + تدفق" و "Ca2 + الإصدار". OER GCaMP6f مؤشرا وراثيا مرمزة Ca2 + (جيتشي) تتألف من GCaMP6f، التي تستهدف الغشاء الخارجي ER. ويمكن رصد OER-GCaMP6f Ca2 + الإصدار بدقة الزمانية أعلى من GCaMP6f التقليدية. جنبا إلى جنب مع جيسيس المستهدفة لغشاء البلازما، يمكن وصف الزمانية Ca2 + إشارة النقش بدقة سوبسيلولار. سوبسيلولار استهدفت Ca2 + المؤشرات الموضحة هنا، من حيث المبدأ، متاح لجميع أنواع الخلايا، حتى المجراة في التصوير ايليجانس كاينورهابديتيس الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول، إدخال Ca2 + تصوير في الخلايا من خطوط الخلايا والخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الثقافات الأولية منفصلان، ووصف إعداد الأوراق المالية المجمدة للفئران الخلايا العصبية القشرية.

وأبديت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا، وسجلت كل الإشارات في وقت واحد باستخدام تقسيم الصورة البصريات، 24 ساعة بعد تعداء (الشكل 3 ألف و 1 فيديو). الصور تم الحصول عليها في 10 هرتز-الهيستامين (له 1 ميكرومتر)، الذي يستحث Ca2 + الإصدار لائحة، أضيفت أثناء التسجيل. عند تطبيق له، زيادة كثافة إشارة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f، كما يتضح من عرض بسيودوكولور ΔF/F0، الذي يمثل التغيير من شدة الأسفار الأولى (الشكل 3B). وقورنت الدورات وقت Ca2 + الارتفاع (ΔF/F0) ذكرت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في المنطقة نفسها من الاهتمام (ROI) (الشكل 3). تم تطبيع القيم ΔF/F0 إلى قيمها الذروة لتمكين المقارنة بالطبع الوقت بين جيسيس مختلفة اثنين، التي لديها مستويات مختلفة من التعبير والتوزيعات. وأفادت كل من أجهزة الاستشعار التذبذب مثل Ca2 + ارتفاع. فحص لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f أظهرت نفس مسار الوقت Ca2 + ارتفاع في خلايا اثنين من بين أنواع الخلايا الخمس (الشكل 3، ROI 1 و 3). بيد أن Ca2 + المرتفعات تبديه لك-RCaMP2 ظلت في مستوى أعلى مقارنة بما تبديه OER-GCaMP6f (الشكل 3 جيم، دوروا 2 و 4 و 5). وتبين النتائج أن أمده Ca2 + الارتفاع محيط غشاء البلازما، في حين أنه يتم إنهاؤها في وقت سابق حول لائحة، الذي هو مصدر هذا Ca2 + إشارة الناجمين عن طريق تحفيز له.
Ca عفوية2 + إشارات من أستروسيتيس في الخلايا العصبية-astrocyte مختلطة الثقافة من الفئران هيبوكامبي (الشكل 4A) وكورتيكسيس (الشكل 4) عرضت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f (الشكل 4، فيديو 2، 3 فيديو ، و الفيديو 4و الفيديو 5). تم أحياء الثقافات القشرية من الأسهم المجمدة التي تم إعدادها كما هو مبين في هذا البروتوكول. وسجلت إشارات لك--RCaMP2 و OER GCaMP6f تسلسلياً في 2 هرتز من نفس الخلايا. واختيرت رويس ثلاثة في المنطقة التي أظهر Ca2 + ارتفاع بكل جيتشي، وغيرت مجرى الزمن ΔF/وقاعدة (أي، شدة الأسفار) من الأسفار متوسط الكثافة أثناء فترة تسجيل كامل (وقاعدة ). عندما fluorescence الأساس مستقر و Ca2 + المرتفعات أقل تواترا، وقاعدة يصبح أساس مفيدة للكشف عن أحداث Ca2 + الارتفاع. عفوية Ca2 + المرتفعات كانت مرئية فقط في عملية أستروسيتيك، وليس في نص الخلية. هذه النتيجة غير متسقة مع التقارير السابقة بشأن أستروسيتيك Ca2 + إشارات عفوية جيسيس في المختبر تصور13 و المجراة في14أخرى. في astrocytes هيبوكامبال والقشرية على حد سواء، Ca2 + المرتفعات تبديه لك-RCaMP2 (أعلى) كانت أكثر تواترا مما أبداه OER-GCaMP6f. هذه النتيجة تتسق مع المظاهرة السابقة لدينا أن Ca2 + المرتفعات في أستروسيتيس بسبب GCaMP6f لك تم الكشف عن أكثر من تلك التي تعزى إلى OER-GCaMP6f7 ويوحي بأن هذا المفهوم ينطبق أيضا على مستوى خلية واحدة.
شوهدت عفوية Ca2 + المرتفعات التي GCaMP6f لك في الفئران غير ناضجة هيبوكامبال الخلايا العصبية (الدرجة 10) في 2 هرتز (الشكل 5 ألف و 6 فيديو). دورات الزمن ΔF/F0 في خمسة رويس مختلفة تشير إلى أن هذه Ca2 + المرتفعات تنحصر محلياً في المجالات سوبسيلولار. الشكل 5B ويبين (7 فيديو) Ca2 + الردود في الخلايا العصبية هيبوكامبال الماوس ناضجة (30 DIV) مصاب بناقلات إف OER-GCaMP6f-التعبير. وقد حفز الخلايا العصبية مع 100 ميكرومتر دهبج، وهو مؤثر على مستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك، الذي يحفز Ca2 + الإصدار. تم الكشف عن دهبج الناجمة عن Ca2 + الإصدار سبب OER-GCaMP6f.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> رقم 1: رسم تخطيطي يوضح جيسيس المستهدفة للغشاء. الرسم التخطيطي جيسيس المستهدفة لغشاء البلازما (GCaMP6f لك ولك-RCaMP2) والخارجي ER غشاء المستهدفة GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> رقم 2: مخطط انسيابي لإعداد الخلية هيبوكامبال والقشرية وتعداء بلازميد العدوى إف. الصور المجهرية الممثل، طازجة مطلي DIV-6 القشرية الخلايا (يسار) وإحياء الخلايا من الأوراق المالية المجمدة (يمين). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> الشكل 3: مثال على تصوير المتزامنة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا. (أ) التمثيل التخطيطي لفصل الإشارات مع البصريات تقسيم الصورة. ومن المتوقع في نفس الوقت نفس الحقل من عرض لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f على الكاميرا. تسجيل ممثل المكتسبة في 10 هرتز بكاميرا CMOS يتم توفيرها في الفيديو 1، ويظهر إطار واحد لهذا التسجيل في الفريق A (يمين). (ب) الصور الملونة الزائفة من ΔF/F0 لك-GCaMP2 (أعلى) و OER-GCaMP6f (أسفل). الهيستامين (له, 1 ميكرومتر) أضيف في الممثل (ج) س. 0 مسار تطبيع ΔF/F0 الوقت لك-GCaMP2 (أرجواني) و OER-GCaMP6f (أخضر). تم تطبيع البيانات إلى الحد الأقصى للقيمة ΔF/F0 لكل قطعة. وتشير الأشرطة الرمادية إلى توقيت طلبه. تم تحليل البيانات مع برامج مصنوعة خصيصا منضدة تي15. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (صورة مجهرية).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> الشكل 4: عفوية Ca2 + الارتفاع في أستروسيتيس رصد للتعبير لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f- (أ) ممثل هيبوكامبال و astrocytes القشرية (ب) transfected مع لك-RCaMP2 (أعلى) و OER-GCaMP6f (أسفل). تم أحياء الخلايا القشرية من الثقافات الأرصدة المجمدة. RCaMP2 لك والصور OER GCaMP6f اقتنى تسلسلياً في نفس الخلية، في 2 هرتز، مع كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر. المؤامرات على إظهار الأيسر دورات الزمن ΔF/فباسي تقاس رويس المشار إليه في الصورة المجهرية. تم تحليل البيانات مع منضدة منظمة الشفافية الدولية. وترد في فيديو 2، فيديو 3، فيديو 4، و 5 فيديوأفلام الفعلية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (صورة مجهرية). وتقترح الانجراف الأساس التغيرات في Ca2 + المستوى العالمي في الخلية.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> الشكل 5: أمثلة من Ca2 + تصوير في الخلايا العصبية مع GCaMP6f لك و OER-GCaMP6f- (أ) الممثل الفئران العصبية هيبوكامبال معربا عن GCaMP6f لك في 10 DIV (يسار) وقطع عرض الوقت دورات ΔF/F0 تقاس في رويس (الدوائر الصفراء) قد ذكرت في الصورة (على اليمين). الأرقام في مجرى الوقت تناظر الأرقام عائدات الاستثمار في الصورة. ملاحظة أن النمط الزمني Ca2 + الارتفاع يختلف بين مناطق مختلفة من الاهتمام. وتقترح الانجراف الأساس الزيادة في Ca2 + المستوى العالمي في هذه الخلايا العصبية. (ب) مثال على الماوس ناضجة هيبوكامبال الخلايا العصبية (DIV 30) مصاب بالتعبير OER-GCaMP6f إف ناقلات (يسار). الوقت يظهر المؤامرة بالطبع من ΔF/F0 يقاس Ca2 + الاستجابة إلى 100 ميكرومتر (RS)--3، 5-ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج) المطبقة في توقيت تظهر بشريط رمادي. الدوائر الصفراء تظهر موقف رويس حيث تم الحصول على مسار الزمن. حصلت على 2 هرتز مع كاميرا CCD تبريد (لوحة أ) أو كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر (فريق ب) الصور وتحليلها مع منضدة منظمة الشفافية الدولية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (صورة مجهرية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> الفيديو 1: مثال لتصوير المتزامنة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا. تسجيل الممثل المكتسبة في 10 هرتز، وعرضت في الشكل 3. شريط المقياس = 50 ميكرومتر.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> فيديو 2: عفوية Ca2 + عابرة لوحظت في RCaMP2 لك astrocyte هيبوكامبال- تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4A)، سجلت في نفس الحقل للعرض فيديو 3. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> الفيديو 3: عفوية Ca2 + عابرة لوحظت في OER GCaMP6f astrocyte هيبوكامبال. تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 أ)، في نفس الحقل للعرض الفيديو 2. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> الفيديو 4: عفوية Ca2 + عابرة لوحظ في RCaMP2 لك في أستروسيتي القشرية تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 باء)، سجلت في نفس الحقل من عرض الفيديو5. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> الفيديو 5: عفوية Ca2 + عابرة لوحظت في OER-GCaMP6f أستروسيتي القشرية. تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 باء)، في نفس الحقل من عرض الفيديو4. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> فيديو 6: مثال Ca2 + التصوير في الفئران هيبوكامبال خلية (الدرجة 10) التي GCaMP6f لك. مثال لكاليفورنيا العصبية2 + إشارات سجلت في 2 هرتز (الشكل 5A). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> فيديو 7: Ca2 + الإصدار في العصبية هيبوكامبال ماوس (DIV 30) معربا عن OER-GCaMP6f- المثال العصبية Ca2 + الإشارات المسجلة في خلية هيبوكامبال ماوس المصابين OER-GCaMP6f التعبير إف ناقلات (الشكل 5 (ب)). العصبية وحفز مع 100 ميكرومتر ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج) يطبق في 30 ثانية لاستحضار Ca2 + الإصدار لائحة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

وهنا يقدم بروتوكول ل Ca2 + التصوير في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، الذي يتيح لتشريح Ca2 + إشارات في القرار سوبسيلولار. هذه العملية لا تنطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن وراثيا المرمزة Ca2 + المؤشرات.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

تشريح إشارات الكالسيوم في القرار الخلوي الفرعي، هي واحدة من أهم الخطوات لفك رموز إشارات الكالسيوم داخل الخلوية التي تحدد الظاهرة البيولوجية الناتجة. يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتصوير الكالسيوم التي تمكن من رصد لحظة تدفق الكالسيوم وإطلاق الكالسيوم. هذا البروتوكول ينطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا.ونحن نعتقد أن لدينا طريقة لديها القدرة على توسيع لتشريح إشارات الكالسيوم في القرار دون الخلوية في الحيوانات الحية في ثقافة المختبر. المساعدة في إثبات الإجراء سيكون ماتسومي هيروز، وهو فني من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، ضع 18 ملليمتر قطرها غطاء زجاجي زلة في كل بئر من لوحة 12 جيدا.استخدام المياه المعقمة، وإعداد 12.5 ملليلتر من حل 0.4٪ PEI لكل 12 لوحة آبار المستخدمة. أضف ملليلتر واحد من حل PEI لكل بئر ، وتأكد من عدم وجود فقاعات تحت زلات الغطاء. احتضان على مدى الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي، استخدم جهاز الطامر لإزالة حل PEI. أضف ملليلتر واحد من المياه المعقمة إلى كل بئر واهتزز الطبق بحيث يتم غسل محلول PEI بين زلة الغطاء واللوحة جيدًا. كرر هذه العملية غسل مرتين إضافية مع المياه الطازجة معقمة.بعد الغسيل النهائي، يُشعّر الماء من كل بئر تماماً. داخل غطاء محرك السيارة، استخدم الأشعة فوق البنفسجية لتجفيف وتعقيم زلات الغطاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. يمكن تخزين الطبق المغلف PEI في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.عندما تكون جاهزة للمتابعة، تضيء الأطباق مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، قبل الاستخدام. إضافة خمسة ملليلترات من الماء المقطر العقيم في المساحة بين الآبار لمنع تبخر الوسط الثقافي. أولا، غسل الكورتيز مع المالحة الحضانة.ثم، احتضان الكورتيسيس مع تريبسين وDNAse في الملح حضانة لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. ثم، وغسل الكورتيسوس ثلاث مرات مع الملحية حضانة الجليد الباردة. إزالة عظمى وإضافة ملليلتر اثنين من طلاء المتوسطة تكملها 150 ميكرولترات من DNAse I الأسهم.افصل الخلايا عن طريق الأنابيب عشرين مرة أو أقل وتصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية مع حجم المسام من 70 ميكرومتر. بعد ذلك، قم بغسل مصفاة الخلايا بـ 20 ملليلتر من وسط الطلاء. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة ، قم بغسل الخلايا بـ 20 ملليلترًا من وسط الغسيل.تخفيف الخلايا القشرية مع متوسط الطلاء إلى كثافة 140 000 خلايا قابلة للحياة لكل ملليلتر. ثم، إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخففة إلى زلات الغطاء المغلفة PEI في لوحات ثقافة 12 جيدا. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.عندما تكون الخلايا مستقرة، من يومين إلى ثلاثة أيام بعد الطلاء، تغيير متوسطة الثقافة إلى وسط الصيانة. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة، تدور أسفل الخلية، وذلك باستخدام الدوار سوينغ إلى الطرد المركزي الخلايا في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهمي المناط وأضيفي وسط الحفظ بالتبريد، الذي يتم الاحتفاظ به عند أربع درجات مئوية، للحصول على كثافة خلايا تبلغ 10 ملايين خلية لكل ملليلتر.Aliquot ملليلتر واحد من تعليق الخلية في أنابيب المبردة. ضع الأنابيب في حاوية تجميد الخلايا بمعدل تجميد ناقص درجة مئوية واحدة في الدقيقة ، حتى يتم الوصول إلى درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. نقل حاوية التجميد إلى ثلاجة في ناقص 80 درجة مئوية.لإحياء الخلايا المجمدة، قبل الدفء وسط الغسيل وصيانة المتوسطة للخلايا القشرية المجمدة. بعد ذلك، ذوبان الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. تمييع الخلايا بلطف مع غسل ما قبل الدافئة المتوسطة والطرد المركزي مع الدوار أرجوحة في 187 مرات G لمدة ثلاث دقائق.إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من غسل المتوسطة وقياس كثافة الخلية قابلة للحياة. ثم، تمييع الخلايا مع وسيط الصيانة للخلايا القشرية المجمدة، لتحقيق كثافة الخلية من 300 000 خلية لكل ملليلتر. سيّد ملليلتر واحد من هذا تعليق خلية داخل الآبار من ال [بي]12 اغطية بئر ألواح.بالنسبة للحمّل من ثلاثة إلى ثمانية أيام بعد الطلاء، صمّن أنبوبين، أحدهما للحمض النووي بلازما والآخر لمكشف نقل الدم. إضافة 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في بئر, إلى كل أنبوب. إضافة 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما لكل زلة الغطاء وميكر واحد من الملحق يرافقه كاشف transfection للخلايا العصبية، في بئر إلى أنبوب الحمض النووي البلازما.لTrans-transfection من Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f, مزيج 0.5 ميكروغرام من كل بلازميد وميكر واحد من الملحق في 50 ميكرولترات من متوسطة المصل خفضت في البئر. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من كاشف transfection في بئر إلى أنبوب كاشف transfection. دوامة كلا الأنابيب لمدة ثانية إلى ثانيتين.ثم، إضافة خليط كاشف transfection إلى خليط الحمض النووي. ماصة بلطف لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تحميل هذا الخليط على الخلايا بطريقة قطرة الحكيمة.احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم التعبير عن البروتينات علامة. مزيج L و O لجعل عدوى AAC. إضافة ثلاثة microliters من AAC في البئر إلى ثقافة الخلايا العصبية المختلطة استروسييت.صخرة بلطف الطبق لخلط. الحفاظ على الثقافة لمدة أسبوع إلى أسبوعين حتى يتم التعبير عن GECIs. قم أولاً بتركيب زلة الغلاف التي تحتوي على الخلايا التي تحتوي على الخلايا العابرة مع Lck-RCaMP2 و OER-CaMPG6f في غرفة التسجيل للمجهر.أضف 400 ميكرولترات من وسط التصوير وضع غطاء على أعلى الغرفة. اختر مجموعة المرشح لGCaMP6f ومصدر الضوء. تحديد موقع الخلايا الفلكية التعبير عن OER-GCaMP6f.بعد ذلك، اختر مجموعة مرشح ومصدر ضوء لRCaMP2 وتأكد ما إذا كان يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 في نفس الخلايا الفلكية. سجل الصور الفاصل الزمني لـ Lck-RCaMP2 في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. بعد ذلك، تغيير عامل التصفية تعيين إلى ذلك لGCaMP6f.سجل الصور الفاصل الزمني من OER-GCaMP6f في اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين وحفظ بيانات التصوير. في هذه الدراسة، يتم التعبير عن Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا HeLa وتم تسجيل كلتا الإشارات في وقت واحد باستخدام البصريات تقسيم الصورة، بعد 24 ساعة من نقل. عند إضافة الهستامين، زادت شدة إشارة Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.يتم مقارنة الدورات الزمنية لارتفاع أيونات الكالسيوم التي أبلغ عنها Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في نفس المناطق ذات الاهتمام. كل أجهزة الاستشعار تقرير التذبذب مثل ارتفاع أيون الكالسيوم. وكلاهما يظهر نفس الوقت في اثنين من الخلايا الخمس التي تم فحصها.ومع ذلك، فإن ارتفاعات أيونات الكالسيوم التي تظهرها Lck-RCaMP2 تبقى عند مستوى أعلى من OER-GCaMP6f في الخلايا الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن ارتفاع أيونات الكالسيوم يطول في محيط غشاء البلازما ، في حين يتم إنهاؤه في وقت سابق حول ER ، وهو مصدر هذه الإشارة أيون الكالسيوم الناجمة عن تحفيز الهستامين. إشارات أيونات الكالسيوم العفوية من الخلايا الفلكية في الثقافة المختلطة الخلايا العصبية الفلكية من فرس النهر والكورتيكات الفئران تظهر من قبل Lck-RCaMP2 و OER-GCaMP6f.ارتفاعات أيونات الكالسيوم التلقائية مرئية فقط في العملية الفلكية، وليس في جسم الخلية الذي يتفق مع التقارير السابقة. وينظر إلى الارتفاعات التلقائية أيون الكالسيوم من قبل Lck-GCaMP6f في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران غير ناضجة في اثنين من هيرتز. وتشير الدورات الزمنية لخمس مناطق مختلفة ذات أهمية إلى أن هذه المرتفعات محصورة محلياً في المجالات الفرعية الخلوية.الخلايا العصبية فرس النهر الماوس ناضجة المصابة مع OER-GCaMP6f-التعبير AAV النواقل تظهر استجابات أيون الكالسيوم استجابة لإضافة DHPG. بالنسبة لتصوير الكالسيوم، فإن قوة التهيّم هي العامل الأكثر أهمية. يرجى الحفاظ على ضوء الإثارة منخفضة قدر الإمكان لتجنب تبييض الصور وسامية الصورة.مصدر إشارات الكالسيوم يمكن أن يؤكد كذلك من قبل Pomakorzi باستخدام مثبطات محددة للقنوات الكالسيوم. وكان فك رموز إشارات الكالسيوم لاستحضار مخرجات محددة مسألة بيولوجية أساسية. هذه تقنية تصوير الكالسيوم تمهد الطريق لوصف تنوع إشارات الكالسيوم داخل الخلوية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

التصوير الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في الجسم المخطط النجمية من الفئران الكبار باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

جيل من التذبذبات CA1 γ المحلية من خلال تحفيز كزازي

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا<sup&gt; 2+</sup&gt; في المسنين الحصين الخلايا العصبية

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...