Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af de følgende tilskud: Japan videnskab og teknologi agentur (JSO) / Precursory forskning i embryonale videnskab og teknologi (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) / tilskud i støtte til videnskabelig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Forfatterne takke Haruhiko Bito (University of Tokyo) for at give RCaMP2 og Arthur J.Y. Huang og Thomas McHugh (RIKEN CBS) for at give AAV vektorer og instruktioner vedrørende AAV forberedelse. Forfatterne vil også gerne takke redaktionen på tidsskriftet af visualiseret eksperimenter for deres hjælp med video filme og redigere.

Alle forsøg beskrives her blev godkendt af den RIKEN sikkerhed og animalske eksperiment udvalg, ifølge retningslinjen udstedt af det japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi.
1. forberedelse af celler
<ol><li>Forberedelse af poly (ethyleneimine)-coatede coverslips Bemærk: Poly(ethyleneimine) (PEI) belægning anbefales til glas-apparater, da det giver mulighed for neuroner og astrocytter kan stramt vedhæftes coverslips uden at forhindre deres udvikling. Men andre coating metoder (fx poly-ornithin, poly L-lysin, laminin belægning) er også tilgængelige, hvis det er nødvendigt, for glas-bund retter.<ol>
<li>Placer en 18 mm-diameter glas coverslip i hver brønd med en 12-godt plade. Forberede 0,04% PEI løsning (12,5 mL/12-godt plade) ved hjælp af steriliseret vand.</li>
		<li>Tilsættes 1 mL 0,04% PEI til hver brønd. Sikre, at der er ingen bobler nedenunder i coverslips.</li>
		<li>Inkuber plader i en CO2 inkubator natten over ved 37 ° C.</li>
		<li>Den næste dag, vaske det overtrukne coverslips 3 x med 1 mL steriliseret vand. Fjerne PEI løsning med en betjent sug, tilsættes 1 mL steriliseret vand til hver brønd og ryste den 12-godt plade så at PEI løsning mellem coverslip og pladen kan vaskes grundigt. Som den resterende PEI er giftigt for celler, sikre at vandet efter den sidste vask er indsugning helt.</li>
		<li>Tørre og sterilisere coverslips inde i hætten med ultraviolet (UV) lys i mindst 15 min. PEI-belagt fadet kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder. Belyse retter med UV-lys for 15 min lige før brug.</li>
		<li>Der tilsættes 5 mL sterilt destilleret vand i mellemrummet mellem brøndene at forhindre fordampning af næringssubstratet.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating cellelinjer Bemærk: Denne protokol giver blot ét eksempel Transfektion i celler fra pattedyr cellelinjer, såsom HeLa celler og COS-7 celler. Brugere kan anvende andre Transfektion protokoller, der er optimeret til deres eksperimenter. I dette afsnit vil vi beskrive HeLa celle kultur protokol, der også gælder for COS-7 celler.<ol>
<li>Dagen før Transfektion kultur celler i en 10 cm kultur parabol indtil de nå op på 70 – 90% sammenløb.</li>
		<li>Prewarm næringssubstratet (Se Tabel af materialer) til 37 ° C.</li>
		<li>Vaske celler 2 x med fosfatbufferet saltopløsning uden Ca2 + og Mg2 + (PBS [–]).</li>
		<li>Opsug PBS(-), tilsættes 1 mL 0,5% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA) opløsning og inkuberes celler ved 37 ° C til 90 s indtil de opnå en rund form.</li>
		<li>Tilføje 9 mL af forvarmet næringssubstratet at stoppe trypsinization. Fortynd celler med dyrkningsmedium med et forhold på 1:6.</li>
		<li>Frø 1 mL af de fortyndede celler på PEI-belagt coverslips i 12-godt plader.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af hippocampus neuron-astrocyte blandet kultur fra rotter eller mus Bemærk: Afsnit 1.3 og 1.4 skal først gennemgås og godkendes af en institutionel dyrs pleje og bruge udvalget og skal følge officielt godkendte procedurer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Flowchart af neuronal kultur-protokollen er vist i figur 2.<ol>
<li>Forberede alle reagenser under laminar flow hætte. Sted Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) til to 100 mm kultur retter (ca 20 mL/parabol), som er i en frost.</li>
		<li>Forberede 50 mL af dissektion medium består af DMEM og 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) (Se Tabel af materialer) og substratet i tre 60 mm kultur retter (ca 7 mL/parabol) og otte 35 mm kultur retter (ca 2 mL/parabol). Placer retterne i en anden frost.</li>
		<li>Forberede 50 mL af inkubation saltvand, sammensat af Hanks' afbalanceret saltopløsning suppleret med 20 mM HEPES (Se Tabel af materialer), og Placer 8 mL saltvand i en 15 mL konisk slange på is.</li>
		<li>Forberede plating medium med minimum afgørende medium (MEM) suppleres med B-27, Glutamin og penicillin-streptomycin (Se Tabel af materialer). Opretholde dette medium ved stuetemperatur (20-28 ° C).</li>
		<li>Sterilisere de kirurgiske instrumenter med 70% ethanol.</li>
		<li>Placer et stykke køkkenrulle i en glaskrukke med låg og 1 mL af isofluran. Lad isofluran fordampe for 1 min.</li>
		<li>Placer en gravid rotte eller mus i krukken tilberedt efter trin 1.3.6 og holde dyret i krukken, indtil det er dybt bedøvede (ca. 30 s til 1 min).</li>
		<li>Tage de bedøvede dyr ud af krukken og desinficere dyret og dissektion udstyr ved at sprøjte dem med 70% ethanol. Skære den ventrale midterlinjen med standard dissekere saks og pincet og udtrække livmoderen fra gravid rotte eller mus.</li>
		<li>Uddrag E18 – 19 embryoner fra livmoderen af en bedøvede kvindelig rotte eller mus, ved hjælp af sarte dissekere saks, og placere uddraget embryoerne med en ring pincet i iskolde DMEM i en 10 cm parabol for kolde anæstesi.</li>
		<li>Hug hovedet af fosteret med fine dissektion saks og placere hovedet i iskolde DMEM i en 10 cm parabol.</li>
		<li>Ekstrakt hjernen fra hvert foster med en 13 cm buet Semken pincet og pincet med fine tips. Hold hjernen i det iskolde dissektion medium i en 60 mm parabol.</li>
		<li>Fjern hippocampi, ved hjælp af to pincet med fine tips, i det iskolde dissektion medium i 35 mm retter og opretholde den isolerede væv i inkubation saltvand placeret i en 15 mL konisk slange på is.</li>
		<li>Vask hippocampi med inkubation saltvand og inkuberes med trypsin (1,25 mg/mL) og DNase jeg (0,25 mg/mL) i inkubation saltvand i 5 min ved 37 ° C. Den anbefalede inkubation volumen er 2,7 mL inkubation saltvand, 150 µL af 20 x stock trypsin og 150 µL af 20 x stock DNase (Se Tabel af materialer).</li>
		<li>Vask hippocampi 3 x med iskold inkubation saltvand.</li>
		<li>Opsug inkubation saltvand og tilsættes 1 mL af plating medium indeholdende DNase jeg (10 µL af stamopløsningen; Se Tabel af materialer). Suspendere væv af pipettering ikke mere end 20 x og måle tætheden af levedygtige celler, ved hjælp af en celle counter og Trypan blå assay.</li>
		<li>Fortynd hippocampus cellerne til en tæthed af 1,4 x 105 levedygtige celler/mL for rotter og 2,5 x 105 levedygtige celler/mL for mus. Seed 1 mL af de fortyndede celle suspensioner på PEI-belagt coverslips i 12-og kultur plader.</li>
		<li>Vedligeholde celler ved 37 ° C i en CO2-inkubator for 2-3 dage.</li>
		<li>Fjerne plating medium. Lad ikke cellerne tørre ud. Forsigtigt og hurtigt tilføje forvarmet vedligeholdelse medium (Se Tabel af materialer).</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af rotte kortikale neuron-astrocyte blandet kultur og frosne celler og genoplivning af frosne kulturer Bemærk: En kryopræservering metode for kortikale celler blev beskrevet previously11. Her tilbydes en modificeret protokol, hvori kortikale celler kan opbevares ved-80 ° C i mindst 3 måneder. Rutediagram for denne protokol er vist i figur 2.<ol>
<li>Forbered DMEM, dissektion medium, inkubation saltvand og plating medium som angivet i trin 1.3.1–1.3.4 og Tabel af materialer.</li>
		<li>Forberede vask medium udgøres af DMEM, varme-inaktiverede føtal bovint serum og penicillin-streptomycin (Se Tabel af materialer), hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Uddrag E18 – 19 embryoner fra livmoderen af en bedøvede kvindelig rotte eller mus, ved hjælp af sarte dissektion saks, og brug ring pincet til at placere hver udpakkede embryo i iskold DMEM for kolde anæstesi.</li>
		<li>Fjerne hjerner fra embryoner og holde dem i iskoldt dissektion medium. Fjerne cortexes og fastholde dem i inkubation saltvand placeret i en 15 mL konisk slange på is.</li>
		<li>Vask cortexes med inkubation saltvand og inkuberes cortexes med trypsin (1,25 mg/mL) og DNase jeg (0,25 mg/mL) i inkubation saltvand i 5 min ved 37 ° C. Den anbefalede inkubation volumen for 12 cortexes er 5,4 mL inkubation saltvand, 300 µL af 20 x stock trypsin og 300 µL af 20 x stock DNase jeg.</li>
		<li>Vask cortexes 3 x med iskold inkubation saltvand.</li>
		<li>Fjern supernatanten og tilsæt 2 mL af plating medium suppleret med 150 µL af DNase lager. Adskille cellerne af pipettering mindre end 20 slag, og filtrere celler ved hjælp af en celle filter med en porestørrelse på 70 µm.</li>
		<li>Vask celle si med 20 mL af plating medium for plating. Forberedelsen af frosne celle stock vaske cellerne med 20 mL af vask-medium (Se Tabel af materialer)</li>
		<li>Måle tætheden af de levedygtige celler, ved hjælp af en celle counter og metoden Trypan blå.</li>
		<li>Fortynd de kortikale celler til en tæthed af 1,4 x 105 levedygtige celler/mL med plating medium og tilsættes 1 mL fortyndet cellesuspension til PEI-belagt coverslips i 12-og kultur plader.</li>
		<li>Vedligeholde celler ved 37 ° C i en CO2 inkubator for 2-3 dage og ændre næringssubstratet til vedligeholdelse medium.</li>
		<li>Efter trin 1.4.9, forberede frosne kortikale celle bestanden ved centrifugering celler ved 187 x g i 3 min, ved hjælp af en swing rotor.</li>
		<li>Opsug supernatanten og tilføje kryopræservering medium (Se Tabel af materialer) opbevares ved 4 ° C, til at opnå en celle tæthed af 1 x 107 celler/mL. Alikvot 1 mL cellesuspension til kryogene rør.</li>
		<li>Sted rør i en celle, frysning beholder med en indefrysning-1 ° C/min., indtil en temperatur på-80 ° C er nået, og overføre de frysende container til en-80 ° C fryser. Cellerne kan opbevares i mindst 3 måneder ved-80 ° C.</li>
		<li>For at genoplive frosne celler, prewarm vask medium (ca. 13 mL for hver kryogene tube) og vedligeholdelse medium for frosne kortikale celler (Se Tabel af materialer).</li>
		<li>Optø frosne celler hurtigt ved 37 ° C i et vandbad.</li>
		<li>Fortynd de optøede celler forsigtigt med forvarmet vask medium. Der centrifugeres celler ved 187 x g i 3 min, ved hjælp af en swing rotor.</li>
		<li>Suspendere pellet i 1 mL af vask medium og måle levedygtige celle tæthed.</li>
		<li>Fortynd celler med vedligeholdelse medium for frosne kortikale celler til at give en celle tæthed af 3.0 x 105 levedygtige celler/mL, og frø 1 mL cellesuspension i PEI-belagt 12-godt plader.</li>
	</ol></li>
</ol>2. angivelse af membran-målrettet GECIs
<ol><li>
Transfektion af celler
	<ol>
<li>Tilføje 250 ng af GECI plasmid (dvs Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 eller OER-GCaMP6f med CMV promotor)7,8,9 til 100 µL af den reducerede serum medium (Se Tabel af materialer) pr. brønd. For cotransfection af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, brug 250 ng af hver plasmid i 100 µL af reducerede serum medium i hver brønd.</li>
		<li>Tilsæt 0,5 µL af Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) pr. brønd i plasmid-reduceret serum medium blandingen. For cotransfection af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, tilføje 0,5 µL af Transfektion reagens pr. brønd.</li>
		<li>Inkuber blanding i 30 min. ved stuetemperatur (20-28 ° C).</li>
		<li>Tilføje 100 µL af blandingen til hver coverslip på en drop-wise måde.</li>
		<li>Inkuber celler i 48-72 timer i en CO2 inkubator ved 37 ° C at give udtryk for GECIs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfektion og adeno-associeret virusinfektion af hippocampus eller kortikale neuroner Bemærk: Transfektion for 3-5 dage in vitro (DIV) resulterer i en højere Transfektion til neuroner. Transfektion på 6 – 8 DIV foretrækkes for den optimale udtryk for GECIs i astrocytter. For udtryk for GECIs i dissocierede kultur neuroner efter 9 DIV giver infektion af adeno-associeret virus (AAV) vektorer et bedre udtryk effektivitet. AAV vektorer for udtryk af Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i EF1a initiativtagerne var forberedt som beskrevet tidligere, ved hjælp af HEK293 celler12 (Se Tabel af materialer).<ol>
<li>For Transfektion 3 – 8 dage efter plating, etiketten to rør, et plasmid DNA og den anden for Transfektion reagens.</li>
		<li>Tilsæt 50 µL af reducerede serum medium (Se Tabel af materialer) pr. brønd til hver tube.</li>
		<li>Tilføje 0,5 µg af plasmid DNA pr. coverslip og 1 µL af supplement ledsaget af Transfektion reagens til neuroner (Se Tabel af materialer) pr. brønd til plasmid DNA tube. For cotransfection af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f er 0,5 µg for hver plasmid og 1 µL af tillægget blandet i 50 µL af reducerede serum medium pr. brønd.</li>
		<li>Tilføj 1 µL af Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) pr. brønd i Transfektion reagens tube. Det samme beløb af Transfektion reagens bruges til cotransfection.</li>
		<li>Vortex begge rør for 1 – 2 s.</li>
		<li>Tilføje Transfektion reagens blandingen (fra trin 2.2.4) til DNA blandingen (fra trin 2.2.3). Mix af pipettering forsigtigt og inkuberes blanding (100 µL pr. coverslip) i 5 min ved stuetemperatur.</li>
		<li>Indlæse denne blanding på cellerne i en drop-wise måde.</li>
		<li>Inkuber celler i en CO2 inkubator i 2-3 dage indtil markør proteiner er udtrykt.</li>
		<li>AAV infektion, tilføje AAV 3 µL pr. brønd til blandet neuron-astrocyte kultur. Bland forsigtigt af vuggende fadet. For den dobbelt infektion af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, er 3 µL af hver AAV indført pr. brønd. I tilfælde af antallet af celler, der udtrykker GECIs er utilstrækkelig, bør optimal AAV for infektion fastsættes.</li>
		<li>Opretholde kulturen for 1-2 uger indtil GECIs udtrykkes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ca2 + Imaging
<ol><li>
Samtidige billeddannelse af celler, der udtrykker Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f Bemærk: Samtidig registrere Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f-signaler, billede-deling optik er påkrævet. Optikken aktiverer adskillelse af RCaMP2 og GCaMP6f og deres projektion på samme fotografisk rammen af kamera (figur 3A). Samtidige imaging også kræver (1) lyskilder, der kan samtidig udsender excitations lys i blå (450 – 490 nm) og grønne (500 – 560 nm) spektre, (2) dobbelt-sporgruppe filter og dichroic spejl sæt i mikroskop, og (3) emissioner filtre til RCaMP2 og GCaMP6f. For detaljer, henvises til Tabel af materialer.<ol>
<li>Tænd for billeddiagnostiske enheder og computere mindst 30 min. før optagelsen. Prewarm mikroskopet varme kammer til 37 ° C. Opsætning af billede-deling enhed, filtre og lyskilde. Justere den image-opdeling optik, så den samme synsfelt vises på kameraet. Vælg den passende mål linse (Se Tabel af materialer).</li>
		<li>Mount coverslip med cellerne transfekteret med Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i optagelse kammer, tilføje relevante billeddiagnostiske medium eller buffer (400 µL til 18 mm coverslips) i salen, og placere den på stadiet mikroskop. Læg et låg på optagelse herhen for at undgå fordampning af mediet.</li>
		<li>Finde de celler, der udtrykker både Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f af fluorescerende billeddannelse. Minimere excitation lysintensitet for at forhindre photobleaching og fototoksicitet.</li>
		<li>Fjern låget og starte en time-lapse optagelse på 10 Hz. Under denne optagelse, skal du føje agonist herhen for at fremmane Ca2 + svar (fx histamin for HeLa celler, ATP for COS-7 celler).</li>
		<li>Gemme dataene i time-lapse i skrap disk drive (HDD).</li>
		<li>Analysere data ved hjælp af billede analyse software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optagelse spontane aktiviteter i astrocytter udtrykker Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f Bemærk: Uden billede-opdeling optik, kan Ca2 + signaler på plasma membran og dem omkring på Skadestuen overvåges i den samme celle. Her, er sekventiel indspilning af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i de samme astrocytter beskrevet. Objektivt oliebestan med en numerisk blænde større end 1,3 er stærkt anbefales til spontan Ca2 + aktivitet.<ol>
<li>Tænde mikroskopet, kamera, lyskilde og mikroskop varme kammer mindst 30 min før optagelse.</li>
		<li>Montere de coverslip, der indeholder de celler, der transfekteret med Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i salen, optagelse og tilføje 400 µL af den billeddiagnostiske medium. Læg låg på toppen af salen.</li>
		<li>Vælg filteret for GCaMP6f og lyskilden (blåt excitations lys, fx 470– 490 nm; Se Tabel af materialer). Find astrocytter udtrykker OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Vælg et filtersæt og lyskilden til RCaMP2 (grøn excitations lys, f.eks., 510-560 nm, se Tabel af materialer) og bekræfte om Lck-RCaMP2 er udtrykt i de samme astrocytter. Undgå lange eksponering for lyskilde til at forhindre photobleaching.</li>
		<li>Optag time-lapse billeder af Lck-RCaMP2 på 2 Hz for 2 min. Gem de billeddiagnostiske data på harddisken.</li>
		<li>Ændre filteret sat til, for GCaMP6f. Optag time-lapse billeder af OER-GCaMP6f i samme synsfelt på 2 Hz for 2 min. gemme data på harddisken.</li>
		<li>Analysere data ved hjælp af billede analyse software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optagelse spontan neuronal aktivitet og induceret Ca2 + elevation i neuroner Bemærk: Mikroskop opsætningen af neuronal imaging er de samme som beskrevet i afsnit 3.2. Her, er billeddannelse af spontan Ca2 + elevation på grund af Lck-GCaMP6f og Ca2 + elevation induceret af mGluR aktivering på grund af OER-GCaMP6f beskrevet.<ol>
<li>Du kan optage spontane neuronal aktivitet, montere den coverslip, der indeholder de celler, der udtrykker Lck-GCaMP6f i salen, optagelse og tilføje 400 µL af imaging medium. Læg låg på toppen af salen.</li>
		<li>Sæt filteret og lyskilde (blå excitation, fx 470-790 nm; Se Tabel af materialer) som for GCaMP6f. Find neuroner udtrykker Lck-GCaMP6f og viser spontan aktivitet.</li>
		<li>Erhverve billeder på 2 Hz eller hurtigere. Gemme data på harddisken.</li>
		<li>Analysere data ved hjælp af billede analyse software.</li>
		<li>Hvis du vil optage induceret Ca2 + elevation, montere den coverslips, der indeholder de celler, der udtrykker OER-GCaMP6f med 400 µL imaging medium. Læg låg på toppen af salen.</li>
		<li>Brug filteret sat til GCaMP6f, finde neuroner udtrykker OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Fjerne låget. Start den time-lapse optage på 2 Hz eller hurtigere. Under optagelsen, tilføje agonister for en Gq-protein-koblet receptor (f.eks. mGluR5 agonist [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) til at fremkalde en Ca2 + udgivelse fra Skadestuen.</li>
		<li>Gem de time-lapse billeder på HDD og analysere dataene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Forskellige biologiske udgange er initieret af Ca2 + signaler. Ca2 + er en alsidig intracellulær signalering messenger. Afkodning af Ca2 + signaler til at fremkalde bestemte udgange har været et grundlæggende biologiske spørgsmål, og Ca2 + Billeddannende teknikker til at beskrive mangfoldigheden af Ca2 + signaler er påkrævet. I øjeblikket detaljerede protokollen giver mulighed for påvisning af særskilte Ca2 + signaler på plasma membran og ER (figur 3 og figur 4) og lokale Ca2 + microdomains inde i en celle (figur 4 og figur 5). Dette bidrager til at beskrive mangfoldigheden af intracellulære Ca2 + signaler. Den tidsmæssige opløsning af Ca2 + -signaler var også forbedres ved at målrette GECIs i plasma membran og ER, fordi det kan undgå effekten af en tre-dimensionel diffusion af Ca2 + og GECIs sig selv, og det har potentiale til at afsløre den øjeblik af Ca2 + tilstrømning eller Ca2 + udgivelse, som opstår på membranen.
Protokollen har nogle begrænsninger. Brugernes burde holde inde indre at de fundne signaler er summen af "øjeblikket af Ca2 + tilstrømning eller release" og "Ca2 + spredt ud fra den oprindelige Ca2 + kilde", især for store Ca2 + signaler. For eksempel, selv om hans stimulation i HeLa celler fremkalder Ca frigive2 + fra Skadestuen, dens resulterende Ca2 + -signaler registreres ikke kun ER målrettet OER-GCaMP6f, men også plasma-membran-målrettet Lck-RCaMP2 (figur 3). En anden begrænsning er, at det spatiotemporelle mønster af Ca2 + signaler ikke kan være den eneste afgørende faktor af produktionen af Ca2 + signaler. Fordelingen af downstream effektor proteiner (såsom Ca2 +-afhængige kinaser og fosfataser) kan også være en bestemmelse af faktor2. For at helt afkode de intracellulære Ca2 + signaler, er analyse af downstream enzym adfærd, som ikke er dækket i denne protokol, absolut nødvendigt.
En af de mest kritiske aspekter for vellykket Ca2 + imaging er tænkelig setup og image erhvervelse betingelser, såvel som for andre live imaging studier. Tidligere viste vi, at Ca2 + reaktioner i cellen er stærkt afhængig af varigheden og intensiteten af excitation og image erhvervelse betingelser, herunder eksponering tid og erhvervelse frekvens16. Excitation belysning magt er den mest kritiske faktor, da det kan forårsage lys toksicitet og photobleaching af GECIs. Optagelse betingelserne for eksponeringstid, optagelse frekvens, excitations lys intensitet og varighed af optagelse skal optimeres ifølge Formålet med forsøget. Vi anbefaler, at reducere eksponeringstiden og excitation lysintensitet så vidt muligt at undgå photobleaching og fototoksicitet til cellen. Optagelse hyppighed og varighed af optagelse skal være tilstrækkelig til at dække Ca2 + elevation begivenhederne af interesse, men bør holdes så lavt som muligt for at undgå photobleaching og fototoksicitet også. Vi anbefaler bestemmelse optagelse frekvens og varighed først og optimere lysintensiteten og eksponeringstiden, således at photobleaching af GECIs er minimeret. En anden vigtig faktor er det udtryk for GECIs. GECIs har en Ca2 +-Bufferkapacitet virkning, som de er Ca2 +-bindende proteiner. Derfor resulterer overekspression af GECIs i buffering af Ca2 +, som er fysiologisk nødvendige for cellerne. Mængden af GECI udtryk bør minimeres for at undgå imaging celler, der udtrykker høje mængder af GECIs. 
  Afslutningsvis er dissektion af Ca2 + signaler på en subcellulært opløsning en af de vigtigste skridt for at afkode intracellulære Ca2 + signaler, der bestemmer output biologisk fænomen. Denne protokol indeholder en ny metode til dissektion af Ca2 + signaler til at beskrive mangfoldighed blandt disse signaler. Denne teknik er i øjeblikket begrænset til in vitro-eksperimenter. Men Lck-GCaMP6f bruges allerede til in vivo Ca2 + imaging i mus17, og OER-GCaMP6f blev bekræftet for at overvåge Ca2 + -signaler in vivo i VD motoriske neuroner i C. elegans7. Rettet mod GECIs i subcellulært rum har derfor potentialet til at blive udvidet til in vivo billeddannelse fremover, således gør det muligt Ca2 + dissektion in vivo.

Ca2 + signaler repræsenterer elevation af de intracellulære Ca2 + koncentration. Ca2 + er den universelle second messenger til eukaryote celler. Brug af Ca2 +, celler fungerer via diverse intracellulær signalering stier og fremkalde forskellige biologiske udgange. For eksempel i neuroner, synaptic vesikel release på den præsynaptiske terminal, genekspression i kernen, og induktion af synaptisk plasticitet på postsynapse er reguleret af særskilte Ca2 + signaler, der netop aktiverer den relevante downstream enzymer på de rigtige steder og med præcis timing1.
Specifikke spatiotemporelle mønstre af Ca2 + signaler aktivere de særlige downstream enzymer. Ca2 + -signaler er genereret af koordinering mellem to forskellige Ca2 + kilder: Ca2 + tilstrømning fra det ekstracellulære rum og Ca2 + frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum (ER), der fungerer som en intracellulær Ca2 + butik. Meningsfuld spatiotemporelle Ca2 + signaling mønsteret til at fremkalde en bestemt cellefunktion understøttes også af nanodomains for 10 – 100 µM Ca2 + genereret i nærheden af Ca2 + -kanaler på plasma membran eller ER membran2. Vigtigere, er kilde af Ca2 + signaler en af de mest kritiske faktorer, der bestemmer den downstream biologiske output. I neuroner har Ca2 + tilstrømning og Ca2 + release modsatte virkninger på klynger af gamma - aminosmørsyre (GABA)A receptorer (GABAAR) på GABAergic synapser, som er ansvarlig for hæmning af neuronal ophidselse3. Ca2 + tilstrømning ledsages af massive neuronal excitation inducerer spredningen af synaptic GABAAR klynger, der henviser til, at vedvarende Ca2 + frigive fra Skadestuen fremmer klynger af synaptic GABAARs. Andre grupper har også rapporteret at tuning retning af vækst kegler er kritisk afhængige kilde af Ca2 + signal: Ca2 + tilstrømning inducerer frastødning, mens Ca2 + release guider tiltrækning af neuronal væksten kegle4. Fuldt ud at forstå den Ca2 + signalering veje underliggende specifikke cellulære udgange, er det derfor vigtigt at identificere kilden af Ca2 + signaler ved at beskrive Ca2 + signaler på subcellulært opløsning.
I denne protokol beskriver vi en Ca2 + billedbehandling metode for at rapportere Ca2 + signaler på subcellulært opløsning, der giver mulighed for vurdering af Ca2 + signalkilder (figur 1). Ca2 + microdomains lige under plasmamembran bliver korrekt overvåget af genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) rettet til plasma-membran via udlæg i plasma membran-lokalisering signal Lck i Src kinase til N-termini GECIs5. For at registrere Ca2 + signal mønster i nærheden på Skadestuen med en bedre rumlige og tidsmæssige opløsning, udviklet vi for nylig OER-GCaMP6f, i hvilke GCaMP6f6 mål på Skadestuen ydre membran, ved hjælp af ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan nænsomt rapport Ca2 + release fra Skadestuen på en bedre spatiotemporelle opløsning end konventionelle disse GCaMP6f i COS-7 celler7 og HEK293 celler8, ved at undgå udbredelse af Ca2 + og GECIs . Vi bekræftede også, at den spontane Ca2 + elevation i kulturperler hippocampus astrocytter rapporteret af OER-GCaMP6f viste et andet spatiotemporelle mønster i forhold til, overvåges af plasma membran-målrettet GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, der angiver, at Ca2 + imaging med OER-GCaMP6f i kombination med Lck-GCaMP6f bidrager til dissektion af Ca2 + signaler på subcellulært beslutningen om at identificere deres kilder.
I øjeblikket, detalje vi protokol for Ca2 + signal dissektion i HeLa celler og neuron-astrocyte blandede kulturer belagt på glas coverslips. Ca2 + imaging teknik med GECIs angivet her, Lck-GCaMP6f, plasma-membran-målrettet RCaMP210 (Lck-RCaMP2), og OER-GCaMP6f (figur 1) er gældende for alle celler, hvor disse GECIs kan udtrykkes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Calcium ion (Ca2 +) er en universel intracellulære messenger molekyle, der driver flere signaling veje, fører til forskellige biologiske udgange. Koordinering af to Ca2 + signalkilder — "Ca2 + tilstrømning" fra uden for cellen og "Ca2 + release" fra de intracellulære Ca2 + gemme endoplasmatiske reticulum (ER) — anses for at ligge til grund for de forskellige spatio-temporale mønstre af Ca 2 + signaler, der forårsager flere biologiske funktioner i celler. Formålet med denne protokol er at beskrive en ny Ca2 + billedbehandling metode, der muliggør overvågning af det øjeblik "Ca2 + tilstrømning" og "Ca2 + release". OER-GCaMP6f er en genetisk kodet Ca2 + -indikator (GECI) bestående af GCaMP6f, som er målrettet til den ER ydre membran. OER-GCaMP6f kan overvåge Ca2 + release på en højere tidsmæssige opløsning end konventionelle GCaMP6f. Kombineret med plasma membran-målrettet GECIs, kan spatio-temporale Ca2 + signal mønster beskrives ved en subcellulært opløsning. De subcellulært målrettet Ca2 + indikatorer beskrevet her, principielt tilgængelig for alle celletyper, selv for in vivo billeddannelse Caenorhabditis elegans neuroner. I denne protokol, vi indfører Ca2 + imaging i celler fra cellelinjer, neuroner og gliaceller i dissocierede primære kulturer, og beskrive forberedelse af frosne bestanden af rotte kortikale neuroner.

Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f var udtrykt i HeLa celler, og begge signaler blev optaget samtidigt ved hjælp af billede-opdeling optik, 24 h efter Transfektion (figur 3A og Video 1). Billederne blev erhvervet ved 10 Hz. histamin (hans, 1 µM), som inducerer Ca2 + release fra Skadestuen, blev tilføjet under optagelsen. På begæring af hans steg signal intensiteten af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, som det fremgår af visningen pseudocolor af ΔF/F0, som repræsenterer ændringen fra den oprindelige fluorescens intensitet (figur 3B). Tidsforløbet af Ca2 + elevation (ΔF/F0) rapporteret af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f blev sammenlignet i samme region af interesse (ROI) (figur 3 c). ΔF/F0 værdier var normaliseret deres peak værdier hen til muliggøre tid kurset sammenligningen mellem de to forskellige GECIs, som har forskellige udtryk niveauer og distributioner. Begge sensorer rapporterede en svingning-lignende Ca2 + højde. Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f viste den samme tid kursus for Ca2 + elevation i to celler blandt fem celletyper undersøgt (figur 3 c, ROI 1 og 3). Men Ca2 + stigninger vist af Lck-RCaMP2 forblev på et højere niveau i forhold til at vist af OER-GCaMP6f (figur 3 C, ROI 2, 4 og 5). Resultaterne viser, at Ca2 + elevation er forlænget i plasma membranen, mens det afsluttes tidligere rundt på Skadestuen, som er kilden til denne Ca2 + signal induceret af hans stimulation.
Spontan Ca2 + -signaler fra astrocytter i neuron-astrocyte blandet kultur fra rotte hippocampi (figur 4A) og cortexes (figur 4B) var vist af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f (fig. 4, Video 2, Video 3 , 4, og Video 5). Kortikale kulturer blev genoplivet fra den frosne lager, der blev udarbejdet som beskrevet i denne protokol. Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f-signaler var sekventielt optaget på 2 Hz fra de samme celler. Tre ROIs var valgt i området, der viste Ca2 + elevation af hver GECI, og tidsforløb af ΔF/Fbase (dvs., fluorescens-intensiteten) ændret fra gennemsnitlige fluorescens-intensiteten i hele optagelsen periode (Fbase ). Når baseline Fluorescens er stabil og Ca2 + stigninger er mindre hyppige, bliver Fbase en nyttig baseline til at opdage Ca2 + elevation begivenheder. Spontan Ca2 + stigninger var synlige kun på astrocytic processen, ikke på cellen kroppen. Dette resultat er i overensstemmelse med de tidligere betænkninger om astrocytic spontan Ca2 + signaler af andre GECIs visualiseret in vitro-13 og in vivo14. I både hippocampus og kortikale astrocytter blev Ca2 + stigninger vist af Lck-RCaMP2 (top) hyppigere end dem, der vises af OER-GCaMP6f. Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere demonstration at Ca2 + stigninger i astrocytter på grund af Lck-GCaMP6f oftere blev opdaget end dem på grund af OER-GCaMP6f7 og tyder på, at dette også er gældende på den encellede niveau.
Spontan Ca2 + højder af Lck-GCaMP6f i umodne rotte hippocampus neuroner (10 DIV) blev set på 2 Hz (figur 5A og Video 6). Tidsforløbet af ΔF/F0 i fem forskellige ROIs tyder på, at disse Ca2 + stigninger er lokalt begrænset til de subcellulært domæner. Figur 5B (Video 7) viser de Ca2 + svar i ældre mus hippocampus neuroner (30 DIV) inficeret med OER GCaMP6f udtryk AAV vektorer. Neuroner blev stimuleret med 100 µM DHPG, som er agonist for metabotropic glutamat receptorer, inducerende Ca2 + release. DHPG-induceret Ca2 + udgivelse på grund af OER-GCaMP6f blev fundet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figur 1: Diagram, der viser membran-målrettet GECIs. Skematisk diagram over plasmamembran-målrettet GECIs (Lck-GCaMP6f og Lck-RCaMP2) og ydre ER membran-målrettet GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figur 2: Flowchart for hippocampus og kortikale celle forberedelse, plasmid Transfektion og AAV infektion. De mikroskopiske billeder er repræsentative, frisk forgyldt DIV-6 kortikale celler (venstre) og genoplivet celler fra frosne lager (til højre). Skalalinjen = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figur 3: eksempel på den samtidige billeddannelse af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa celler. (A) skematisk gengivelse af signal separation med billede-opdeling optik. Den samme synsfelt for Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f ventes samtidig på kameraet. En repræsentativ optagelse erhvervet ved 10 Hz ved en CMOS kamera er fastsat i Video 1, og en ramme på denne indspilning er vist i panelet A (til højre). (B) pseudo farvebilleder af ΔF/F0 til Lck-GCaMP2 (øverst) og OER-GCaMP6f (nederst). Histamin (hans, 1 µM) blev tilføjet på 0 s. (C) repræsentant normaliserede ΔF/F0 tidsforløb Lck-GCaMP2 (magenta) og OER-GCaMP6f (grøn). Data blev normaliseret til den maksimale ΔF/F0-værdi for hvert enkelt observationsområde. De grå bjælker angiver timingen af hans ansøgning. Data blev analyseret med en skræddersyet software TI Workbench15. Skalalinjen = 50 µm (mikroskopisk billede).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figur 4: Spontan Ca2 + elevation i astrocytter overvåges for udtryk, Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f. (A) repræsentant hippocampus og (B) kortikale astrocytter transfekteret med Lck-RCaMP2 (øverst) og OER-GCaMP6f (nederst). Kortikale celler blev genoplivet fra frosne stock kulturer. Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f billeder er sekventielt anskaffet i samme celle, ved 2 Hz, med en EM-CCD kamera. Parceller på venstre viser tidsforløbet af ΔF/Fbase målt i ROIs fremgår det mikroskopiske billede. Data blev analyseret med TI Workbench. Faktiske film leveres i Video 2, Video 3, Video 4og Video 5. Skalalinjen = 20 µm (mikroskopisk billede). Baseline drift foreslår ændringer i de globale Ca2 + niveau i cellen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figur 5: Eksempler på Ca2 + imaging i neuroner med Lck-GCaMP6f og OER-GCaMP6f. (A) repræsentative rotte hippocampus neuroner udtrykker Lck-GCaMP6f på DIV 10 (venstre) og plots viser tiden kurser af ΔF/F0 målt i ROIs (gule cirkler) er blevet angivet i billedet (til højre). Tallene i tid kurset svarer til ROI tallene i billedet. Bemærk, at den tidsmæssige mønster af Ca2 + elevation er forskellige mellem de forskellige regioner af interesse. Baseline drift foreslår stigningen i den globale Ca2 + niveau i dette neuron. (B) et eksempel på modne mus hippocampus neuroner (DIV 30) inficeret med OER-GCaMP6f udtryk AAV vektorer (venstre). Den tid kurset plot af ΔF/F0 målt viser Ca2 + svar til 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) anvendes på timingen vist af den grå linje. Gule cirkler viser placeringen af ROIs hvor kurset tid blev opnået. Billederne blev erhvervet ved 2 Hz med et afkølet CCD kamera (panel A) eller en EM-CCD kamera (panel B) og analyseres med TI Workbench. Skalalinjen = 20 µm (mikroskopisk billede). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: eksempel på samtidige billeddannelse af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa celler. Repræsentative optagelse erhvervet ved 10 Hz og præsenteret i figur 3. Skalalinjen = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontan Ca2 + forbigående observeret i Lck-RCaMP2 i hippocampus astrocyte. Repræsentative optagelse erhvervet ved 2 Hz (figur 4A), indspillet i samme synsfelt som Video 3. Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontan Ca2 + forbigående observeret i OER-GCaMP6f i en hippocampus astrocyte. Repræsentative optagelse erhvervet ved 2 Hz (figur 4A), i det samme synsfelt som Video 2. Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontan Ca2 + forbigående observeret i Lck-RCaMP2 i en kortikale astrocyte repræsentative optagelse erhvervet ved 2 Hz (figur 4B), indspillet i samme synsfelt som Video 5. Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontan Ca2 + forbigående observeret i OER-GCaMP6f i en kortikale astrocyte. Repræsentative optagelse erhvervet ved 2 Hz (figur 4B), i det samme synsfelt som Video 4. Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Eksempel på Ca2 + imaging i en rotte hippocampus neuron (DIV 10) af Lck-GCaMP6f. Eksempel på neuronal Ca2 + -signaler registreres på 2 Hz (figur 5A). Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + udgivelse i en mus hippocampus neuron (DIV 30) udtrykker OER-GCaMP6f. Eksempel på neuronal Ca2 + signaler registreres i en mus hippocampus neuron inficeret med OER-GCaMP6f udtryk AAV vektorer (figur 5B). Neuron blev stimuleret med 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) anvendes på 30 s til at fremmane Ca2 + release fra Skadestuen. Skalalinjen = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">venligst klik her for at downloade denne video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissektion af lokale Ca2 + signaler i kulturperler celler af membran-målrettet Ca2 + indikatorer

Her præsenterer vi en protokol for Ca2 + imaging i neuroner og gliaceller, som gør det muligt for dissektion af Ca2 + signaler på subcellulært opløsning. Denne proces er gældende til alle celletyper, der giver udtryk for genetisk kodet Ca2 + indikatorer.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Dissektion af Calcium signaler på en sub-cellulære opløsning, er et af de vigtigste skridt til afkodning intra-cellulære calcium signaler, der bestemmer output biologiske fænomen. Denne protokol beskriver en ny calciumbilleddannelsesmetode, der gør det muligt at overvåge selve tidspunktet for calciumtilstrømningen og frigivelsen af calcium. Denne protokol gælder for alle celletyper, der gør det muligt at udtrykke genetisk kodede calciumindikatorer.Vi mener, at vores metode har potentiale til at blive udvidet til dissektion af calcium signaler på sub-cellulære opløsning i levende dyr i lab kultur. At hjælpe med at demonstrere proceduren vil være Matsumi Hirose, en tekniker fra vores laboratorium. For at begynde denne procedure, sted 18 millimeter diameter glasdæksel slip i hver brønd af en 12 godt plade.Brug steriliseret vand, og forberede 12,5 milliliter af en 0,4% PEI løsning for hver 12 brøndplade, der anvendes. Tilføj en milliliter AF PEI-opløsningen til hver brønd, og sørg for, at der ikke er bobler under dækslet. Inkubere i løbet af natten i en kuldioxid inkubator på 37 grader Celsius.Næste dag skal du bruge en aspirator til at fjerne PEI-løsningen. Tilsæt en milliliter steriliseret vand til hver brønd og ryst pladen, så PEI-opløsningen mellem dækslet og pladen vaskes grundigt ud. Gentag denne vaskeproces yderligere to gange med frisk steriliseret vand.Efter den endelige vask, aspirere vandet fra hver brønd helt. Inde i emhætten skal du bruge et ultraviolet lys til at tørre og sterilisere dækslet glider i mindst 15 minutter. PEI-belagt skål kan opbevares ved fire grader Celsius i op til to måneder.Når du er klar til at fortsætte, belyse opvasken med ultraviolet lys i 15 minutter lige før brug. Tilsæt fem milliliter sterilt destilleret vand i rummet mellem brøndene for at forhindre fordampning af kulturmediet. Først vaskes cortices med inkubation saltvand.Derefter inkuberes cortices med Trypsin og DNAse i inkubation saltvand i fem minutter ved 37 grader Celsius. Derefter vaskes cortices tre gange med iskold inkubation saltvand. Fjern supernatant og tilsæt to milliliter plating medium suppleret med 150 mikroliter af DNAse I lager.Dissociaet cellerne ved pipettering tyve gange eller mindre og filtrere cellerne gennem en celle si med en pore størrelse på 70 mikrometer. Dernæst vaskes cellest sien med 20 milliliter af platinmediet. Til fremstilling af frosne cellelager vaskes cellerne med 20 milliliter vaskemediet.Kortikale cellerne fortyndes med plating medium til en massetæthed på 140 000 levedygtige celler pr. milliliter. Derefter tilsættes en milliliter af den fortyndede celle suspension til PEI belagtdæksel glider i de 12 godt kulturplader. Vedligehold cellerne ved 37 grader Celsius i en kuldioxid inkubator i to til tre dage.Når cellerne er stabile, to til tre dage efter plating, ændre kulturmediet til vedligeholdelsesmediet. Til fremstilling af frosne cellebestand, spin ned cellen, ved hjælp af en swing rotor til centrifuge cellerne ved 187 gange G i tre minutter. Inspirer supernatanten og tilsæt kryopræserveringsmediet, der holdes ved fire grader Celsius, for at opnå en celletæthed på 10 millioner celler pr. milliliter.Aliquot en milliliter af celle suspension i kryogene rør. Rørene anbringes i en cellefrysningsbeholder med en frysehastighed på minus en grader Celsius i minuttet, indtil en temperatur på minus 80 grader Celsius er nået. Overfør frysebeholderen til en fryser på minus 80 grader Celsius.For at genoplive de frosne celler skal vaskemediet og vedligeholdelsesmediet for frosne kortikale celler opvarmes. Dernæst tø de frosne celler hurtigt i et vandbad ved 37 grader Celsius. Cellerne fortyndes forsigtigt med forvardt vaskemedium og centrifuge med en svingrotor ved 187 gange G i tre minutter.Pelleten skal suspenderes igen i en milliliter vaskemedium, og den levedygtige celletæthed måles. Derefter fortyndes cellerne med vedligeholdelsesmediet for frosne kortikale celler for at give en celletæthed på 300 000 celler pr. milliliter. Cede en milliliter af denne celle suspension i brøndene af PEI belagt 12 brøndplader.Ved transinfektion tre til otte dage efter plettering skal der mærkes to rør, det ene for plasma-DNA og det andet for transinfektionsreagesage. Tilsæt 50 mikroliter reduceret serummedium pr. brønd til hvert rør. Der tilsættes 0,5 mikrogram plasma-DNA pr. dæksel slip og en mikroliter af supplement ledsaget af transfektion reagens til neuroner, per brønd til plasma DNA-rør.Til samtransfektion af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f blandes 0,5 mikrogram af hver plasmid og et mikrosliter til tillægget i 50 mikroliter reduceret serummedium pr. brønd. Dernæst tilsættes en mikroliter af transfektion reagens pr. brønd til transfektion reagensrøret. Vortex begge rør i et til to sekunder.Derefter tilsættes transfektion reagens blandingen til DNA-blandingen. Forsigtigt pipette til at blande og inkubere ved stuetemperatur i fem minutter. Læg denne blanding på cellerne på en dråbe-klog måde.Inkuberes i en kuldioxidinkubator i to til tre dage, indtil markørproteinerne udtrykkes. Bland L og O for at gøre AAC infektion. Tilføj tre mikroliter af AAC pr. brønd til den blandede neuron-astrocytkultur.Forsigtigt rock skålen til at blande. Vedligehold kulturen i en til to uger, indtil GECIs udtrykkes. Monter først dækslet, der indeholder cellerne transfet med Lck-RCaMP2 og OER-CaMPG6f, ind i mikroskopets optagelseskammer.Tilsæt 400 mikroliter af billeddiagnostisk medium og læg låg oven på kammeret. Vælg filtersættet for GCaMP6f og lyskilden. Find astrocytterne, der udtrykker OER-GCaMP6f.Vælg derefter et filtersæt og lyskilde til RCaMP2, og bekræft, om Lck-RCaMP2 udtrykkes i de samme astrocytter. Optag tid bortfalder billeder af Lck-RCaMP2 på to Hertz i to minutter og gemme billedbehandlingsdata. Derefter skal du ændre filteret, der er sat tilbage til filteret for GCaMP6f.Optag tidsforfald billeder af OER-GCaMP6f på to Hertz i to minutter og gemme billeddata. I denne undersøgelse udtrykkes Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa-celler, og begge signaler blev optaget samtidigt ved hjælp af billedspaltning optik, 24 timer efter transfektion. Ved tilsætning af Histamin steg signalintensiteten af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f.De tidsforløb for calciumionhøjde, der er rapporteret af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, sammenlignes i de samme interesseregioner. Begge sensorer rapporterer en oscillation-lignende calcium ion elevation. Og begge viser samme tidsforløb i to af de fem undersøgte celler.De calciumionstigninger, som Lck-RCaMP2 har vist, forbliver dog på det højere niveau end OER-GCaMP6f i de andre celler. Disse resultater viser, at calciumion elevation er forlænget i nærheden af plasmamembranen, mens det afsluttes tidligere omkring SKADESTUEN, som er kilden til denne calcium ion signal induceret af histamin stimulation. Spontane calciumionsignaler fra astrocytter i neuron-astrocytblandet kultur fra rotte hippocampi og cortices vises af Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f.Spontane calciumion stigninger er kun synlige på den astrocytiske proces, ikke på cellen kroppen, som er i overensstemmelse med tidligere rapporter. Spontane calciumion stigninger af Lck-GCaMP6f i umodne rotte hippocampal neuroner ses på to Hertz. Tidskurserne for fem forskellige interesseregioner tyder på, at disse stigninger er lokalt begrænset til de subcellulære domæner.Modne mus hippocampal neuroner inficeret med OER-GCaMP6f-udtryk AAV vektorer viser calcium ion reaktioner som reaktion på tilsætning af DHPG. For calciumbilleddannelse er excitations luminationseffekten den mest kritiske faktor. Hold ophidselseslyset så lavt som muligt for at undgå fotoblegning og fototoksicitet.Kilden til calciumsignalerne kan yderligere bekræftes af Pomakorzi ved hjælp af specifikke inhibitorer til calciumkanaler. Afkodning calcium signaler til at fremkalde specifikke output har været et grundlæggende biologisk spørgsmål. Denne calciumbilledteknik baner vejen for at beskrive mangfoldigheden af intracellulære calciumsignaler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapacitans Målinger og Ca 2 + Imaging på Single nerveterminaler i Retinal Skiver

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellulært Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Striatal Astrocyter fra voksne mus ved hjælp af genetisk kodede Calcium Indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ billeddannelse af enteriske nervesystem

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation af Lokale CA1 γ Svingninger ved tetanisk Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminescens Imaging af Subcellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampusneuroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...