Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door de volgende rechten: het Japan Science and Technology Agency (BJS) / Precursory onderzoek voor embryonale wetenschap en technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); de vereniging van Japan voor de bevordering van de wetenschap (JSPS) / verleent steun voor wetenschappelijk onderzoek (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Stichting van de Takeda. De auteurs bedanken Haruhiko Bito (Universiteit van Tokyo) voor het verstrekken van RCaMP2 en Arthur J.Y. Huang en Thomas McHugh (RIKEN CBS) voor het verstrekken van AAV vectoren en voor instructies met betrekking tot AAV voorbereiding. De auteurs ook bedank editors op de Journal of gevisualiseerd Experiments voor hun hulp bij de video filmen en bewerken.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Diverse biologische uitgangen worden geïnitieerd door Ca2 + signalen. CA2 + is een veelzijdige intracellulaire signalering boodschapper. Decodering van Ca2 + signalen te roepen bepaalde uitgangen is een fundamentele biologische vraag, en Ca2 + beeldvormende technieken voor het beschrijven van de diversiteit van Ca2 + signalen zijn vereist. De momenteel gedetailleerde protocol mogelijk maakt het opsporen van verschillende Ca2 + signalen op het plasmamembraan en ER (Figuur 3 en 4 van de figuur) en lokale Ca2 + microdomains in een cel (Figuur 4 en Figuur 5). Dit draagt bij tot het beschrijven van de diversiteit van intracellulaire Ca2 + signalen. De temporele resolutie van Ca2 + signalen ook werd verbeterd door de doelgerichtheid van GECIs in het plasmamembraan en ER, omdat het voorkomen het effect van een driedimensionale verspreiding van de Ca2 + en GECIs zelf dat kan, en het heeft de potentie om op te sporen de zeer moment van Ca2 + toestroom of Ca2 + versie, die op het membraan optreedt.
Het protocol heeft wat beperkingen. Gebruikers moeten Houd er rekening mee dat de gedetecteerde signalen de sommatie van "the moment van Ca2 + toestroom of release zijn" en "Ca2 + verspreid uit vanaf de oorspronkelijke Ca2 + bron", met name voor grote Ca2 + signalen. Bijvoorbeeld, hoewel zijn stimulering in HeLa cellen roept Ca vrijwaart2 + van de ER, de resulterende Ca2 + signalen worden ontdekt, niet alleen door ER-gerichte OER-GCaMP6f, maar ook door plasma-membraan-gerichte Lck-RCaMP2 (Figuur 3). Een andere beperking is dat het Spatio patroon van Ca2 + signalen kan niet de enige determinant van de output van Ca2 + signalen. De verdeling van de stroomafwaartse effector eiwitten (zoals Ca2 +-afhankelijke kinases en fosfatasen genaamd) kunnen ook een bepaling van de factor2. Als u wilt volledig decoderen de intracellulaire Ca2 + signalen, is analyse van downstream enzym gedrag, die niet is gedekt in dit protocol, absoluut noodzakelijk.
Een van de meest kritieke aspecten voor succesvolle Ca2 + beeldvorming is de beeldvorming setup en afbeelding overname voorwaarden, ook wat betreft andere live-imaging studies. Eerder toonden wij dat Ca2 + reacties in de cel sterk afhankelijk, zijn op de duur en intensiteit van excitatie en op afbeelding overname voorwaarden, met inbegrip van de blootstelling tijd en overname frequentie16. Excitatie verlichting kracht is de meest kritische factor, omdat het licht toxiciteit en photobleaching van GECIs kan veroorzaken. De opname-voorwaarden van belichtingstijd, opname frequentie, lage excitatie-intensiteit en duur van de opname moeten worden geoptimaliseerd volgens het doel van het experiment. Het is raadzaam om de vermindering van de blootstellingstijd en de excitatie lichtintensiteit zoveel mogelijk te vermijden photobleaching en fototoxiciteit naar de cel. De opname frequentie en de duur van de opname moeten voldoende zijn ter dekking van de Ca2 + hoogte gebeurtenissen van belang, maar moeten zo laag mogelijk te zijn en te vermijden photobleaching fototoxiciteit ook worden gehouden. Het is raadzaam om eerst bepalen van de opname frequentie en de duur en het optimaliseren van de lichtintensiteit en de blootstellingstijd zodat de photobleaching van de GECIs tot een minimum beperkt. Een andere belangrijke factor is het niveau van de expressie van de GECIs. GECIs hebben een Ca2 +-buffering effect zoals ze Ca2 zijn +-bindende eiwitten. De overexpressie van GECIs resulteert daarom in de buffer van Ca2 +, die fysiologisch noodzakelijk is voor de cellen. De hoeveelheid GECI expressie moet worden geminimaliseerd om te voorkomen dat beeldvorming cellen uiten van grote hoeveelheden GECIs. 
  Kortom, is de dissectie van Ca2 + signalen met een subcellular resolutie een van de belangrijkste stappen voor het decoderen van intracellulaire Ca2 + signalen die bepalend zijn voor de uitvoer biologisch verschijnsel. Dit protocol biedt een nieuwe methode voor de dissectie van Ca2 + signalen om te beschrijven de diversiteit onder deze signalen. Deze techniek is momenteel beperkt voor in vitro experimenten. Echter voor in vivo Ca2 + afbeeldingen in muizen17al Lck-GCaMP6f wordt gebruikt, en OER-GCaMP6f werd bevestigd voor het controleren van Ca2 + signalen in vivo in de VD motorische neuronen in C. elegans7. Daarom heeft gericht op GECIs in de subcellular compartiment het potentieel om te worden uitgebreid tot de in vivo imaging in de toekomst dus inschakelen Ca2 + dissectie in vivo.

CA2 + signalen vertegenwoordigen de verheffing van de intracellulaire Ca2 + concentratie. CA2 + is de universele second messenger voor eukaryotische cellen. Met behulp van Ca2 +, cellen functioneren via uiteenlopende intracellulaire signaalroutes en veroorzaken verschillende biologische uitgangen. Bijvoorbeeld, in neuronen, synaptic vesikel release op de presynaptische terminal, de expressie van genen in de celkern, en inductie van synaptische plasticiteit op de postsynapse worden geregeld door verschillende Ca2 + signalen die precies de juiste activeren stroomafwaarts enzymen op de juiste plaatsen en met precieze timing1.
Specifieke Spatio patronen van Ca2 + signalen activeren de specifieke downstream enzymen. CA2 + signalen worden gegenereerd door de coördinatie tussen twee verschillende Ca2 + bronnen: Ca2 + toestroom van de extracellulaire ruimte en Ca2 + vrijlating uit het endoplasmatisch reticulum (ER), die als een intracellulair Ca2 fungeert + opslaan. De zinvolle Spatio Ca2 + signalering patroon voor het opwekken van een bepaalde cel functie wordt ook ondersteund door nanodomains van 10-100 µM Ca2 + gegenereerd in de nabijheid van Ca2 + kanalen op het plasmamembraan of ER membraan2. Nog belangrijker is, is de bron van Ca2 + signalen een van de meest cruciale factoren bepalen de stroomafwaartse biologische output. Neuronen, Ca2 + toestroom en Ca2 + release tegenovergestelde effecten hebben op de clustering van gamma - aminoboterzuur (GABA)A -receptoren (GABAAR) op de GABAergic synapsen, die verantwoordelijk is voor de remming van neuronale prikkelbaarheid3. CA2 + toestroom vergezeld van massale neuronale excitatie induceert de spreiding van de synaptische GABAAR clusters, overwegende dat permanente Ca2 + die vrijkomt bij de ER bevordert de clustering van synaptic GABAARs. Andere groepen ook gemeld dat de tuning richting van groei kegels kritisch afhankelijk van de bron van de Ca2 + signaal is: Ca2 + toestroom induceert afkeer, terwijl Ca2 + release de aantrekkingskracht van de neuronale groei begeleidt kegel4. Daarom, om volledig te begrijpen de Ca2 + signalering trajecten die ten grondslag liggen aan de specifieke cellulaire uitgangen, het is belangrijk om te identificeren van de bron van Ca2 + signalen door te beschrijven van Ca2 + signalen op de subcellular resolutie.
In dit protocol beschrijven we een Ca2 + beeldvorming methode om te melden van Ca2 + signalen op de subcellular resolutie, waarmee de schatting van de Ca2 + signaalbronnen (Figuur 1). CA2 + microdomains net onder het plasmamembraan worden met succes gecontroleerd door genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) gericht op het plasma-membraan via de bijlage van het plasmamembraan-lokalisatie signaal Lck binnen Src kinase aan de N-termini GECIs5. Om te ontdekken de Ca2 + signaal patroon in de nabijheid van de ER bij een betere ruimtelijke en temporele resolutie, ontwikkeld wij onlangs OER-GCaMP6f, in welke GCaMP6f6 doelstellingen de ER buitenste membraan, met behulp van de ER transmembraan proteïne. OER-GCaMP6f kan gevoelig verslag Ca2 + vrijlating uit de ER bij een beter Spatio resolutie dan conventionele nontargeted GCaMP6f in COS-7 cellen7 en8van de cellen van HEK293, door het vermijden van de verspreiding van Ca2 + en GECIs . Wij ook bevestigd dat de spontane Ca2 + hoogte in gekweekte hippocampal astrocyten gerapporteerd door OER-GCaMP6f een ander Spatio patroon toonde ten opzichte van die gecontroleerd door plasmamembraan-gerichte GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, die aangeeft dat Ca2 + beeldbewerking met OER-GCaMP6f in combinatie met Lck-GCaMP6f bijdraagt tot de dissectie van Ca2 + signalen bij de subcellular resolutie om hun bronnen te identificeren.
Momenteel, detailleren wij het protocol voor de Ca2 + signaal dissectie in HeLa cellen en neuron-Astrocyt gemengde culturen verguld op glas coverslips. De Ca2 + beeldvormende techniek met GECIs aangegeven hier, Lck-GCaMP6f, plasma-membraan-gerichte RCaMP210 (Lck-RCaMP2), en OER-GCaMP6f (Figuur 1) zijn van toepassing op alle cellen die deze GECIs kunnen worden uitgedrukt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Calcium ion (Ca2 +) is een universele intracellulaire messenger molecule die meerdere signaalroutes drijft, wat leidt tot diverse biologische uitgangen. De coördinatie van twee Ca2 + signaalbronnen — "Ca2 + toestroom" van buiten de cel en "Ca2 + release" van de intracellulaire Ca2 + slaan endoplasmatisch reticulum (ER) — wordt beschouwd als grondslag van de uiteenlopende spatio-temporele patronen van Ca 2 + signalen die meerdere biologische functies in cellen leiden. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een nieuwe Ca2 + beeldvorming methode waarmee het toezicht op het moment van "Ca2 + toestroom" en "Ca2 + release". OER-GCaMP6f is een genetisch gecodeerde Ca2 + indicator (GECI) bestaande uit GCaMP6f, die aan de buitenmembraan ER wordt gericht. OER-GCaMP6f kunt controleren Ca2 + release op een hogere temporele resolutie dan conventionele GCaMP6f. In combinatie met plasmamembraan-gerichte GECIs, kan de spatio-temporele Ca2 + signaal patroon beschreven worden met een subcellular resolutie. De subcellular-gerichte Ca2 + indicatoren die hier worden beschreven zijn, in principe beschikbaar voor alle celtypes, zelfs voor de in vivo imaging van Caenorhabditis elegans neuronen. In dit protocol, we introduceren van Ca2 + imaging in cellen van cellijnen, zenuwcellen en gliacellen in gedissocieerde primaire culturen, en beschrijven van de voorbereiding van bevroren voorraad van rat corticale neuronen.

Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f werden uitgedrukt in HeLa cellen, en beide signalen werden geregistreerd gelijktijdig gebruik van beeld-splitsing optica, 24 uur na de transfectie (figuur 3A en Video 1). De beelden werden verworven bij 10 Hz. Histamine (zijn, 1 µM), die Ca2 + vrijlating uit de ER induceert, werd toegevoegd tijdens de opname. Op het verzoek van zijn de signaalsterkte van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toegenomen, zoals blijkt uit de weergave van de kleurcorrectie van ΔF/F0, waarmee de verandering van de oorspronkelijke fluorescentie-intensiteit (figuur 3B). Het tijdsverloop van Ca2 + hoogte (ΔF/F0) gerapporteerd door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f werden vergeleken in dezelfde regio van belang (ROI) (Figuur 3 c). De ΔF/F0 waarden zijn genormaliseerd naar hun piekwaarden om de tijd cursus vergelijking tussen de twee verschillende GECIs, die verschillende expressie niveaus en distributies hebben. Beide sensoren gemeld een trilling-achtige Ca2 + hoogte. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toonde het zelfde tijdsverloop voor Ca2 + hoogte in twee cellen onder de vijf celtypes onderzocht (Figuur 3 c, ROI 1 en 3). Ca2 + waterstand blijkt uit Lck-RCaMP2 bleef echter op een hoger niveau in vergelijking met het keuzemenu door OER-GCaMP6f (Figuur 3 C, ROI, 2, 4 en 5). De resultaten geven aan dat de Ca2 + hoogte in de nabijheid van het plasma-membraan, wordt verlengd, terwijl deze wordt beëindigd eerder rond de ER, dat is de bron van deze Ca2 + signaal geïnduceerd door zijn stimulatie.
Spontane Ca2 + signalen van astrocyten in het neuron-Astrocyt gemengde cultuur van rat hippocampi (figuur 4A) en cortexes (figuur 4B) werden getoond door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f (Figuur 4, Video 2, Video 3 , 4, en 5 Video). Corticale culturen werden nieuw leven ingeblazen uit de bevroren voorraad die opgesteld zoals beschreven in dit protocol. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f signalen waren achtereenvolgens opgenomen met 2 Hz van dezelfde cellen. Drie ROIs werden geselecteerd in het gebied dat Ca2 + hoogte toonde door elke GECI, en de tijdsverloop van ΔF/Fbasis (dat wil zeggen, de intensiteit van de fluorescentie) veranderd van de intensiteit van de fluorescentie van gemiddelde gedurende de hele opname (Fbasis ). Wanneer de basislijn fluorescentie stabiel is en Ca2 + waterstand minder frequent zijn, wordt Fbasis een nuttige basislijn tot Ca2 + hoogte gebeurtenissen te detecteren. Spontane Ca2 + waterstand waren zichtbaar alleen tijdens het astrocytic proces, niet tijdens de cel lichaam. Dit resultaat komt overeen met de eerdere verslagen over astrocytic spontane Ca2 + signalen door andere GECIs gevisualiseerde in vitro13 en in vivo14. In zowel de hippocampal als de corticale astrocyten werden Ca2 + waterstand door Lck-RCaMP2 (boven) getoond vaker dan degenen die OER-GCaMP6f getoond. Dit resultaat is in overeenstemming met onze vorige demonstratie dat Ca2 + waterstand in astrocyten als gevolg van Lck-GCaMP6f vaker geconstateerd dan die als gevolg van de OER-GCaMP6f7 en stelt voor dat dit idee is ook van toepassing op de eencellige niveau.
Spontane Ca2 + waterstand door Lck-GCaMP6f in onvolwassen rat hippocampal neuronen (10 DIV) werden gezien bij 2 Hz (figuur 5A en 6 van de Video). Het tijdsverloop van ΔF/F0 in vijf verschillende ROIs suggereren dat deze Ca2 + waterstand lokaal zijn beperkt tot de subcellular domeinen. Figuur 5B (Video 7) toont de Ca2 + antwoorden in volwassen muis hippocampal neuronen (30 DIV) geïnfecteerd met OER-GCaMP6f-expressie AAV vectoren. Neuronen werden met 100 µM DHPG, oftewel de agonist voor metabotropic glutamaat receptoren, inducerende Ca2 + release gestimuleerd. DHPG-geïnduceerde Ca2 + release als gevolg van de OER-GCaMP6f werd ontdekt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figuur 1: Diagram met membraan-gerichte GECIs. Schematisch diagram van het plasmamembraan-gerichte GECIs (Lck-GCaMP6f en Lck-RCaMP2) en buitenste ER membraan-gerichte GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figuur 2: stroomdiagram voor hippocampal en corticale cel voorbereiding, plasmide transfectie en AAV infectie. De microscopische beelden zijn vertegenwoordiger, vers vergulde DIV-6 corticale cellen (links) en nieuw leven ingeblazen cellen uit de bevroren voorraad (rechts). Schaal bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figuur 3: voorbeeld van de gelijktijdige beeldvorming van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in HeLa cellen. (A) Schematische weergave van signaal scheiding met afbeelding-splitsing optica. Het hetzelfde gezichtsveld voor Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f wordt gelijktijdig geprojecteerd op de camera. Een representatieve opname verworven bij 10 Hz met een CMOS-camera in Video 1is gegeven, en één frame van deze opname wordt weergegeven in het deelvenster A (rechts). (B) pseudo-kleurenafbeeldingen van ΔF/F0 voor Lck-GCaMP2 (boven) en OER-GCaMP6f (onder). Histamine (zijn, 1 µM) toegevoegd op 0 s. (C) vertegenwoordiger genormaliseerde ΔF/F0 tijdsverloop van Lck-GCaMP2 (magenta) en OER-GCaMP6f (groen). Gegevens waren op de maximumwaarde van de ΔF/F0 voor ieder waarnemingspunt genormaliseerd. De grijze balken geven de timing van zijn aanvraag. Gegevens zijn geanalyseerd met een op maat gemaakte software TI Workbench15. Schaal bar = 50 µm (microscopische opname).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figuur 4: Spontane Ca2 + hoogte in astrocyten gecontroleerd voor Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f expressie. De vertegenwoordiger van de (A) hippocampal en (B) corticale astrocyten transfected met Lck-RCaMP2 (boven) en OER-GCaMP6f (onder). Corticale cellen werden nieuw leven ingeblazen uit ingevroren voorraadculturen. Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f beelden werden opeenvolgend verworven in dezelfde cel, met 2 Hz, met een EM-CCD-camera. De percelen op de linker show het tijdsverloop van ΔF/Fbase in de ROIs gemeten aangegeven in de microscopische opname. Gegevens zijn geanalyseerd met TI Workbench. Werkelijke films vindt u in de Video 2, Video 3, Video 4en 5 van de Video. De schaal bar = 20 µm (microscopische opname). De basislijn drift suggereert de veranderingen in de mondiale Ca2 + niveau in de cel.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figuur 5: Voorbeelden van Ca2 + imaging in neuronen met Lck-GCaMP6f en OER-GCaMP6f. (A) representatieve rat hippocampal neuronen uiten Lck-GCaMP6f op DIV 10 (links) en de percelen met de tijd die cursussen van ΔF/F0 gemeten in de ROIs (gele cirkels) hebben al aangegeven in de afbeelding (rechts). De getallen in de tijdsverloop komen overeen met de ROI-getallen in de afbeelding. Merk op dat de tijdelijke patroon van Ca2 + hoogte tussen de verschillende regio's van belang verschilt. De basislijn drift suggereert de stijging van de mondiale Ca2 + niveau in deze neuron. (B) een voorbeeld van volwassen muis hippocampal neuronen (DIV 30) besmet met OER-GCaMP6f expressievectoren AAV (links). De tijd cursus perceel van ΔF/F0 gemeten de Ca2 + reactie op 100 µM toont (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) toegepast op de timing komt te staan door de grijze balk. Gele cirkels geven de positie van ROIs waar het tijdsverloop werd verkregen. De beelden waren verworven met 2 Hz met een gekoeld-CCD-camera (a-panel)of een EM-CCD-camera (deelvenster B) en geanalyseerd met TI Workbench. Schaal bar = 20 µm (microscopische opname). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: voorbeeld van gelijktijdige beeldvorming van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f in HeLa cellen. Representatieve opname verworven bij 10 Hz en gepresenteerd in Figuur 3. Schaal bar = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in Lck-RCaMP2 in hippocampal Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4A), opgenomen in het zelfde gezichtsveld als Video 3. Schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in OER-GCaMP6f in een hippocampal Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4A), in hetzelfde gezichtsveld van de als Video 2. Schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in Lck-RCaMP2 in een corticale Astrocyt vertegenwoordiger opname verworven met 2 Hz (figuur 4B), opgenomen in het zelfde gezichtsveld als Video 5. Schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontane Ca2 + voorbijgaande waargenomen in OER-GCaMP6f in een corticale Astrocyt. Representatieve opname verworven met 2 Hz (figuur 4B), in hetzelfde gezichtsveld van de als Video 4. De schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Voorbeeld van Ca2 + imaging in een rat hippocampal neuron (DIV 10) door Lck-GCaMP6f. Voorbeeld van neuronale Ca2 + signalen opgenomen met 2 Hz (figuur 5A). Schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + versie in een muis hippocampal neuron (DIV 30) uiting van OER-GCaMP6f. Voorbeeld van neuronale Ca2 + signalen opgenomen in een muis hippocampal neuron besmet met OER-GCaMP6f AAV expressievectoren (figuur 5B). Het neuron werd gestimuleerd met 100 µM-dihydroxyphenylglycine (DHPG) toegepast op 30 s tot Ca2 + vrijlating uit de ER oproepen. Schaal bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

De dissectie van calcium signalen op een sub-cellulaire resolutie, is een van de belangrijkste stappen voor het decoderen van intra-cellulaire calcium signalen die de output biologisch fenomeen te bepalen. Dit protocol beschrijft een nieuwe calciumbeeldvormingsmethode die het mogelijk maakt het zelfde moment van de calciuminstroom en calciumafgifte te monitoren. Dit protocol is van toepassing op alle celtypen die de expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren mogelijk maken.Wij geloven dat onze methode het potentieel heeft om uit te breiden tot de dissectie van calciumsignalen bij de subcellulaire resolutie bij levende dieren in de labcultuur. Helpen om de procedure aan te tonen zal Matsumi Hirose, een technicus uit ons laboratorium. Om te beginnen met deze procedure, plaats 18 millimeter diameter glazen deksel slip in elke put van een 12 put plaat.Gebruik gesteriliseerd water, en bereid 12,5 milliliter van een 0,4%PEI oplossing voor elke 12 put plaat wordt gebruikt. Voeg een milliliter van de PEI-oplossing toe aan elke put en zorg ervoor dat er geen bubbels onder de afdekbons zitten. Broeden 's nachts in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius.De volgende dag gebruikt u een aspirator om de PEI-oplossing te verwijderen. Voeg een milliliter gesteriliseerd water toe aan elke put en schud de plaat zodat de PEI-oplossing tussen de afdeksel en de plaat grondig wordt uitgewassen. Herhaal dit wasproces twee keer extra met vers gesteriliseerd water.Na de laatste wasbeurt, aspirate het water van elke put volledig. In de kap, gebruik een ultraviolet licht te drogen en steriliseren de cover glijdt gedurende ten minste 15 minuten. De PEI gecoate schotel kan worden opgeslagen op vier graden Celsius voor maximaal twee maanden.Wanneer u klaar bent om verder te gaan, verlicht u de gerechten met het ultraviolette licht gedurende 15 minuten, vlak voor gebruik. Voeg vijf milliliter steriel gedestilleerd water toe in de ruimte tussen de putten om verdamping van het kweekmedium te voorkomen. Eerst, was de cortices met incubatie zout.Vervolgens, incubeer de cortices met Trypsin en DNAse in incubatie zout gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Was vervolgens de cortices drie keer met ijskoude incubatie zout. Verwijder de supernatant en voeg twee milliliter beplating medium aangevuld met 150 microliter van DNAse I voorraad.Dissociate de cellen door pipetter twintig keer of minder en filter de cellen door een cel zeef met een porie grootte van 70 micrometer. Was vervolgens de celzeef met 20 milliliter van het beplatingsmedium. Voor de bereiding van bevroren celvoorraad, was de cellen met 20 milliliter van het wasmiddel.Verdun de corticale cellen met beplatingsmedium tot een dichtheid van 140 000 levensvatbare cellen per milliliter. Voeg vervolgens een milliliter van de verdunde celsuspensie toe aan de PEI gecoate afdekslips in de 12 goed kweekplaten. Houd de cellen op 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator voor twee tot drie dagen.Wanneer de cellen stabiel zijn, twee tot drie dagen na beplating, verander het kweekmedium naar het onderhoudsmedium. Voor de bereiding van bevroren celvoorraad, draai de cel af, met behulp van een schommelrotor om de cellen drie minuten op 187 keer G te centrifugeren. Aspirate de supernatant en voeg de cryopreservatie medium, gehouden op vier graden Celsius, om een celdichtheid van 10 miljoen cellen per milliliter te verkrijgen.Aliquot één milliliter van de celsuspensie in cryogene buizen. Plaats de buizen in een cel vriescontainer met een vriessnelheid van min een graad Celsius per minuut, totdat een temperatuur van min 80 graden Celsius is bereikt. Breng de vriescontainer naar een vriezer bij min 80 graden Celsius.Om de bevroren cellen te doen herleven, verwarm je het wasmedium en het onderhoudsmedium voor bevroren corticale cellen. Vervolgens ontdooien de bevroren cellen snel in een waterbad op 37 graden Celsius. Verdun de cellen voorzichtig met voorverwarmd wasmedium en centrifuge met een schommelrotor op 187 keer G gedurende drie minuten.Stel de pellet opnieuw op in één milliliter wasmiddel en meet de levensvatbare celdichtheid. Verdun vervolgens de cellen met het onderhoudsmedium voor bevroren corticale cellen, om een celdichtheid van 300 000 cellen per milliliter op te leveren. Geef een milliliter van deze cel suspensie af in de putten van de PEI gecoate 12 putplaten.Voor transfectie drie tot acht dagen na beplating, label twee buizen, een voor plasma-DNA en de andere voor de transfectie reagens. Voeg 50 microliter met verlaagd serummedium per put toe aan elke buis. Voeg 0,5 microgram plasma-DNA per cover slip en een microliter van supplement vergezeld van transfectie reagens voor neuronen, per goed aan het plasma DNA buis.Voor de co-transfectie van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, meng 0,5 microgram van elke plasmid en een microliter supplement in 50 microliter van verminderd serum medium per put. Voeg vervolgens een microliter transfectiereagensagemiddel per put toe aan de transfectiereagens. Vortex beide buizen voor een tot twee seconden.Voeg vervolgens het transfectiereagensmengsel toe aan het DNA-mengsel. Voorzichtig pipette te mengen en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Laad dit mengsel op de cellen in een druppel-wise manier.Broeden in een koolstofdioxide incubator gedurende twee tot drie dagen tot de marker eiwitten worden uitgedrukt. Meng L en O om de OC-infectie te maken. Voeg drie microliters oc per put toe aan de gemengde neuron-astrocytencultuur.Wieg de schotel voorzichtig om te mengen. Behoud de cultuur voor een tot twee weken totdat de GECI's worden uitgedrukt. Monteer eerst de afdekslip met de cellen die met Lck-RCaMP2 en OER-CaMPG6f in de opnamekamer van de microscoop worden getransfecteerd.Voeg 400 microliter van het beeldmedium toe en plaats een deksel op de kamer. Kies de filterset voor GCaMP6f en de lichtbron. Zoek de astrocyten die OER-GCaMP6f uitdrukken.Kies vervolgens een filterset en lichtbron voor RCaMP2 en bevestig of Lck-RCaMP2 in dezelfde astrocyten wordt uitgedrukt. Neem time lapse-beelden van Lck-RCaMP2 twee minuten op op twee Hertz en sla de beeldgegevens op. Wijzig hierna de filterset die terugbrengt naar die voor GCaMP6f.Neem time lapse-beelden van OER-GCaMP6f op twee Hertz gedurende twee minuten op en sla de beeldgegevens op. In deze studie worden Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f uitgedrukt in HeLa-cellen en beide signalen werden gelijktijdig geregistreerd met behulp van beeldsplitsende optica, 24 uur na transfectie. Na de toevoeging van Histamine nam de signaalintensiteit van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toe.De tijdscursussen van calciumion hoogte gerapporteerd door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f worden vergeleken in dezelfde regio's van belang. Beide sensoren rapporteren een oscillatie-achtige calciumion hoogte. En beide tonen dezelfde tijdskoers in twee van de vijf onderzochte cellen.De calciumionenverhogingen van Lck-RCaMP2 blijven echter op het hogere niveau dan OER-GCaMP6f in de andere cellen. Deze resultaten geven aan dat calciumionhoogte wordt verlengd in de nabijheid van het plasmamembraan, terwijl het eerder rond de SEH wordt beëindigd, de bron van dit calciumionsignaal dat wordt veroorzaakt door Histamine-stimulatie. Spontane calciumionsignalen van astrocyten in de neuron-astrocyten gemengde cultuur van rat hippocampi en cortices worden getoond door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f.Spontane calciumionenverhogingen zijn alleen zichtbaar bij het astrocytische proces, niet bij het cellichaam dat overeenkomt met eerdere rapporten. Spontane calciumionverhogingen door Lck-GCaMP6f in onrijpe rat hippocampal neuronen worden gezien op twee Hertz. De tijdscursussen voor vijf verschillende interessegebieden suggereren dat deze verhogingen lokaal beperkt zijn tot de subcellulaire domeinen.Volwassen muis hippocampal neuronen besmet met OER-GCaMP6f-expressie AAV vectoren tonen calcium ionen reacties in reactie op de toevoeging van DHPG. Voor calciumbeeldvorming is de excitatie luminatiekracht de meest kritische factor. Houd het excitatielampje zo laag mogelijk om fotobleeken en fototoxiciteit te voorkomen.De bron van de calciumsignalen kan verder worden bevestigd door Pomakorzi met behulp van specifieke remmers aan calciumkanalen. Het decoderen van calciumsignalen om specifieke output op te roepen is een fundamentele biologische vraag. Deze calcium imaging techniek effent de weg naar de diversiteit van intra-cellulaire calcium signalen te beschrijven.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generatie van Local CA1 γ Oscillations door Tetanische Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...