Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : la Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory recherche embryonnaire sciences et technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japon) ; la société japonaise pour la Promotion de la Science (JSPS) / subventions en aide à la recherche scientifique (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), fondation de Takeda. Les auteurs remercient Haruhiko Bito (Université de Tokyo) pour la fourniture de RCaMP2 et Arthur J.Y. Huang et Thomas McHugh (RIKEN CBS) pour la fourniture des vecteurs d’AAV et pour obtenir des instructions concernant la préparation de l’AAV. Les auteurs tiens également à remercier les éditeurs dans le Journal of Visualized Experiments pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage.

<ol>
	<li>Clapham, D. 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H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Divers produits biologiques sont initiées par des signaux de Ca2 + . Ca2 + est un messager de signalisation intracellulaire versatile. Décodage des signaux de Ca2 + pour évoquer les résultats précis a été une question biologique fondamentale, et Ca2 + techniques d’imagerie pour décrire la diversité des signaux de Ca2 + sont requis. Le protocole actuellement détaillé permet la détection de Ca2 + signaux distincts à la membrane plasmique et ER (Figure 3 et Figure 4) et de Ca2 + microdomaines locales à l’intérieur d’une cellule (Figure 4 et Figure 5). Ceci contribue à décrire la diversité des signaux intracellulaires de Ca2 + . La résolution temporelle de Ca2 + des signaux a été également améliorée en ciblant GECIs dans la membrane plasmique et ER, car elle peut éviter l’effet d’une diffusion en trois dimensions du Ca2 + et GECIs eux-mêmes, et il a le potentiel pour détecter la moment même de l’influx de Ca2 + ou libération Ca2 + , ce qui se produit sur la membrane.
Le protocole a quelques limitations. Utilisateurs doivent garder à l’esprit que les signaux détectés sont la sommation du « moment d’influx de Ca2 + ou release » et « Ca2 + diffusé sur de l’origine de Ca2 + », surtout pour les signaux de grande Ca2 + . Par exemple, bien que sa stimulation dans les cellules HeLa évoque Ca2 + la libération de l’ER, sa résultante Ca2 + signaux sont détectées non seulement par rel-GCaMP6f ER ciblées, mais aussi par plasma membrane ciblées Lck-RCaMP2 (Figure 3). Une autre limitation est que la configuration spatio-temporelle des signaux2 + Ca peut être pas le seul déterminant de la production de signaux de Ca2 + . La distribution des protéines effectrices en aval (par exemple Ca2 +-dependent kinases et phosphatases) peut également être un facteur déterminant en2. Pour complètement décoder les signaux intracellulaires de Ca2 + , analyse du comportement de l’enzyme en aval, qui n’est pas couvert par le présent protocole, est absolument nécessaire.
Un des aspects plus critiques pour l’imagerie réussie de Ca2 + est l’acquisition d’imagerie de configuration et de l’image, aussi bien les conditions en ce qui concerne les autres études d’imagerie en direct. Nous avons montré précédemment que les réponses du Ca2 + dans la cellule sont fortement dépendantes sur la durée et l’intensité de l’excitation et image acquisition conditions, y compris l’exposition temps et acquisition de fréquence16. Puissance d’éclairage excitation est le facteur le plus critique, car il peut causer légère toxicité et Photoblanchiment de GECIs. Les conditions d’enregistrement des temps d’exposition, fréquence, intensité lumineuse excitation et la durée d’enregistrement d’enregistrement doivent être optimisées selon le but de l’expérience. Il est recommandé de réduire la durée d’exposition et de l’intensité lumineuse excitation autant que possible afin d’éviter le Photoblanchiment et phototoxicité à la cellule. La fréquence de l’enregistrement et la durée de l’enregistrement devraient être suffisants pour couvrir les événements d’intérêt Ca2 + altitude mais doivent être maintenus aussi basses que possible afin d’éviter le Photoblanchiment et phototoxicité également. Nous vous recommandons déterminant la fréquence de l’enregistrement et la durée d’abord et d’optimiser l’intensité lumineuse et la durée d’exposition, afin que le Photoblanchiment des GECIs est réduit au minimum. Un autre facteur important est le niveau d’expression des GECIs. GECIs ont un Ca2 +-effet tampon car elles sont Ca2 +-protéines de liaison. Par conséquent, la surexpression de GECIs entraîne la bufferisation de Ca2 +, qui est physiologiquement nécessaire pour les cellules. La quantité d’expression GECI devrait être minimisée pour éviter d’imagerie de cellules exprimant des quantités élevées de GECIs. 
  En conclusion, la dissection des signaux de Ca2 + à une résolution subcellulaire est l’une des étapes plus importantes pour le décodage des signaux2 + Ca intracellulaires qui déterminent le phénomène biologique de sortie. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour la dissection des signaux de Ca2 + pour décrire la diversité parmi ces signaux. Actuellement, cette technique est limitée pour des expériences in vitro. Toutefois, Lck-GCaMP6f est déjà utilisé pour l’imagerie in vivo Ca2 + souris17et rel-GCaMP6f a été confirmée pour surveiller Ca2 + signaux in vivo chez les neurones moteurs VD chez c. elegans7. Ciblage GECIs dans le compartiment subcellulaire a donc le potentiel d’être étendu à in vivo d’imagerie à l’avenir, donc in vivo permettant la dissection Ca2 + .

Ca2 + signaux représentent l’élévation de la concentration intracellulaire de Ca2 + . Ca2 + est le second messager universel pour les cellules eucaryotes. À l’aide de Ca2 +, les cellules fonctionnent par l’intermédiaire de diverses voies de signalisation intracellulaire et induisent divers produits biologiques. Par exemple, dans les neurones, la libération des vésicules synaptiques dans la terminaison présynaptique, expression de gène dans le noyau et l’induction de la plasticité synaptique à la postsynapse sont réglementés par distinctes Ca2 + des signaux qui justement activer le cas échéant enzymes en aval sur les sites de droite et avec le timing précis1.
Des modèles spécifiques spatio-temporelle des signaux de Ca2 + activent les enzymes spécifiques en aval. Ca2 + signaux sont générés par la coordination entre les deux Ca2 + sources différentes : influx de Ca2 + de l’espace extracellulaire et la libération de Ca2 + du réticulum endoplasmique (ER), qui sert une Ca intracellulaire2 + magasin. La significative spatio-temporelle Ca2 + signalisation modèle pour induire une fonction de cellule spécifique est également pris en charge par nanodomains de 10 à 100 µM Ca2 + générée dans les environs de Ca2 + canaux sur la membrane plasmique ou ER membrane2. Ce qui est important, la source des signaux de Ca2 + est l’un des plus importants facteurs qui déterminent la production biologique en aval. Dans les neurones, l’influx de Ca2 + et2 + libération de Ca ont des effets opposés sur le regroupement des récepteurs de l’acide gamma - aminobutyrique (GABA)A (GABAAR) dans les synapses GABAergiques, qui est responsable de l’inhibition de la 3de l’excitabilité neuronale. Influx de ca2 + accompagné d’excitation neuronale massive provoque la dispersion des grappes de GABAAR synaptiques, tandis que persistent Ca2 + la libération de l’ER favorise le regroupement des synaptique GABAARs. Autres groupes ont également rapporté que la direction de syntonisation des cônes de croissance est critique dépend de la source du signal2 + Ca : influx de Ca2 + provoque la répulsion, alors que la libération de Ca2 + guides l’attraction de la croissance neuronale cône4. Par conséquent, pour bien comprendre le Ca2 + qui sous-tendent les sorties cellulaires spécifiques de voies de signalisation, il est important d’identifier la source des signaux de Ca2 + en décrivant les signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire.
Dans ce protocole, nous décrivons une Ca2 + méthode d’imagerie pour signaler les signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire, qui permet l’estimation du Ca2 + sources de signaux (Figure 1). Ca2 + microdomaines juste en dessous de la membrane plasmique sont contrôlés avec succès par génétiquement encodé Ca2 + indicateurs (GECIs) destinés à la membrane plasmique par l’intermédiaire de la fixation du signal membrane plasmique-localisation Lck dans Src kinase pour les extrémités N-terminales de GECIs5. Pour détecter le profil des signaux Ca2 + à proximité de la salle d’urgence à une meilleure résolution spatiale et temporelle, nous avons développé récemment rela-GCaMP6f, dans laquelle membrane externe de cibles l’ER GCaMP6f6 , utilisant la protéine transmembranaire ER. OER-GCaMP6f peut signaler avec délicatesse de Ca2 + sortie de la salle d’urgence à une meilleure résolution spatio-temporelle à classiques GCaMP6f non ciblées au COS-7 cellules7 et de cellules HEK2938, en évitant la diffusion de Ca2 + et GECIs . Nous a également confirmé que l’élévation de Ca2 + spontanée dans les astrocytes cultivés hippocampe rapporté par rel-GCaMP6f a montré une tendance spatio-temporelle différente par rapport à celle contrôlée par GCaMP6f axés sur la membrane plasmique (Lck-GCaMP6f)7 ,9, ce qui indique que Ca2 + imagerie avec REL-GCaMP6f en combinaison avec Lck-GCaMP6f contribue à la dissection des signaux de Ca2 + à la résolution subcellulaire d’indiquer leurs sources.
Actuellement, nous détaillons le protocole de la dissection dans les cellules HeLa et neuron-astrocyte plaqués sur couvre-objet en verre de cultures mixé de Ca2 + signal. La Ca2 + technique d’imagerie avec GECIs indiquées ici, Lck-GCaMP6f, plasma membrane ciblées RCaMP210 (Lck-RCaMP2), et rel-GCaMP6f (Figure 1) sont applicables à toutes les cellules dans lesquelles ces GECIs peuvent être exprimées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Les ions calcium (Ca2 +) sont une molécule universelle messager intracellulaire qui entraîne de multiples voies de signalisation, menant à divers produits biologiques. La coordination des deux sources de Ca2 + signal — « Ca2 + afflux » d’à l’extérieur de la cellule et « Libération2 + Ca » du Ca2 + intracellulaire stocker réticulum endoplasmique (re) — est considérée comme sous-tendent les divers patrons spatio-temporelle de Ca 2 + signaux qui causent plusieurs fonctions biologiques dans les cellules. Ce protocole vise à décrire une nouvelle Ca2 + méthode d’imagerie qui permet la surveillance des moment de « Influx de Ca2 + » et « Ca2 + release ». OER-GCaMP6f est un codé génétiquement Ca2 + indicateur (GECI) comprenant GCaMP6f, qui vise à la membrane externe de l’ER. OER-GCaMP6f peut surveiller la libération de Ca2 + à une résolution temporelle supérieure à GCaMP6f conventionnel. Combiné avec GECIs axés sur la membrane plasmique, le spatio-temporelle Ca2 + signal modèle peut être décrit à une résolution subcellulaire. Subcellulaire ciblés Ca2 + indicateurs décrits ici sont, en principe, disponible pour tous les types de cellules, même pour l’in vivo d’imagerie des neurones Caenorhabditis elegans . Dans ce protocole, nous présenter Ca2 + imagerie dans les cellules des lignées de cellules, neurones et cellules gliales dans les cultures primaires dissociés et décrire la préparation congelée stock de neurones corticaux de rat.

LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f ont été exprimés dans les cellules HeLa, et les deux signaux ont été enregistrés simultanément à l’aide de partage d’image optique, 24h après la transfection (Figure 3 a et 1 vidéo). Les images ont été acquises à 10 Hz. Histamine (His, 1 µM), qui induit la libération de Ca2 + de la salle d’urgence, a été ajouté lors de l’enregistrement. Sur demande de son l’intensité du signal de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f a augmenté, comme en témoigne l’affichage pseudo-couleur de ΔF/F0, qui représente la variation de l’intensité de fluorescence initiale (Figure 3 b). Les cours de temps d’élévation de Ca2 + (ΔF/F0) rapportés par Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f ont été comparées dans la même région d’intérêt (ROI) (Figure 3). Les valeurs ΔF/F0 ont été normalisés à leurs valeurs maximales pour permettre la comparaison temps de parcours entre les deux GECIs différents, qui ont des distributions et des niveaux d’expression différents. Les deux capteurs ont signalé une oscillation comme Ca2 + altitude. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f a montré l’évolution même de Ca2 + élévation dans deux cellules parmi les types de cinq cellules examinées (Figure 3, ROI 1 et 3). Cependant, Ca2 + élévations illustrées par Lck-RCaMP2 est resté à un niveau supérieur par rapport à celle montrée par rel-GCaMP6f (Figure 3 C, ROI 2, 4 et 5). Les résultats indiquent que l’élévation de Ca2 + se prolonge dans le voisinage de la membrane plasmique, bien qu’elle soit terminée plus tôt autour de l’ER, qui est la source de ce Ca2 + signal induite par sa stimulation.
Spontanée Ca2 + des signaux d’astrocytes dans la culture d’hippocampe de rat (Figure 4 a) mixé neuron-astrocyte et cortex (Figure 4 b) ont été diffusés par Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f (Figure 4, vidéo 2, vidéo 3 de , Vidéo 4et vidéo 5). Cultures corticales ont été repris du stock congelé qui a été préparé comme décrit dans le présent protocole. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f signaux ont été enregistrées dans l’ordre à 2 Hz par les mêmes cellules. Trois ROIs ont été sélectionnés dans la zone qui a montré Ca2 + élévation par chaque GECI et l’évolution temporelle de ΔF/Fbase (c.-à-d., l’intensité de la fluorescence) est passé de l’intensité de la fluorescence moyenne pendant la période d’enregistrement entier (Fbase ). Si la fluorescence de la ligne de base est stable et Ca2 + élévations sont moins fréquentes, Fbase devient une base utile pour détecter les événements de Ca2 + élévation. Spontanée Ca2 + élévations étaient visibles seulement au processus astrocytaires, pas au corps cellulaire. Ce résultat concorde avec les rapports précédents sur les astrocytes Ca2 + signaux spontanées par d’autres GECIs visualisées in vitro13 et in vivo14. Dans les astrocytes hippocampe et cortex, Ca2 + élévations illustrées par Lck-RCaMP2 (haut) étaient plus fréquentes que celles indiquées par rel-GCaMP6f. Ce résultat est conforme à notre démonstration précédente que les Ca2 + élévations dans les astrocytes en raison Lck-GCaMP6f ont été détectées plus fréquemment que celles dues à OER-GCaMP6f7 et suggère que cette notion est également applicable à la niveau de la cellule unique.
Spontanée Ca2 + élévations par Lck-GCaMP6f dans les neurones de l’hippocampe des rats immatures (10 DIV) ont été vus à 2 Hz (Figure 5 a et 6 de la vidéo). Les cours de temps de ΔF/F0 dans cinq différents ROIs suggèrent que ces Ca2 + élévations sont localement confinées aux domaines subcellulaires. Figure 5 b (Vidéo 7) montre les Ca2 + réponses dans des neurones hippocampal souris matures (30 DIV) infectés par des vecteurs d’AAV OER-GCaMP6f-expression. Les neurones ont été stimulées avec 100 µM DHPG, qui est l’agoniste des récepteurs métabotropiques du glutamate, induisant la libération de Ca2 + . DHPG Ca2 + libération induite en raison de l’OER-GCaMP6f a été détectée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figure 1 : schéma montrant la membrane ciblées GECIs. Diagramme schématique de GECIs axés sur la membrane plasmique (Lck-GCaMP6f et Lck-RCaMP2) et ER externe ciblée membrane GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figure 2 : diagramme de flux pour la préparation de cellules hippocampiques et corticaux, transfection de plasmide et l’infection de l’AAV. Les images microscopiques sont représentatifs, fraîchement plaquée DIV-6 cellules corticales (à gauche) et relancé les cellules du stock congelé (à droite). Echelle = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figure 3 : exemple de l’imagerie simultanée des Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans les cellules HeLa. (A) représentation schématique de la séparation du signal avec partage d’image optique. Le même champ de vision pour Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f est simultanément projetée sur la caméra. 1 vidéodonne un enregistrement représentant acquis à 10 Hz par une caméra CMOS, et une image de cet enregistrement est illustrée dans le groupe A (à droite). (B) des images de pseudo-couleur de ΔF/F0 pour Lck-GCaMP2 (en haut) et rel-GCaMP6f (en bas). L’histamine (His, 1 µM) a été ajouté à 0 s. (C) représentant cours heure normalisée de ΔF/F0 de Lck-GCaMP2 (magenta) et rel-GCaMP6f (vert). Les données ont été normalisées à la valeur maximale de ΔF/F0 pour chaque parcelle. Les barres grises indiquent le moment de son application. Données ont été analysées avec un logiciel sur mesure TI Workbench15. Echelle = 50 µm (image microscopique).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figure 4 : Élévation2 + Ca spontanée dans les astrocytes surveillé d’expression Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f. (A) représentant hippocampique et (B) les astrocytes corticaux transfectées avec Lck-RCaMP2 (en haut) et rel-GCaMP6f (en bas). Les cellules corticales ont été repris de cultures mères congelées. LCK-RCaMP2 et rel-GCaMP6f images ont été acquises dans l’ordre dans la même cellule, à 2 Hz, avec une caméra CCD-EM. Les parcelles sur le spectacle de gauche les cours du temps de ΔF/Fbase mesurées dans la ROIs indiquent dans l’image microscopique. Données ont été analysées avec TI Workbench. Films réels sont fournis dans la vidéo 2, vidéo 3, vidéo 4et 5 de la vidéo. La barre d’échelle = 20 µm (image microscopique). La dérive de référence suggère les changements dans le niveau2 + Ca global dans la cellule.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figure 5 : Exemples de Ca2 + imagerie dans les neurones avec Lck-GCaMP6f et rel-GCaMP6f. (A) représentant rat neurones de l’hippocampe exprimant Lck-GCaMP6f à 10 DIV (à gauche) et tracés indiquant l’heure des cours de ΔF/F0 mesurée dans la ROIs (cercles jaunes) sont indiquées dans l’image (à droite). Les numéros dans le décours temporel correspondent aux numéros ROI dans l’image. Notez que le patron temporel de Ca2 + élévation est différent entre les diverses régions d’intérêt. La dérive de la ligne de base indique l’augmentation du Ca2 + niveau global dans ce neurone. (B) un exemple de souris adultes neurones de l’hippocampe (DIV 30) infectés par des vecteurs d’AAV expression OER-GCaMP6f (à gauche). L’heure de cours de ΔF/F0 mesurée indique la réponse Ca2 + à 100 µM (RS) - 3, 5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) appliquée à la date indiquée par la barre grise. Cercles jaunes indiquent la position des ROIs où l’évolution temporelle a été obtenue. Les images ont été acquises à 2 Hz avec une caméra CCD refroidi (groupe A) ou une EM-CCD caméra (groupe B) et analysées avec TI Workbench. Echelle = 20 µm (image microscopique). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Vidéo 1 : exemple de l’imagerie simultanée de Lck-RCaMP2 et rel-GCaMP6f dans les cellules HeLa. Enregistrement représentant acquis à 10 Hz et présenté à la Figure 3. Echelle = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Vidéo 2 : Spontanée de Ca2 + transitoire observé dans Lck-RCaMP2 dans l’hippocampe astrocyte. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 a), enregistrées dans le même champ de vision en vidéo 3. Echelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Vidéo 3 : Spontanée de Ca2 + transitoires observés dans OER-GCaMP6f en un hippocampe astrocyte. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 a), dans le même champ de vision en tant que vidéo 2. Echelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Vidéo 4 : Spontanée de Ca2 + transitoire chez Lck-RCaMP2 dans un astrocyte corticale enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 b), enregistrées dans le même champ de vision comme vidéo 5. Echelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5 : Spontanée de Ca2 + transitoires observés dans OER-GCaMP6f en un astrocyte corticale. Enregistrement représentant acquis à 2 Hz (Figure 4 b), dans le même champ de vision en tant que vidéo 4. La barre d’échelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6 : Exemple de Ca2 + imagerie dans un neurone hippocampe de rat (DIV 10) par Lck-GCaMP6f. Exemple de neurones Ca2 + des signaux enregistrés à 2 Hz (Figure 5 a). Echelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Vidéo 7 : Ca2 + sortie dans un neurone hippocampe de souris (30 DIV), exprimant des OER-GCaMP6f. Exemple de Ca2 + signaux neurones enregistré dans un neurone hippocampe de souris infecté par des vecteurs d’AAV expression OER-GCaMP6f (Figure 5 b). Le neurone est stimulé avec 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) appliqué à 30 s pour évoquer la libération de Ca2 + de l’ER. Echelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

La dissection des signaux de calcium à une résolution sous-cellulaire, est l’une des étapes les plus importantes pour décoder les signaux intracellulaires de calcium qui déterminent le phénomène biologique de sortie. Ce protocole décrit une nouvelle méthode d’imagerie calcique qui permet de surveiller le moment même de l’afflux de calcium et de la libération de calcium. Ce protocole s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression d’indicateurs de calcium génétiquement codés.Nous croyons que notre méthode a le potentiel d’être étendue à la dissection des signaux de calcium à la résolution sous-cellulaire chez les animaux vivants dans la culture de laboratoire. Matsumi Hirose, technicienne de notre laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour commencer cette procédure, placez un couvercle en verre de 18 millimètres de diamètre dans chaque puits d’une plaque de 12 puits.Utilisez de l’eau stérilisée et préparez 12,5 millilitres d’une solution de 0,4 % à l’Île-du-Prince-Édouard pour chaque 12 plaques de puits utilisées. Ajoutez un millilitre de la solution de l’Île-du-Prince-Édouard à chaque puits et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les feuillets de couverture. Incuber la nuit dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.Le lendemain, utilisez un aspirateur pour supprimer la solution de l’Î.-P.-É. Ajouter un millilitre d’eau stérilisée à chaque puits et secouer la plaque de sorte que la solution de l’Île-du-Prince-Édouard entre le glissement du couvercle et la plaque soit bien lavée. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus avec de l’eau fraîche stérilisée.Après le lavage final, aspirer complètement l’eau de chaque puits. À l’intérieur du capot, utiliser une lumière ultraviolette pour sécher et stériliser les glissements de couvercle pendant au moins 15 minutes. Le plat enduit de l’Île-du-Prince-Édouard peut être conservé à quatre degrés Celsius jusqu’à deux mois.Lorsque vous êtes prêt à procéder, illuminez la vaisselle avec la lumière ultraviolette pendant 15 minutes, juste avant l’utilisation. Ajouter cinq millilitres d’eau distillée stérile dans l’espace entre les puits pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Tout d’abord, laver les cortices avec de l’incubation saline.Puis, incuber les cortices avec trypsine et DNAse en incubation saline pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cortices trois fois avec de la glace froide incubation saline. Retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de placage moyen complété par 150 microlitres de bouillon DNAse I.Dissocier les cellules en pipetting vingt fois ou moins et filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire avec une taille de pore de 70 micromètres. Ensuite, lavez la passoire cellulaire avec 20 millilitres du milieu de placage. Pour la préparation du bouillon de cellules congelées, lavez les cellules avec 20 millilitres du milieu de lavage.Diluer les cellules corticales avec le milieu de placage à une densité de 140 000 cellules viables par millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de suspension cellulaire diluée aux feuillets de housse enduits de l’Île-du-Prince-Édouard dans les 12 plaques de culture du puits. Maintenir les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours.Lorsque les cellules sont stables, deux à trois jours après le placage, changer le milieu de culture au milieu d’entretien. Pour la préparation du stock cellulaire congelé, faites tourner la cellule à l’aide d’un rotor pivotant pour centrifuger les cellules à 187 fois G pendant trois minutes. Aspirer le supernatant et ajouter le milieu de cryopréservation, maintenu à quatre degrés Celsius, pour obtenir une densité cellulaire de 10 millions de cellules par millilitre.Aliquot un millilitre de la suspension cellulaire en tubes cryogéniques. Placez les tubes dans un contenant de congélation cellulaire avec un taux de congélation de moins un degré Celsius par minute, jusqu’à ce qu’une température de moins 80 degrés Celsius soit atteinte. Transférer le contenant de congélation dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.Pour faire revivre les cellules congelées, préchauffer le milieu de lavage et le milieu d’entretien des cellules corticales congelées. Ensuite, décongelez rapidement les cellules gelées dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Diluer délicatement les cellules avec un moyen de lavage préchauffé et une centrifugeuse avec un rotor de balançoire à 187 fois G pendant trois minutes.Suspendre à nouveau la pastille en un millilitre de milieu de lavage et mesurer la densité cellulaire viable. Ensuite, diluer les cellules avec le milieu d’entretien pour les cellules corticales congelées, pour donner une densité cellulaire de 300 000 cellules par millilitre. Cédez un millilitre de cette suspension cellulaire dans les puits de l’Île-du-Prince-Édouard enduit 12 plaques de puits.Pour la transfection trois à huit jours après le placage, étiqueter deux tubes, l’un pour l’ADN plasmatique et l’autre pour le réaccente de transfection. Ajouter 50 microlitres de sérum moyen réduit par puits, à chaque tube. Ajouter 0,5 microgramme d’ADN plasmatique par glissement de couverture et un microlitre de supplément accompagné d’un réaccente de transfection pour les neurones, par puits au tube d’ADN plasmatique.Pour la co-transfection de Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f, mélanger 0,5 microgramme de chaque plasmide et un microlitre de supplément dans 50 microlitres de sérum moyen réduit par puits. Ensuite, ajoutez un microlitre de réaccente de transfection par puits au tube de réaccentation transfection. Vortex les deux tubes pendant une à deux secondes.Ajouter ensuite le mélange de réaccente de transfection au mélange d’ADN. Pipette doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Chargez ce mélange sur les cellules d’une manière goutte-sage.Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à ce que les protéines marqueurs soient exprimées. Mélanger L et O pour faire l’infection aac. Ajouter trois microlitres d’AAC par puits à la culture mixte neurone-astrocyte.Faire bercer délicatement le plat pour le mélanger. Maintenir la culture pendant une à deux semaines jusqu’à ce que les IGE soient exprimés. Montez d’abord le bordereau de couverture contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et OER-CaMPG6f dans la chambre d’enregistrement du microscope.Ajouter 400 microlitres du milieu d’imagerie et placer un couvercle sur le dessus de la chambre. Choisissez l’ensemble de filtres pour GCaMP6f et la source de lumière. Localiser les astrocytes exprimant OER-GCaMP6f.Ensuite, choisissez un ensemble de filtres et une source de lumière pour RCaMP2 et confirmez si Lck-RCaMP2 est exprimé dans les mêmes astrocytes. Enregistrez des images en accéléré de Lck-RCaMP2 à deux Hertz pendant deux minutes et enregistrez les données d’imagerie. Après cela, changer le filtre en arrière à celle de GCaMP6f.Enregistrement des images de laps de temps d’OER-GCaMP6f à deux Hertz pendant deux minutes et enregistrer les données d’imagerie. Dans cette étude, Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f sont exprimés dans les cellules HeLa et les deux signaux ont été enregistrés simultanément à l’aide de l’optique de fractionnement d’image, 24 heures après la transfection. Lors de l’ajout d’Histamine, l’intensité du signal de Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f a augmenté.Les cours du temps d’élévation de l’ion calcium rapportés par Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f sont comparés dans les mêmes régions d’intérêt. Les deux capteurs signalent une élévation d’ion de calcium oscillation-comme. Et les deux montrent le même cours de temps dans deux des cinq cellules examinées.Cependant, les élévations d’ion de calcium montrées par Lck-RCaMP2 restent au niveau plus élevé que OER-GCaMP6f dans les autres cellules. Ces résultats indiquent que l’élévation d’ion de calcium est prolongée dans le voisinage de la membrane de plasma, alors qu’elle est terminée plus tôt autour de l’ER, qui est la source de ce signal d’ion de calcium induit par la stimulation d’Histamine. Les signaux spontanés d’ion de calcium des astrocytes dans la culture mélangée de neurone-astrocyte de l’hippocampe de rat et des cortices sont montrés par Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f.Les élévations spontanées d’ion de calcium sont visibles seulement au processus astrocytic, pas au corps cellulaire qui est compatible aux rapports précédents. Des élévations spontanées d’ion de calcium par Lck-GCaMP6f dans les neurones hippocampal immatures de rat sont vues à deux Hertz. Les cours du temps pour cinq régions d’intérêt différentes suggèrent que ces élévations sont localement confinées aux domaines subcellulaires.Les neurones hippocampaux matures de souris infectés par des vecteurs AAV d’expression OER-GCaMP6f montrent des réponses d’ion de calcium en réponse à l’ajout de DHPG. Pour l’imagerie calcique, la puissance de lumination d’excitation est le facteur le plus critique. S’il vous plaît garder la lumière d’excitation aussi bas que possible pour éviter le photo-blanchiment et la photo-toxicité.La source des signaux calcique peut encore être confirmée par Pomakorzi en utilisant des inhibiteurs spécifiques aux canaux calcique. Le décodage des signaux calciques pour évoquer une production spécifique a été une question biologique fondamentale. Cette technique d’imagerie calcique ouvre la voie à la décrire la diversité des signaux de calcium intracellulaires.

Research

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