Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Diese Arbeit wird unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory Research für embryonale Wissenschaft und Technologie (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) / Stipendien an Hilfe für die wissenschaftliche Forschung (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Die Autoren danken Haruhiko Bito (Universität Tokio) für die Bereitstellung von RCaMP2 und Arthur J.Y. Huang und Thomas McHugh (RIKEN CBS) für die AAV-Vektoren und Anweisungen bezüglich AAV Vorbereitung. Die Autoren möchten auch Editoren danken im Journal of visualisiert Experiments für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vielfältigen biologischen Ausgänge werden von Ca2 + Signale eingeleitet. Ca2 + ist ein vielseitiger intrazellulären Signal Bote. Decodierung Ca2 + Signale an bestimmte Ausgänge evozieren wurde eine grundlegende biologische Frage, und Ca2 + bildgebende Verfahren zu beschreiben, die Vielfalt der Ca2 + Signale sind erforderlich. Die derzeit ausführliche Protokoll ermöglicht die Erkennung von unterschiedlichen Ca2 + Signale an die Plasmamembran und ER (Abbildung 3 und Abbildung 4) und lokalen Ca2 + Microdomains innerhalb einer Zelle (Abbildung 4 und Abbildung 5). Dies trägt zu beschreiben die Vielfalt der intrazellulären Ca2 + Signale. Die zeitliche Auflösung von Ca2 + signalisiert wurde auch verbessert, durch gezielte GECIs in der Plasmamembran und ER, weil es kann die Wirkung von einer dreidimensionalen Diffusion von Ca2 + und GECIs selbst vermeiden, und es das Potenzial hat zu erkennen, die Augenblick der Ca2 + Zustrom oder Ca2 + Release, das auf der Membran auftritt.
Das Protokoll hat einige Einschränkungen. Benutzer sollten beachte bitte, dass die detektierten Signale die Summierung von "the Moment of Ca2 + Zustrom oder Release sind" und "Ca2 + verbreitet heraus aus der Originalquelle ca.2 +" , vor allem für große Ca2 + Signale. Zum Beispiel obwohl seine Anregung in HeLa-Zellen Ca evoziert befreien2 + die ER, seine daraus resultierende Ca2 + Signale, nicht nur indem ER gezielt OER-GCaMP6f, sondern auch durch Plasma-Membran-gezielte Lck-RCaMP2 (Abbildung 3 erkannt werden). Eine weitere Einschränkung ist, dass die räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale möglicherweise nicht der einzige bestimmende Faktor der Leistung von Ca2 + Signale. Die Verteilung der nachgeschaltete Effektor-Proteine (z. B. Ca2 +-abhängigen Kinasen und Phosphatasen) kann auch ein bestimmender Faktor2. Um die intrazellulären Ca2 + Signale vollständig zu entschlüsseln, ist Analyse der nachgeschalteten Enzym Verhalten, die in diesem Protokoll nicht abgedeckt ist, absolut notwendig.
Einer der kritischsten Aspekte für erfolgreiche Ca2 + Imaging ist der bildgebenden Setup und Bild Erwerb Bedingungen, ebenso wie bei anderen live-Imaging-Studien. Bisher zeigten wir, dass Ca2 + Reaktionen in der Zelle auf die Dauer und Intensität der Erregung und Bild Erwerb Bedingungen, einschließlich Belichtung Zeit und Übernahme Frequenz16sehr angewiesen sind. Erregerleistung Beleuchtung ist der kritischste Faktor, da es leichte Toxizität und Immunofluoreszenz GECIs verursachen kann. Die Aufnahmebedingungen der Exposition Zeiterfassung, Frequenz, Anregung Intensität und Dauer der Aufnahme sollte nach dem Zweck des Experiments optimiert werden. Es wird empfohlen, die Belichtungszeit und die Erregung Lichtintensität Immunofluoreszenz und Phototoxizität zur Zelle zu vermeiden so weit wie möglich reduzieren. Die Aufnahmefrequenz und die Dauer der Aufnahme sollte ausreichen, um die Ca2 + Höhe Ereignisse von Interesse, aber sollte zur Vermeidung von Immunofluoreszenz und Phototoxizität auch möglichst gering gehalten werden. Wir empfehlen bestimmen zunächst die Aufnahmefrequenz und die Dauer und der Lichtintensität und der Belichtungszeit zu optimieren, so dass die Immunofluoreszenz die GECIs minimiert wird. Ein weiterer wichtiger Faktor ist der Ausdruck der GECIs. GECIs haben Ca2 +-Pufferung Wirkung sind Ca2 +-bindende Proteine. Daher führt die Überexpression von GECIs in die Pufferung von Ca2 +, die physiologisch notwendig ist für die Zellen. Die Höhe der GECI Ausdruck sollte zur Vermeidung von bildgebenden Zellen mit dem Ausdruck hoher Mengen an GECIs minimiert werden. 
  Zusammenfassend ist das Sezieren von Ca2 + Signale mit einer subzellulären Auflösung einer der wichtigsten Schritte für die Decodierung der intrazellulären Ca2 + Signale, die die Ausgabe biologisches Phänomen zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode für das Sezieren von Ca2 + Signale, die Vielfalt dieser Signale zu beschreiben. Derzeit beschränkt sich diese Technik für in-vitro-Experimente. Jedoch Lck-GCaMP6f dient bereits zur in-vivo Ca2 + Bildgebung bei Mäusen17und OER-GCaMP6f bestätigt wurde, um Ca2 + überwachen in vivo im VD motorischen Neuronen in C. Elegans7 signalisiert. Targeting GECIs subzelluläre Fach hat daher das Potenzial, erweitert werden, um in-vivo Bildgebung in der Zukunft so förderlichen Ca2 + Dissektion in-vivo.

Ca2 + Signale stellen die Höhe der intrazellulären Ca2 + Konzentration. Ca2 + ist die universelle zweiten Messenger für eukaryotische Zellen. Mit Ca2 +, Zellen funktionieren über verschiedene intrazelluläre Signalwege und verschiedenen biologischen Ausgänge zu induzieren. Z. B. in Neuronen, synaptischen Vesikel Release am präsynaptischen Terminal Genexpression in den Zellkern und Induktion der synaptischen Plastizität an der Postsynapse unterstehen verschiedene Ca2 + Signale, die genau den entsprechenden aktivieren nachgeschalteter Enzyme an den richtigen Standorten und mit präzisem Timing1.
Spezifischen räumlich-zeitliche Muster Ca2 + Signale aktivieren die spezifischen nachgeschalteter Enzyme. Ca2 + -Signale werden generiert, indem die Koordination zwischen zwei verschiedenen Ca2 + Quellen: Ca2 + Zustrom aus dem Extrazellulärraum und Ca2 + Entlassung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER), dient als eine intrazelluläre Ca2 + speichern. Die sinnvolle raumzeitliche Ca2 + Signalisierung Muster induzieren eine bestimmte Zelle-Funktion wird auch durch Nanodomains von 10-100 µM Ca2 + erzeugt in der Nähe von Ca2 + -Kanäle in der Plasmamembran oder ER-Membran-2unterstützt. Wichtig ist, ist die Quelle von Ca2 + Signale eines der wichtigsten Faktoren, die die nachgeschaltete biologischen Ausgabe. In Neuronen haben Ca2 + Zustrom und Ca2 + Release entgegengesetzte Effekte auf das clustering von Gamma - Aminobuttersäure (GABA)A -Rezeptoren (GABA-AR) an den GABAergen Synapsen, der verantwortlich für die Hemmung der neuronale Erregbarkeit3. Ca2 + Zustrom begleitet von massiven neuronale Erregung induziert die Streuung der synaptischen GABAAR Cluster, während anhaltende Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme fördert das clustering von synaptischer GABA-A-Rs. Andere Gruppen haben auch berichtet, dass Tune Richtung Wachstum Kegel Ca2 + Signalquelle kritisch abhängig ist: Ca2 + Zustrom induziert Abstoßung, während Ca2 + Release die Attraktion für das neuronale Wachstum führt Kegel4. Daher, um die Ca2 + Signalwege zugrunde liegenden spezifischen zellulären Ausgänge zu verstehen, ist es wichtig zur Identifizierung der Quelle von Ca2 + Signale von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung zu beschreiben.
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Ca2 + bildgebende Methode um Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung ermöglicht die Abschätzung der Ca2 + Signalquellen (Abbildung 1) zu melden. Ca2 + Microdomains unterhalb der Plasmamembran werden erfolgreich von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) gezielt an die Plasmamembran über die Befestigung der Plasmamembran-Lokalisierung Signal Lck in Src überwacht. Kinase N-Termini GECIs5. Um das Ca2 + Signalmuster in der Nähe der ER auf eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung erkennen, entwickelten wir vor kurzem OER-GCaMP6f, welche GCaMP6f6 Ziele der ER äußere Membran, mit der ER transmembranen Protein. OER-GCaMP6f kann sensibel Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme mit einer besser räumlich-zeitliche Auflösung als herkömmliche nontargeted GCaMP6f COS-7 Zellen7 und HEK293 Zellen8, durch die Vermeidung der Verbreitung von Ca2 + und GECIs melden. . Wir auch bestätigt, dass die spontane Ca2 + Erhebung im kultivierten hippocampal Astrozyten berichtet von OER-GCaMP6f ein anderes räumlich-zeitliche Muster zeigte im Vergleich zu jener von Plasmamembran ausgerichtete GCaMP6f überwacht (Lck-GCaMP6f)7 ,9, darauf hinweist, dass Ca2 + Bildgebung mit OER-GCaMP6f in Kombination mit Lck-GCaMP6f, das Sezieren von Ca2 + Signale in der subzellulären Auflösung trägt, ihre Quellen zu identifizieren.
Derzeit zeigen wir das Protokoll für die Ca2 + Signal Dissektion im HeLa-Zellen und Neuron-Astrozyten Mischkulturen auf Glasdeckgläser überzogen. Die Ca2 + bildgebende Verfahren mit GECIs angegeben hier Lck-GCaMP6f, Plasma-Membran-bezogenen RCaMP210 (Lck-RCaMP2) und OER-GCaMP6f (Abbildung 1) gelten für alle Zellen, in denen diese GECIs ausgedrückt werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Calcium-Ion (Ca2 +) ist eine universelle intrazelluläre Messenger-Molekül, das mehrere Signalwege, führt zu vielfältigen biologischen Ausgänge treibt. Die Koordination der beiden Ca2 + Signalquellen – "Ca2 + Zustrom" von außerhalb der Zelle und "Ca2 + Release" von der intrazellulären Ca2 + speichern endoplasmatische Retikulum (ER) – gilt die vielfältigen räumlich-zeitliche Muster von Ca zugrunde liegen 2 + Signale, die mehrere biologische Funktionen in Zellen verursachen. Dieses Protokoll soll ein Ca2 + bildgebendes Verfahren zu beschreiben, das ermöglicht die Überwachung der Augenblick der "Ca2 + Zustrom" und "Ca2 + release". OER-GCaMP6f ist ein genetisch codierte Ca2 + Indikator (GECI) bestehend aus GCaMP6f, die auf der äußeren Membran ER ausgerichtet ist. OER-GCaMP6f kann Ca2 + Version auf eine höhere zeitliche Auflösung als herkömmliche GCaMP6f überwachen. In Kombination mit der Plasmamembran ausgerichtete GECIs, kann die räumlich-zeitliche Ca2 + Signalmuster mit einer subzellulären Auflösung beschrieben werden. Die subzelluläre gezielt Ca2 + Indikatoren hier beschrieben sind, im Prinzip für alle Zelltypen, auch für die in-vivo von Caenorhabditis Elegans Neuronen imaging. In diesem Protokoll wir Ca2 + Bildgebung in Zellen von Zelllinien, Neuronen und Gliazellen bei dissoziierten Primärkulturen einzuführen, und die Vorbereitung der gefrorenen Bestand an Ratte kortikale Neuronen beschreiben.

LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in HeLa-Zellen ausgedrückt, und beide Signale gleichzeitig mit Bild-splitting Optik, 24 h nach Transfektion (Abb. 3A und Video 1) aufgezeichnet wurden. Die Bilder wurden bei 10 Hz. Histamin (seiner 1 µM), die induziert Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme, wurde hinzugefügt, während der Aufnahme erworben. Auf Antrag seiner erhöht die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, dargestellt durch die Pseudofarben Anzeige von ΔF/F0, die die Änderung von der ursprünglichen Fluoreszenzintensität (Abb. 3 b) darstellt. Die Zeit-Kurse von Ca2 + Höhe (ΔF/F0) berichtet von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wurden in der gleichen Region of Interest (ROI) (Abbildung 3) verglichen. Die ΔF/F0-Werte wurden auf ihre Spitzenwerte der Zeit Kurs Vergleich zwischen die zwei verschiedenen GECIs ermöglichen die verschiedenen Ausdruck Niveaus und Distributionen haben normalisiert. Beide Sensoren berichtet eine Schwingung wie Ca2 + Höhe. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f zeigte den gleichen zeitlichen Verlauf für Ca2 + Höhe in zwei Zellen unter den fünf Zelle Arten untersucht (Abbildung 3, ROI 1 und 3). Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 blieb jedoch auf einer höheren Ebene im Vergleich dazu von OER-GCaMP6f (Abb. 3 C, ROI, 2, 4 und 5) gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ca2 + Höhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während es früher um das ER gekündigt wird, welches ist die Quelle dieses Ca2 + Signal induziert durch seine Stimulation.
Spontane Ca2 + -Signale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten gemischte Kultur von Ratte Hippokampi (Abbildung 4A) und Cortexes (Abbildung 4 b) zeigten sich von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f (Abbildung 4, Video 2, Video 3 , 4 Videound Video 5). Kortikale Kulturen wurden aus dem gefrorenen bestand wieder belebt, die vorbereitet wurde, wie in diesem Protokoll beschrieben. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Signale wurden nacheinander bei 2 Hz aus den gleichen Zellen aufgenommen. Drei ROIs in der Gegend, die Ca2 + Höhe zeigte von jedem GECI ausgewählt wurden, und der zeitlichen Verlauf der ΔF/FBasis (d. h. der Fluoreszenzintensität) geändert von der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität während der gesamten Aufzeichnungsdauer (FBasis ). Wenn die Basislinie Fluoreszenz stabil ist und Ca2 + Höhen seltener sind, wird FBasis eine nützliche Grundlage für Ca2 + Höhe-Ereignisse zu erkennen. Spontane Ca2 + Höhen waren sichtbar, nur bei den astrocytic Process, nicht an den Zellkörper. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der früheren Berichten über astrocytic spontan Ca2 + Signale von anderen GECIs visualisierte in-vitro-13 und in-vivo-14. Im Hippokampus und kortikalen Astrozyten waren Ca2 + Erhebungen gezeigt von Lck-RCaMP2 (oben) häufiger als diejenigen von OER-GCaMP6f gezeigt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer früheren Demonstration, dass Ca2 + Erhebungen in Astrozyten durch Lck-GCaMP6f häufiger als die durch OER-GCaMP6f7 erkannt wurden und legt nahe, dass dieser Begriff auch auf die einzellige Ebene.
Spontane Ca2 + Höhen von Lck-GCaMP6f in unreifen Ratte hippocampal Neuronen (10 DIV) wurden bei 2 Hz (Abb. 5A und Video 6) gesehen. Die Zeit-Kurse von ΔF/F0 in fünf verschiedenen ROIs legen nahe, dass diese Ca2 + Erhebungen vor Ort auf der subzellulären Domänen beschränkt sind. Abbildung 5 b (Video 7) zeigt die Ca2 + Antworten in reife Maus hippocampal Neuronen (30 DIV) mit OER-GCaMP6f-Ausdruck AAV-Vektoren infiziert. Neuronen wurden mit 100 µM DHPG, stimuliert die Agonisten für metabotropen Glutamatrezeptoren, induzierende Ca2 + Release ist. DHPG-induzierte Ca2 + Freigabe durch OER-GCaMP6f wurde erkannt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Abbildung 1: Diagramm mit Membran-gezielte GECIs. Schematische Darstellung der Plasmamembran ausgerichtete GECIs (Lck-GCaMP6f und Lck-RCaMP2) und äußeren ER Membran-bezogenen GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm für hippocampal und kortikalen Zelle Vorbereitung, Plasmid Transfektion und AAV Infektion. Die mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentativ, frisch vergoldeten DIV-6 kortikale Zellen (links) und Zellen aus dem gefrorenen bestand (rechts) wiederbelebt. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiel für die gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. (A) schematische Darstellung der Signaltrennung mit Bild-splitting-Optik. Die gleiche Sichtfeld für Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f wird gleichzeitig an der Kamera projiziert. Eine repräsentative Aufnahme erworben bei 10 Hz mit einer CMOS-Kamera finden Sie in Video 1, und ein Bild von dieser Aufnahme ist in zentrale A (rechts) angezeigt. (B) Pseudo-farbige Bilder von ΔF/F0 für Lck-GCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Histamin (seiner, 1 µM) wurde am 0 S. (C) Vertreter normalisierten ΔF/F0 zeitlichen Verlauf der Lck-GCaMP2 (Magenta) und OER-GCaMP6f (grün) hinzugefügt. Daten wurden auf den maximalen ΔF/F0-Wert für jedes Grundstück normalisiert. Der graue Balken zeigt den Zeitpunkt seines Antrags. Daten wurden mit einer maßgeschneiderten Software TI Workbench15analysiert. Maßstabsleiste = 50 µm (mikroskopische Bild).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Abbildung 4: Spontane Ca2 + Höhe in Astrozyten überwacht Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f. (A) Vertreter hippocampal und (B) kortikale Astrozyten transfiziert mit Lck-RCaMP2 (oben) und OER-GCaMP6f (unten). Kortikale Zellen wurden aus gefrorenen Stammkulturen wiederbelebt. LCK-RCaMP2 und OER-GCaMP6f Bilder wurden nacheinander in derselben Zelle, bei 2 Hz mit einer EM-CCD Kamera erworben. Die Grundstücke auf dem linken erscheinen die Zeit Kurse von ΔF/Nutzun ROIs gemessen in das mikroskopische Bild angegeben. Daten wurden mit TI-Workbench analysiert. Aktuelle Filme werden in Video 2, Video 3 Video 4und 5 Videobereitgestellt. Die Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). Die Baseline Drift schlägt die Änderungen in der globalen Ca2 + Ebene in der Zelle.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Abbildung 5: Beispiele für Ca2 + Bildgebung in Neuronen mit Lck-GCaMP6f und OER-GCaMP6f. (A) repräsentative Ratte hippocampal Neuronen Lck-GCaMP6f DIV 10 (links) und Grundstücke zeigt die Zeit, die Kurse von ΔF/F0 gemessen in ROIs (gelbe Kreise) angegeben worden im Bild (rechts) zum Ausdruck zu bringen. Die Zahlen in den zeitlichen Verlauf entsprechen die ROI-Zahlen im Bild. Beachten Sie, dass das zeitliche Muster der Ca2 + Höhe unterschiedlich zwischen den verschiedenen Regionen von Interesse ist. Die Baseline Drift schlägt die Erhöhung der globalen Ca2 + Ebene in diesem Neuron. (B) ein Beispiel für reife Maus hippocampal Neuronen (DIV 30) infiziert mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (links). Die Zeit, die Kurs-Plot von ΔF/F0 gemessen Ca2 + Antwort bis 100 µM zeigt angewendet (RS) - 3,5 - Dihydroxyphenylglycine (DHPG) auf das Timing durch die graue Leiste angezeigt. Gelbe Kreise zeigen die Position des ROIs, der zeitlichen Verlauf ermittelt wurden. Die Bilder wurden bei 2 Hz mit einer gekühlten CCD Kamera (zentrale A) oder einer EM-CCD-Kamera (Gruppe B) erworben und mit TI-Workbench analysiert. Maßstabsleiste = 20 µm (mikroskopische Bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: Beispiel für gleichzeitige Darstellung von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen. Repräsentative Aufnahme bei 10 Hz erworben und in Abbildung 3dargestellt. Maßstabsleiste = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abb. 4A), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 3. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontane Ca2 + Transient in OER-GCaMP6f im Hippokampus Astrozyten beobachtet. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abb. 4A), im gleichen Sichtfeld als Video 2erworben. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontane Ca2 + Transient in Lck-RCaMP2 in einer kortikalen Astrozyten beobachtet repräsentative Aufnahme erworben bei 2 Hz (Abbildung 4 b), aufgenommen im gleichen Sichtfeld als Video 5. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontane Ca2 + Transient beobachtet in OER-GCaMP6f in einer kortikalen Astrozyten. Repräsentative Aufnahme bei 2 Hz (Abbildung 4 b), im gleichen Sichtfeld als Video 4erworben. Die Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Beispiel für Ca2 + Bildgebung in einem hippocampal Ratte Neuron (DIV 10) von Lck-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + -Signale aufgezeichnet bei 2 Hz (Abb. 5A). Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + Release in einem Maus hippocampal Neuron (DIV 30) mit dem Ausdruck OER-GCaMP6f. Beispiel für neuronale Ca2 + Signale aufgezeichnet in einem Maus hippocampal Neuron mit OER-GCaMP6f Ausdruck AAV Vektoren (Abb. 5 b) infiziert. Das Neuron wurde angeregt, mit 100 µM Dihydroxyphenylglycine (DHPG) angewendet um 30 s, Ca2 + Entlassung aus der Notaufnahme zu erwähnen. Maßstabsleiste = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.</a>

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Die Zerlegung von Calciumsignalen bei subzellulärer Auflösung ist einer der wichtigsten Schritte zur Dekodierung intrazellulärer Calciumsignale, die das biologische Ausgangsphänomen bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt eine neue Calcium-Bildgebungsmethode, die die Überwachung des Moments des Kalziumzuflusses und der Kalziumfreisetzung ermöglicht. Dieses Protokoll gilt für alle Zelltypen, die die Expression genetisch kodierter Kalziumindikatoren ermöglichen.Wir glauben, dass unsere Methode das Potenzial hat, auf die Sezieren von Kalziumsignalen bei der subzellulären Auflösung bei lebenden Tieren in der Laborkultur erweitert zu werden. Um das Verfahren zu demonstrieren, hilft Matsumi Hirose, ein Techniker aus unserem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie 18 Millimeter Durchmesser Glasabdeckung schlupf in jedem Brunnen einer 12 Brunnenplatte.Verwenden Sie sterilisiertes Wasser und bereiten Sie 12,5 Milliliter einer 0,4%PEI-Lösung für jede verwendete 12 Wellplatte vor. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter der PEI-Lösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sich unter den Deckelzetteln keine Blasen befinden. Inkubieren Sie über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Verwenden Sie am nächsten Tag einen Aspirator, um die PEI-Lösung zu entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter sterilisiertes Wasser hinzu und schütteln Sie die Platte so, dass die PEI-Lösung zwischen Deckelschlupf und Platte gründlich ausgewaschen wird. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei weitere Male mit frischem sterilisiertem Wasser.Nach der letzten Wäsche, das Wasser aus jedem Brunnen vollständig aspirieren. Verwenden Sie ein ultraviolettes Licht, um die Abdeckungsrutschen für mindestens 15 Minuten zu trocknen und zu sterilisieren. Die PEI-beschichtete Schale kann bis zu zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden.Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, beleuchten Sie die Gerichte mit dem ultravioletten Licht für 15 Minuten, kurz vor Dem Gebrauch. Fügen Sie fünf Milliliter steriles destilliertes Wasser in den Raum zwischen den Brunnen, um verdunsten des Kulturmediums zu verhindern. Waschen Sie zunächst die Kortizes mit Inkubationskochin.Dann inkubieren Sie die Kortiken mit Trypsin und DNAse in Inkubationssaline für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Dann waschen Sie die Kortizes dreimal mit eiskalter Inkubationskochin. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie zwei Milliliter Beschichtungsmedium mit 150 Mikroliter DNAse I Lager ergänzt.Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie zwanzigmal oder weniger Pipetten und filtern Sie die Zellen durch ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 Mikrometern. Als nächstes waschen Sie das Zellsieb mit 20 Milliliterdes Beschichtungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten die Zellen mit 20 Millilitern des Waschmediums waschen.Verdünnen Sie die kortikalen Zellen mit einem Beschichtungsmedium auf eine Dichte von 140 000 lebensfähigen Zellen pro Milliliter. Dann fügen Sie einen Milliliter der verdünnten Zellsuspension zu den PEI-beschichteten Abdeckungsscheinen in den 12 Brunnenkulturplatten hinzu. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage.Wenn die Zellen stabil sind, zwei bis drei Tage nach der Beschichtung, ändern Sie das Kulturmedium auf das Wartungsmedium. Für die Herstellung von gefrorenen Zellvorräten, spinn die Zelle, mit einem Schwenkrotor, um die Zellen bei 187 mal G für drei Minuten zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie das Kryokonservierungsmedium hinzu, das bei vier Grad Celsius gehalten wird, um eine Zelldichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten.Aliquot einen Milliliter der Zellsuspension in kryogene Röhren. Legen Sie die Rohre in einen Zellgefrierbehälter mit einer Gefrierrate von minus einem Grad Celsius pro Minute, bis eine Temperatur von minus 80 Grad Celsius erreicht ist. Den Gefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank geben.Um die gefrorenen Zellen wiederzubeleben, erwärmen Sie das Waschmedium und das Pflegemedium für gefrorene kortikale Zellen. Als nächstes tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Verdünnen Sie die Zellen mit vorgewärmtem Waschmedium und Zentrifuge mit einem Schwenkrotor bei 187 mal G für drei Minuten.Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Waschmedium wieder auf und messen Sie die lebensfähige Zelldichte. Verdünnen Sie dann die Zellen mit dem Erhaltungsmedium für gefrorene kortikale Zellen, um eine Zelldichte von 300 000 Zellen pro Milliliter zu ergeben. Einen Milliliter dieser Zellsuspension in die Brunnen der PEI-beschichteten 12 Brunnenplatten geben.Zur Transfektion drei bis acht Tage nach der Beschichtung, beschriften Sie zwei Röhren, eine für Plasma-DNA und die andere für das Transfektionsreagenz. Fügen Sie 50 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Brunnen zu jedem Rohr hinzu. Fügen Sie 0,5 Mikrogramm Plasma-DNA pro Abdeckungsschlupf und einen Mikroliter Ergänzung mit Transfektionsreagenz für Neuronen, pro Brunnen in die Plasma-DNA-Röhre.Für die Co-Transfektion von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f, mischen Sie 0,5 Mikrogramm jedes Plasmids und einen Mikroliter Ergänzung in 50 Mikroliter reduzierten Serummedium pro Brunnen. Als nächstes fügen Sie dem Transfektionsreagenz tube einen Mikroliter Transfektionsreagenz pro Brunnen hinzu. Wirbel beide Rohre für ein bis zwei Sekunden.Fügen Sie dann die Transfektionsreagenz-Mischung in die DNA-Mischung ein. Rohrleitung vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Laden Sie diese Mischung tropfenweise auf die Zellen.Inkubieren Sie in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Tage, bis die Markerproteine exprimiert werden. Mischen Sie L und O, um die AAC-Infektion zu machen. Fügen Sie der gemischten Neuron-Astrozyten-Kultur drei Mikroliter AAC pro Brunnen hinzu.Schaukeln Sie die Schale sanft zu mischen. Bewahren Sie die Kultur ein bis zwei Wochen, bis die GECIs zum Ausdruck gebracht werden. Montieren Sie zunächst den Abdeckschein mit den mit Lck-RCaMP2 und OER-CaMPG6f transfizierten Zellen in die Aufnahmekammer des Mikroskops.Fügen Sie 400 Mikroliter des Bildmediums hinzu und legen Sie einen Deckel auf die Kammer. Wählen Sie den Filtersatz für GCaMP6f und die Lichtquelle aus. Suchen Sie die Astrozyten, die OER-GCaMP6f exdrücken.Wählen Sie als Nächstes einen Filtersatz und eine Lichtquelle für RCaMP2 aus und bestätigen Sie, ob Lck-RCaMP2 in den gleichen Astrozyten ausgedrückt wird. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von Lck-RCaMP2 bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. Danach ändern Sie den Filtersatz zurück zu GCaMP6f.Zeichnen Sie Zeitrafferbilder von OER-GCaMP6f bei zwei Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten. In dieser Studie werden Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f in HeLa-Zellen exprimiert und beide Signale wurden 24 Stunden nach der Transfektion gleichzeitig mit Bildspaltoptik aufgezeichnet. Durch die Zugabe von Histamin erhöhte sich die Signalintensität von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f.Die von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gemeldeten Zeitkurse der Calciumionenhöhe werden in den gleichen Interessengebieten verglichen. Beide Sensoren berichten von einer oszillierenden Kalziumionenhöhe. Und beide zeigen den gleichen Zeitverlauf in zwei der fünf untersuchten Zellen.Die von Lck-RCaMP2 dargestellten Calciumionenhöhen bleiben jedoch in den anderen Zellen auf dem höheren Niveau als OER-GCaMP6f. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Calciumionenhöhe in der Nähe der Plasmamembran verlängert wird, während sie früher um den ER beendet wird, das die Quelle dieses Kalziumionensignals ist, das durch Histaminstimulation induziert wird. Spontane Calciumionensignale von Astrozyten in der Neuron-Astrozyten-Mischkultur von Ratten-Hippocampi und Kortiken werden von Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f gezeigt.Spontane Kalziumionenerhöhungen sind nur im astrozytischen Prozess sichtbar, nicht am Zellkörper, der mit früheren Berichten übereinstimmt. Spontane Calciumionenerhöhungen von Lck-GCaMP6f in unreifen Hippocampus-Neuronen der Ratte sind bei zwei Hertz zu sehen. Die Zeitkurse für fünf verschiedene Interessensgebiete deuten darauf hin, dass diese Erhebungen lokal auf die subzellulären Domänen beschränkt sind.Reife Maus-Hippocampus-Neuronen, die mit OER-GCaMP6f-Expression AAV-Vektoren infiziert sind, zeigen Kalziumionenreaktionen als Reaktion auf die Zugabe von DHPG. Bei der Kalzium-Bildgebung ist die Anregungsstärke der kritischste Faktor. Bitte halten Sie das Anregungslicht so gering wie möglich, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden.Die Quelle der Calciumsignale kann von Pomakorzi mit spezifischen Inhibitoren an Kalziumkanälen weiter bestätigt werden. Die Dekodierung von Kalziumsignalen, um einen bestimmten Ausgang zu evozieren, war eine grundlegende biologische Frage. Diese Kalzium-Bildgebungstechnik ebnet den Weg, um die Vielfalt der intrazellulären Calciumsignale zu beschreiben.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Abbildungsintrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...