Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: יפן ומדעי הטכנולוגיה סוכנות (JST) / Precursory מחקר עבור עובריים מדע, טכנולוגיה (אוטם) (JPMJPR15F8, יפן); החברה יפן לקידום המדע (JSPS) / מעניק סיוע למחקר מדעי (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), טקדה קרן. המחברים תודה Haruhiko Bito (אוניברסיטת טוקיו) על מתן RCaMP2 ו ארתור J.Y. הואנג, תומאס מקיו (RIKEN CBS) למתן AAV וקטורים ולקבלת הוראות לגבי AAV הכנה. המחברים רוצה גם להודות עורכים-יומן של דמיינו הניסויים על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מגוון ביולוגי פלטי מבוצעים על ידי Ca2 + אותות. Ca2 + הוא שליח איתות תאיים רב-תכליתי. פענוח Ca2 + אותות כדי לעורר את תפוקות ספציפיים כבר שאלה ביולוגית בסיסית, Ca2 + הדימות לתאר את המגוון של Ca2 + אותות נדרשים. פרוטוקול מפורט כיום מאפשרת הגילוי של Ca2 + אותות ברורים קרום פלזמה ואר (איור 3 ו- 4 באיור), רשות מקומית2 + microdomains בתוך תא (איור 4 , איור 5). זה תורם המתארת את המגוון של Ca2 + אותות תאיים. הפתרון הזמני של Ca2 + מאותת היה שיפור גם על ידי מיקוד GECIs קרום פלזמה, ER, כי זה יכול למנוע את השפעת דיפוזיה תלת מימדי של Ca2 + , GECIs את עצמם, ויש לו את היכולת לזהות רגע של Ca2 + זרם או Ca2 + שחרור, אשר מתרחשת על הקרום.
הפרוטוקול יש מספר מגבלות. למשתמשים יש לזכור כי האותות שזוהו הן הסיכום של "רגע של Ca2 + זרם או שחרור" ומתפזרת "Ca2 + החוצה מן המקור2 + Ca מקורי", במיוחד עבור Ca גדולים2 + אותות. לדוגמה, למרות שלו גירוי בתאי הלה מעורר Ca2 + שחרור מחדר המיון, רשות האישורים הנובעת שלו2 + אותות מזוהים לא רק על ידי מיון, ממוקדות השניה-GCaMP6f, אלא גם על ידי פלזמה-ממברנה-ממוקד Lck-RCaMP2 (איור 3). מגבלה נוספת היא כי ייתכן קמע תבנית התנועה של Ca2 + אותות לא ייתכן ה דטרמיננטה היחידה של הפלט של Ca2 + אותות. חלוקת אפקטור במורד הזרם חלבונים (כגון Ca2 +-kinases תלויים ו phosphatases) יכול להיות גם קביעת פקטור2. לפענח לגמרי את Ca2 + אותות תאיים, ניתוח התנהגות אנזים במורד הזרם, אשר אינו מכוסה ב פרוטוקול זה, הוא הכרחי.
אחד ההיבטים הקריטיים ביותר עבור Ca מוצלחת2 + הדמיה הוא הרכישה וההתקנה תמונת הדמיה תנאים, כמו גם לגבי לימודי הדמיה לחיות אחרות. בעבר הראינו כי Ca2 + תגובות בתא הן תלויות במידה רבה על משך ועוצמת של עירור ועל תנאי רכישת התמונה, כולל חשיפה הזמן ורכישת תדירות16. עירור תאורה כוח הוא הגורם הקריטי ביותר, זה יכול לגרום רעילות אור ו- photobleaching של GECIs. צריך להיות מוטבת התנאים הקלטה של זמן החשיפה, הקלטה תדר, עוצמת האור עירור ומשך של הקלטה לפי מטרת הניסוי. מומלץ להפחית את זמן החשיפה ואת עוצמת האור עירור ככל האפשר להימנע photobleaching, phototoxicity אל התא. תדירות הקלטה ושל משך ההקלטה צריך להספיק לסקר את Ca2 + העלאת הריבית אבל יש להשאירו נמוך ככל האפשר להימנע גם photobleaching ו- phototoxicity. אנו ממליצים קביעת תדירות הקלטה ומשך קודם ומיטוב עוצמת האור וזמן החשיפה כך photobleaching של GECIs ממוזער. גורם חשוב נוסף הוא רמת הביטוי GECIs. GECIs יש Ca2 +-אגירה אפקט כפי שהם Ca2 +-מחייב חלבונים. לכן, ביטוי של GECIs יוצרת חציצה של Ca2 +, אשר הכרחי מבחינה פיזיולוגית עבור התאים. כמות GECI הביטוי צריך להיות ממוזער כדי להימנע הדמיה התאים לבטא כמויות גבוהות של GECIs. 
  לסיכום, ניתוח Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular הוא אחד הצעדים החשובים ביותר עבור פענוח סי אי2 + אותות תאיים הקובעות את התופעה הביולוגית של פלט. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה עבור ניתוח Ca2 + אותות כדי לתאר את הגיוון בין האותות האלה. עד מהרה, בטכניקה זו הוא מוגבל עבור ניסויים במבחנה. עם זאת, מזל-GCaMP6f נמצא כבר בשימוש עבור Ca2 + הדמיה ויוו עכברים17, השניה-GCaMP6f אושרה לפקח Ca2 + אותות ויוו בנוירונים מנוע וי ב- C. elegans7. לכן, מיקוד GECIs בתוך התא subcellular יש פוטנציאל להיות מורחבת ויוו הדמיה בעתיד, ובכך ולאפשר Ca2 + לנתיחה ויוו.

Ca2 + אותות מייצגים את העלאת רמת הריכוז2 + Ca תאיים. Ca2 + הוא השליח השני אוניברסלי עבור התאים האיקריוטים. באמצעות Ca2 +, התאים לתפקד באמצעות מגוון תאיים איתות המסלולים, זירוז פלטי ביולוגיים שונים. לדוגמה, בנוירונים, שלפוחית סינפטית השחרור במסוף presynaptic, ביטוי גנים גרעין ולאחר אינדוקציה של פלסטיות סינפטית ב postsynapse מוסדרים על ידי Ca2 + אותות ברורים במדויק להפעיל המתאים אנזימים במורד הזרם באתרים נכון ועם תזמון מדויק1.
דפוסים מסוימים ייתכן של Ca2 + איתותים להפעיל את אנזימי במורד הזרם הספציפי. Ca2 + מאותת מופקים על ידי התיאום בין שני Ca2 + מקורות שונים: Ca2 + זרם מרחב חוץ-תאית, Ca2 + לשחרר רשתית תוך-פלזמית (ER), אשר משמש Ca תאיים2 + לאחסן. משמעותית ייתכן Ca2 + איתות התבנית לזירוז פונקציה תא ספציפי נתמך גם על ידי nanodomains של 10 – 100 מיקרומטר Ca2 + שנוצר באזור Ca2 + ערוצי קרום פלזמה או קרום אר2. חשוב, המקור של Ca2 + אותות הוא אחד הגורמים הקריטיים ביותר בקביעת הפלט ביולוגי במורד הזרם. בנוירונים, Ca2 + זרם ושחרור2 + Ca יש מול השפעות על קיבוץ באשכולות של גאמא אמינו בוטירית (GABA)של קולטנים (GABAAR)-הסינפסות GABAergic, אשר אחראית על עיכוב של דעתנית עצביים3. Ca2 + זרם מלווה על ידי עירור עצביים מסיבית המניע את הפיזור של אשכולות GABAAR סינפטית, ואילו Ca מתמידים2 + שחרור מחדר המיון מקדמת את קיבוץ באשכולות של ר'אגאבא סינפטית. קבוצות אחרות דיווחו גם כי הכיוון כוונון של קונוסים הצמיחה תלויה באופן ביקורתי מקור האות2 + Ca: Ca2 + זרם מעוררת סלידה, בעוד Ca2 + שחרור מנחה את המשיכה של הגידול עצביים קונוס4. לכן, כדי להבין באופן מלא את Ca2 + מסלולי שבבסיס פלטי סלולרית ספציפית איתות, חשוב לזהות את המקור של Ca2 + אותות דרך המתאר Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים Ca2 + הדמיה שיטה לדווח Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular, אשר מאפשר הערכת המקורות Ca2 + אות (איור 1). Ca2 + microdomains מתחת קרום פלזמה בהצלחה המפוקחים על-ידי מקודדים גנטית Ca2 + אינדיקטורים (GECIs) המיועד קרום פלזמה באמצעות ההחזקה של האות קרום פלזמה-לוקליזציה Lck בתוך Src קינאז ל N-טרמיני GECIs5. כדי לזהות את Ca2 + אות הדפוס באזור המיון ברזולוציה יותר יכולות, לאחרונה פיתחנו השניה-GCaMP6f, באיזה GCaMP6f6 מטרות המיון הממברנה החיצונית, באמצעות טראנסממברנלי את חדר המיון. השניה-GCaMP6f יכול לדווח ברגישות Ca2 + השחרור מחדר המיון ברזולוציה ייתכן טוב יותר מאשר GCaMP6f nontargeted המקובלת ב- COS-7 תאים7 ו- HEK293 תאים8, על ידי הימנעות פעפוע של Ca2 + ו- GECIs . אנחנו גם אישר כי Ca ספונטנית2 + גובה ב בתרבית האסטרוציטים בהיפוקמפוס שדווחו על-ידי השניה-GCaMP6f הראו דפוס ייתכן שונה בהשוואה זה בפיקוח, ממוקדות קרום פלזמה GCaMP6f (מזל-GCaMP6f)7 ,9, המציין כי Ca2 + הדמיה עם השניה-GCaMP6f בשילוב עם מזל-GCaMP6f תורם הקרע של Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular לזהות את המקורות שלהם.
תוך זמן קצר, אנו מפרטים את פרוטוקול Ca2 + אות רוברט הלה תאים, תא עצב-אסטרוציט לערבב תרבויות מצופה על coverslips זכוכית דקה. Ca2 + טכניקת דימות עם GECIs שצוין כאן, מזל-GCaMP6f, פלזמה-ממברנה-ממוקד RCaMP210 (מזל-RCaMP2), ואת השניה-GCaMP6f (איור 1) חלים על כל התאים בו ניתן לבטא את GECIs האלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

יון סידן (Ca2 +) הוא מולקולה messenger תאיים אוניברסלי כוננים מרובים איתות המסלולים, שמוביל פלטי ביולוגי מגוונות. התיאום של Ca שני2 + אות מקורות – "Ca2 + זרם" מ שנמצא מחוץ לתא "Ca2 + שחרור" מתאיים Ca2 + חנות (ER) רשתית תוך-פלזמית – נחשבת ביסוד דפוסי-עתיים מגוונות Ca 2 + איתותים שגורמים מרובות פונקציות ביולוגיות בתאים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר Ca2 + הדמיה שיטה חדשה המאפשר פיקוח הרגע של "Ca2 + זרם" ולשחרר "Ca2 + ". השניה-GCaMP6f הוא מקודד גנטית Ca2 + מחוון (GECI) הכוללת GCaMP6f, אשר מיועד הממברנה החיצונית ER. השניה-GCaMP6f יכולים לפקח על Ca2 + שחרור ברזולוציה הטמפורלית גבוהה יותר מאשר GCaMP6f קונבנציונלי. בשילוב עם GECIs, ממוקדות קרום פלזמה, ניתן לתאר-עתיים Ca2 + אות התבנית ברזולוציה subcellular. Subcellular במיקוד Ca2 + הסימנים המתוארים כאן, באופן עקרוני, זמין עבור כל סוגי תאים, אפילו בשביל ויוו הדמיה של נוירונים Caenorhabditis elegans . ב פרוטוקול זה, אנו להציג Ca2 + הדמיה בתאים שורות תאים, נוירונים, תאי גליה בתרבויות העיקרי הפומבית, לתאר את הכנת מלאי קפוא של החולדה הנוירונים קורטיקלית.

מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f באו לידי ביטוי בתאים הלה, שני אותות נרשמו בו זמנית באמצעות פיצול התמונה אופטיקה, 24 שעות לאחר תרביות תאים (איור 3 א ו- Video 1). התמונות נרכשו ב- 10 Hz. היסטמין (שלו, 1 מיקרומטר), אשר גורם Ca2 + השחרור מחדר המיון, נוספה במהלך ההקלטה. על היישום שלו, עוצמת האות של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f גדל, כפי שמוצג על ידי הצגת מדומה ΔF/F0, אשר מייצג את השינוי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הראשונית (איור 3B). הקורסים זמן של Ca2 + העלאת רמת הרשאות (ΔF/F0) דיווחו על ידי מזל-RCaMP2 השניה-GCaMP6f הושוו באזור באותו עניין (ROI) (איור 3C). הערכים ΔF/F0 היו מנורמל לערכי שיא כדי לאפשר זמן הקורס ההשוואה בין שני GECIs שונים, אשר יש רמות ביטוי שונה, הפצות. שני חיישנים דיווח תנודה דמוי Ca2 + גובה. מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f הראו באותו מסלול הזמן להעלאה2 + Ca בשני תאים בין תא חמש בחן (איור 3C, רועי 1 ו- 3). עם זאת, Ca2 + הגבהים שמוצג על ידי מזל-RCaMP2 נשאר ברמה גבוהה יותר לעומת המוצג על-ידי השניה-GCaMP6f (איור 3 C, רועי 2, 4 ו- 5). התוצאות מצביעות על כך Ca2 + גובה מוארך בקרבת קרום פלזמה, בעוד שהסתיים קודם לכן סביב חדר המיון, אשר הוא המקור של Ca2 + האות הזה המושרה על ידי גירוי שלו.
Ca ספונטנית2 + האותות האסטרוציטים בתוך הנוירון-אסטרוציט מעורב תרבות של עכברוש hippocampi (איור 4A) ו cortexes (איור 4B) הוצגו על ידי מזל-RCaMP2 השניה-GCaMP6f (איור 4, סרטון 2, וידאו 3 , וידאו 4, וידאו 5). תרבויות קורטיקלית היו לתחייה מן המלאי קפואים זה הוכן כפי שמתואר פרוטוקול זה. אותות Lck-RCaMP2 ו- GCaMP6f השניה נרשמו ברצף ב 2 הרץ את התאים אותו. ROIs שלושה היו שנבחרו באזור הראה Ca2 + העלאת על ידי כל GECI, מהלך הזמן של ΔF/Fהבסיס (קרי, עוצמת קרינה פלואורסצנטית) משתנה מעוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע בתקופת הקלטת כולה (נבסיס ). כאשר הבסיס הוא יציב Ca2 + הגבהים שכיחים פחות, Fהבסיס הופכת תוכנית בסיסית שימושית לזיהוי Ca2 + העלאת אירועים. Ca ספונטנית2 + הגבהים היו גלויים רק את תהליך astrocytic, לא כלפי גוף התא. התוצאה זו עקבית עם הדוחות הקודמים astrocytic ספונטנית Ca2 + אותות על ידי אחרים GECIs במבחנה מטמיעים13 , ויוו14. האסטרוציטים בהיפוקמפוס והן קורטיקלית, Ca2 + הגבהים שמוצג על ידי מזל-RCaMP2 (למעלה) היו תכופים יותר מאלו המוצגות על-ידי השניה-GCaMP6f. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם ההדגמה. הקודם שלנו כי Ca2 + הגבהים ב האסטרוציטים עקב Lck-GCaMP6f אותרו בתדירות גבוהה יותר מאשר אלה בשל השניה-GCaMP6f7 , מציע כי מושג זה הוא גם ישים- רמת תא בודד.
ספונטני Ca2 + הגבהים ידי Lck-GCaMP6f בלא בוגר החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס (10 DIV) נראו ב 2 הרץ (איור 5 א ווידאו 6). הקורסים זמן של ΔF/F0 ב חמש ROIs שונים מראים כי Ca2 + הגבהים אלה נכלאים באופן מקומי לתחומים subcellular. איור 5B (וידאו 7) מראה Ca2 + התגובות עכבר בוגר נוירונים בהיפוקמפוס (30 DIV) נגוע השניה-GCaMP6f-ביטוי AAV וקטורים. נוירונים היו מגורה עם 100 מיקרומטר DHPG, אשר הוא אגוניסט עבור metabotropic רצפטורים גלוטמט, גרימת Ca2 + שחרור. DHPG-induced Ca2 + לשחררו בשל השניה-GCaMP6f זוהה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> איור 1: דיאגרמה המציגה ממוקדות ממברנה GECIs. תרשים סכמטי של קרום פלזמה, ממוקדות GECIs (מזל-GCaMP6f ו- Lck-RCaMP2), חדר המיון החיצוני ממברנה במיקוד GCaMP6f (השניה-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> איור 2: תרשים זרימה עבור תאים בהיפוקמפוס ואת קורטיקלית הכנה, תרביות תאים פלסמיד AAV זיהום. הדימויים מיקרוסקופיים נציג, טרי מצופה DIV-6 קורטיקלית תאים (משמאל), קם לתחייה תאים מן המלאי קפואים (מימין). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> איור 3: דוגמה של ההדמיה סימולטני של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בתאים הלה. (א) ייצוג סכמטי של האות ההפרדה עם פיצול התמונה אופטיקה. שדה הראייה באותו מזל-RCaMP2, השניה-GCaMP6f במקביל מוקרן על המצלמה. הקלטה נציג שרכשה ב-10 הרץ מצלמת CMOS מסופק 1 וידאו, תמונה אחת מתוך הקלטה זו מוצג בחלונית A (מימין). (B) תמונות צבע מדומה של ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (למעלה), השניה-GCaMP6f (למטה). היסטמין (שלו, 1 מיקרומטר) נוספה ב 0-ס' (C) נציג מסלול הזמן ΔF/F0 המנורמל של Lck-GCaMP2 (מגנטה), השניה-GCaMP6f (ירוק). הנתונים היו מנורמל לערך ΔF/F0 המרבי עבור כל מגרש. שהפסים לציין את התזמון של היישום שלו. הנתונים נותחו עם תוכנה בהזמנה אישית TI עבודה, שעליו מונחים15. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> איור 4: ספונטני Ca2 + העלאת ברמת האסטרוציטים פיקוח לביטוי Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f. (א) נציג בהיפוקמפוס, האסטרוציטים בקליפת המוח (B) transfected עם מזל-RCaMP2 (למעלה), השניה-GCaMP6f (למטה). תאים קורטיקליים היו לתחייה מתרבויות מניות קפוא. Lck-RCaMP2 ותמונות השניה-GCaMP6f נרכשו ברצף באותו תא, ב 2 הרץ, עם מצלמה EM-CCD. החלקות בתכנית השמאלי הקורסים זמן של ΔF/Fbase נמדד ROIs מצוינת בתמונה מיקרוסקופית. הנתונים נותחו עם TI עבודה, שעליו מונחים. סרטים בפועל הינם מסופקים בכל סרטון 2, 3 וידאו, וידאו 4ו- 5 וידאו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית). הסחף בסיסית מציע את השינויים ב- Ca2 + ברמה הגלובלית בתא.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> איור 5: דוגמאות של Ca2 + הדמיה בנוירונים עם מזל-GCaMP6f, השניה-GCaMP6f. (א) נציג עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס לבטא Lck-GCaMP6f ב- 10 DIV (משמאל) וחלקות מציג הפעם קורסים של ΔF/F0 נמדד על ROIs (מעגלים צהובים) כבר ציינו כי בתמונה (מימין). המספרים מסלול הזמן תואמים למספרים רועי בתמונה. שימו לב כי התבנית הטמפורלי של Ca2 + העלאת שונה בין האזורים השונים של ריבית. הסחף בסיסית מרמזת על עליית Ca2 + ברמה הגלובלית בנוירונים הזה. (B) דוגמה של עכבר בוגר נוירונים בהיפוקמפוס (DIV 30) נגוע השניה-GCaMP6f ביטוי AAV וקטורים (משמאל). הזמן קורס עלילת של ΔF/F0 נמדד מציגה את Ca2 + בתגובה 100 מיקרומטר (RS) - 3.5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) להחיל על התזמון המוצגות על-ידי השורה האפורה. עיגולים צהובים מראים את המיקום של ROIs איפה מסלול הזמן הושג. התמונות היו רכשה 2 הרץ עם מצלמה מקורר-CCD (לוח א') או מצלמת EM-CCD (לוח ב') וניתח עם TI עבודה, שעליו מונחים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (תמונה מיקרוסקופית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> וידאו 1: דוגמה של הדמיה סימולטני של Lck-RCaMP2, השניה-GCaMP6f בתאים הלה. הקלטה נציג רכשה ב-10 הרץ, המוצג באיור3. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> וידאו 2: ספונטני Ca2 + ארעי שנצפתה ב- Lck-RCaMP2 אסטרוציט hippocampal. נציג הקלטה רכשה 2 הרץ (איור 4A), נרשמו באותו שדה הראייה כמו וידאו 3. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> וידאו 3: ספונטני Ca2 + ארעי שנמדדו השניה-GCaMP6f ב אסטרוציט hippocampal. הקלטה נציג רכשה 2 הרץ (איור 4A), בתוך שדה הראייה אותו כ- 2 הסרטונים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> וידאו 4: Ca ספונטנית2 + ארעי שנצפתה ב- Lck-RCaMP2 אסטרוציט בקליפת המוח נציג הקלטה רכשה 2 הרץ (איור 4B), נרשמו באותו שדה הראייה כמו וידאו 5. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> וידאו 5: ספונטני Ca2 + ארעי שנמדדו השניה-GCaMP6f ב אסטרוציט קורטיקלית. הקלטה נציג רכשה 2 הרץ (איור 4B), בתוך שדה הראייה אותו כ- 4 וידאו. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> וידאו 6: דוגמה Ca2 + הדמיה של נוירון בהיפוקמפוס עכברוש (DIV 10) מאת מזל-GCaMP6f. דוגמה של Ca עצביים2 + מאותת להקליט 2 הרץ (איור 5A). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> וידאו 7: Ca2 + שחרור העכבר בהיפוקמפוס נוירון (DIV 30) המבטאת השניה-GCaMP6f. דוגמה של Ca2 + אותות עצביים טלקוה העכבר נוירון בהיפוקמפוס נגוע השניה-GCaMP6f ביטוי AAV וקטורים (איור 5B). הנוירון זורז עם 100 dihydroxyphenylglycine מיקרומטר (DHPG) חלה בגיל 30 s כדי לעורר Ca2 + השחרור מחדר המיון. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור Ca2 + הדמיה של נוירונים ותאי גלייה, המאפשרת את הקרע של Ca2 + אותות ברזולוציה subcellular. תהליך זה הוא החלים על כל סוגי תאים לאפשר הביטוי של Ca מקודדים גנטית2 + מחוונים.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

הניתוח של אותות סידן ברזולוציה תת-תאית, הוא אחד הצעדים החשובים ביותר לפענוח אותות סידן תוך-תאיים הקובעים את התופעה הביולוגית של התפוקה. פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה חדשה של סידן המאפשרת ניטור של הרגע עצמו של זרם הסידן ושחרור הסידן. פרוטוקול זה ישים על כל סוגי התאים המאפשר ביטוי של מחווני סידן מקודדים גנטית.אנו מאמינים כי לשיטה שלנו יש פוטנציאל להתרחב לניתוס אותות סידן ברזולוציה התת-תאית בבעלי חיים חיים בתרבות המעבדה. עוזר להדגים את ההליך יהיה Matsumi Hirose, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים 18 מילימטר קוטר כיסוי זכוכית להחליק בכל באר של צלחת 12 היטב.השתמש במים מעוקרים, והכן 12.5 מיליליטר של פתרון 0.4%PEI עבור כל צלחת באר 12 בשימוש. הוסף מיליליטר אחד של פתרון PEI לכל באר, ולהבטיח כי אין בועות מתחת לתעודות הכיסוי. דגירה במשך הלילה באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, השתמש בשואפתן כדי להסיר את פתרון PEI. מוסיפים מיליליטר אחד של מים מעוקרים לכל באר ומנערים את הצלחת כך שתסתדר PEI בין החלקת הכיסוי לצלחת נשטף ביסודיות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות עם מים מעוקרים טריים.לאחר הכביסה הסופית, שאפו את המים מכל באר לחלוטין. בתוך מכסה המנוע, השתמש באור אולטרה סגול לייבוש ועיקור החלקות הכיסוי למשך 15 דקות לפחות. ניתן לאחסן את המנה מצופה ה-PEI בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים.כאשר מוכנים להמשיך, להאיר את הכלים עם אור אולטרה סגול במשך 15 דקות, ממש לפני השימוש. מוסיפים חמישה מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים בחלל שבין בארות כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות. ראשית, לשטוף את קליפת המוח עם מלוחים דגירה.לאחר מכן, דגירה קליפת המוח עם טריפסין ו DNAse מלוחים דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את קליפת המוח שלוש פעמים עם קרח קר דגירה מלוחים. הסר את supernatant ולהוסיף שני מיליליטר של ציפוי בינוני בתוספת 150 microliters של מלאי DNAse I.נתק את התאים על ידי צינור עשרים פעמים או פחות ולסנן את התאים דרך מסננת תאים עם גודל נקבובית של 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לשטוף את מסננת התא עם 20 מיליליטר של המדיום ציפוי. להכנת מלאי תאים קפואים, לשטוף את התאים עם 20 מיליליטר של מדיום לשטוף.לדלל את התאים קליפת המוח עם ציפוי בינוני לצפיפות של 140 000 תאים קיימא למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של ההשעיה תא מדולל להחליקים כיסוי מצופה PEI ב 12 צלחות תרבות היטב. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים.כאשר התאים יציבים, יומיים עד שלושה ימים לאחר ציפוי, לשנות את מדיום התרבות למדיום התחזוקה. להכנת מלאי תאים קפואים, לסובב את התא, באמצעות רוטור נדנדה כדי צנטריפוגה התאים ב 187 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את העל-טבעי והוסיפו את מדיום ההקפאה, שנשמר בארבע מעלות צלזיוס, כדי להשיג צפיפות תאים של 10 מיליון תאים למיליליטר.Aliquot מיליליטר אחד של ההשעיה התא לתוך צינורות קריוגניים. מניחים את הצינורות לתוך מיכל הקפאת תא עם קצב הקפאה של מינוס מעלות צלזיוס לדקה, עד טמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס הוא הגיע. מעבירים את מיכל ההקפאה למקפיא במינוס 80 מעלות.כדי להחיות את התאים הקפואים, מחממים מראש את מדיום הכביסה ואת מדיום התחזוקה לתאי קליפת המוח הקפואים. לאחר מכן, להפשיר את התאים הקפואים במהירות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. מדללים את התאים בעדינות עם מדיום שטיפה מחומם מראש צנטריפוגה עם רוטור נדנדה ב 187 פעמים G במשך שלוש דקות.להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום לשטוף ולמדוד את צפיפות התא קיימא. לאחר מכן, לדלל את התאים עם אמצעי התחזוקה עבור תאים קליפת המוח קפואים, כדי להניב צפיפות תאים של 300 000 תאים למיליליטר. לוותר על מיליליטר אחד של ההשעיה התא הזה לתוך הבארים של PEI מצופה 12 צלחות היטב.עבור transfection שלושה עד שמונה ימים לאחר ציפוי, תווית שני צינורות, אחד עבור DNA פלזמה והשני עבור reagent transfection. הוסף 50 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת לכל באר, לכל צינור. הוסף 0.5 מיקרוגרם של DNA פלזמה לכל להחליק כיסוי אחד microliter של תוספת מלווה reagent transfection עבור נוירונים, לגם לצינור DNA פלזמה.עבור שיתוף transfection של Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f, לערבב 0.5 מיקרוגרם של כל פלסמיד מיקרוליטר אחד של תוספת ב 50 microliters של מדיום סרום מופחת לגם. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של רגנט transfection לכל באר לצינור reagent transfection. וורטקס שני הצינורות למשך דקה עד שתי שניות.לאחר מכן, מוסיפים את תערובת רגנט transfection לתערובת ה-DNA. בעדינות פיפטה לערבב ולטגר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לטעון את התערובת על התאים בצורה טיפה חכם.אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים עד חלבוני הסמן באים לידי ביטוי. מערבבים L ו- O כדי להפוך את זיהום AAC. הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של AAC ל באר לתרבות הנוירונים-אסטרוציטים המעורבת.בעדינות רוק המנה לערבב. לשמור על התרבות במשך שבוע עד שבועיים עד GECIs באים לידי ביטוי. תחילה לטעון את החלקת המכסה המכילה את התאים מתחלף עם Lck-RCaMP2 ו OER-CaMPG6f לתוך תא ההקלטה של המיקרוסקופ.מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה ומ מניחים מכסה על גבי התא. בחר את ערכת המסננים עבור GCaMP6f ואת מקור האור. אתר את האסטרוציטים המבטעים את OER-GCaMP6f.לאחר מכן, בחר ערכת מסננים ומקור אור עבור RCaMP2 ואשר אם Lck-RCaMP2 מבוטא באותם אסטרוציטים. הקלט תמונות של Lck-RCaMP2 בשתי הרץ במשך שתי דקות ושמור את נתוני ההדמיה. לאחר מכן, שנה את ערכת המסנן בחזרה לזה עבור GCaMP6f.הקלט תמונות של OER-GCaMP6f בשתי הרץ במשך שתי דקות ושמור את נתוני ההדמיה. במחקר זה, Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f באים לידי ביטוי בתאי HeLa ושני האותות נרשמו בו זמנית באמצעות אופטיקה פיצול תמונה, 24 שעות לאחר transfection. עם התוספת של היסטמין, עוצמת האות של Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f גדל.קורסי הזמן של גובה יון סידן שדווחו על ידי Lck-RCaMP2 ו OER-GCaMP6f מושווים באותם אזורים של עניין. שני החיישנים מדווחים על העלאת יון סידן דמוית תנודות. ושניהם מראים את אותו מסלול זמן בשניים מחמשת התאים שנבדקו.עם זאת, גובה יון הסידן המוצג על ידי Lck-RCaMP2 נשאר ברמה גבוהה יותר מאשר OER-GCaMP6f בתאים האחרים. תוצאות אלה מצביעות על כך שהתרוממות יון הסידן ממושכת בקרבת קרום הפלזמה, בעוד שהוא הסתיים מוקדם יותר סביב ה- ER, שהוא המקור לאות יון סידן זה המושרה על ידי גירוי היסטמין. אותות יון סידן ספונטניים של אסטרוציטים בתרבות המעורבת של נוירון-אסטרוציטים מהיפוקמפוס חולדה וקליפת המוח מוצגים על ידי Lck-RCaMP2 ו- OER-GCaMP6f.גובה יוני סידן ספונטני נראה רק בתהליך האסטרוציטי, לא בגוף התא אשר עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים. גובה יוני סידן ספונטני על ידי Lck-GCaMP6f בנוירונים לא בוגרים של ההיפוקמפוס החולדות נראה בשני הרץ. מסלולי הזמן לחמישה תחומי עניין שונים מצביעים על כך שגבהים אלה מוגבלים באופן מקומי לתחומים התת-תאיים.נוירונים היפוקמפוס עכבר בוגר נגוע OER-GCaMP6f ביטוי וקטורים AAV להראות תגובות יון סידן בתגובה לתוספת של DHPG. עבור דימות סידן, כוח ההזרעה של העירור הוא הגורם הקריטי ביותר. אנא שמרו על אור העירור נמוך ככל האפשר, כדי למנוע הלבנת תמונות ורעילות בצילום.מקור אותות הסידן יכול להיות מאושר עוד יותר על ידי Pomakorzi באמצעות מעכבים ספציפיים לערוצי סידן. פענוח אותות סידן כדי לעורר תפוקה ספציפית כבר שאלה ביולוגית בסיסית. טכניקת הדמיית סידן זו סוללת את הדרך לתאר את המגוון של אותות סידן תוך-תאיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...