Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dalle seguenti sovvenzioni: il Giappone Science and Technology Agency (JST) / Precursory ricerca per embrionale di scienza e tecnologia (PRESTO) (JPMJPR15F8, Giappone); la società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) / sovvenzioni in aiuti per la ricerca scientifica (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Gli autori ringraziano Haruhiko Bito (Università di Tokyo) per la fornitura di RCaMP2 e Arthur J.Y. Huang e Thomas McHugh (RIKEN CBS) per la fornitura di vettori AAV e per le istruzioni per quanto riguarda la preparazione di AAV. Gli autori vorrei anche ringraziare gli editor presso la Gazzetta di esperimenti visualizzati per il loro aiuto con riprese video e montaggio.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Diverse uscite biologici vengono avviate da Ca2 + segnali. CA2 + è un versatile Messaggero di segnalazione intracellulare. Decodifica di Ca2 + segnali per evocare uscite specifiche è stata una questione biologica fondamentale, e Ca2 + tecniche di imaging per descrivere la diversità di Ca2 + segnali sono necessari. Il protocollo attualmente dettagliato consente la rilevazione di Ca2 + segnali distinti alla membrana plasmatica ed ER (Figura 3 e Figura 4) e Ca2 + microdomini locali all'interno di una cella (Figura 4 e Figura 5). Ciò contribuisce a descrivere la diversità di Ca2 + segnali intracellulari. La risoluzione temporale di Ca2 + segnali inoltre è stata migliorata di mira GECIs nella membrana plasmatica ed ER perché può evitare l'effetto di una diffusione tridimensionale di Ca2 + e GECIs se stessi, e ha il potenziale per rilevare la momento di afflusso di Ca2 + o Ca2 + release, che si verifica sulla membrana.
Il protocollo presenta alcune limitazioni. Gli utenti dovrebbero tenere a mente che i segnali rilevati sono la sommatoria del "momento di afflusso di Ca2 + o rilascio" e "Ca2 + diffusa fuori dall'origine Ca2 +" , soprattutto per grandi Ca2 + segnali. Ad esempio, anche se la sua stimolazione in cellule HeLa evoca Ca2 + rilascio dall'ER, sua risultante Ca2 + segnali vengono rilevati non solo di OER-GCaMP6f ER-mirati, ma anche di plasma-membrana-mirati Lck-RCaMP2 (Figura 3). Un'altra limitazione è che il modello spatiotemporal di Ca2 + segnali potrebbe non essere l'unico fattore dell'uscita di Ca2 + segnali. La distribuzione delle proteine effettrici a valle (ad esempio Ca2 +-dipendente chinasi e fosfatasi) può anche essere una determinazione fattore2. Per decodificare completamente i Ca2 + segnali intracellulari, analisi del comportamento degli enzimi a valle, che non rientra in questo protocollo, sono assolutamente necessario.
Uno degli aspetti più critici per il successo Ca2 + formazione immagine è l'imaging acquisizione immagine e installazione condizioni, anche per quanto riguarda altri studi di formazione immagine live. Precedentemente abbiamo indicato che Ca2 + risposte nella cella sono altamente dipendenti sulla durata e l'intensità dell'eccitazione e su condizioni di acquisizione immagine, tra cui l'esposizione tempo e acquisizione frequenza16. Potenza di illuminazione di eccitazione è il fattore più critico, in quanto può causare tossicità luce e photobleaching di GECIs. Le condizioni di registrazione del tempo di esposizione, frequenza, intensità della luce di eccitazione e la durata di registrazione di registrazione dovrebbero essere ottimizzate in base allo scopo dell'esperimento. Si consiglia di ridurre il tempo di esposizione e l'intensità della luce di eccitazione per quanto possibile di evitare photobleaching e fototossicità alla cella. La frequenza di registrazione e la durata di registrazione dovrebbe essere sufficiente a coprire i Ca2 + elevazione eventi di interesse ma dovrebbe essere tenuti più bassi possibile evitare anche photobleaching e fototossicità. Si consiglia di determinare la frequenza di registrazione e la durata prima e ottimizzando l'intensità della luce e il tempo di esposizione, in modo che il photobleaching del GECIs è ridotto al minimo. Un altro fattore importante è il livello di espressione della GECIs. GECIs hanno un Ca2 +-buffering effetto come sono Ca2 +-proteine leganti. Di conseguenza, la sovraespressione di GECIs provoca il buffering di Ca2 +, che è fisiologicamente necessari per le cellule. La quantità di espressione GECI dovrebbe essere minimizzata per evitare imaging cellule che esprimono quantità elevate di GECIs. 
  In conclusione, la dissezione di Ca2 + segnali ad una risoluzione subcellulare è uno dei passi più importanti per la decodifica Ca2 + segnali intracellulari che determinano il fenomeno biologico di uscita. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per la dissezione di Ca2 + segnali per descrivere la diversità tra questi segnali. Attualmente, questa tecnica è limitata per gli esperimenti in vitro. Tuttavia, Lck-GCaMP6f è già utilizzato per in vivo Ca2 + imaging in topi17e OER-GCaMP6f è stata confermata per monitorare Ca2 + segnali in vivo nei neuroni di motore VD in c. elegans7. Di conseguenza, GECIs nel compartimento subcellulare di targeting ha il potenziale per essere ampliato in vivo imaging in futuro, quindi permettente Ca2 + dissezione in vivo.

CA2 + segnali rappresentano l'elevazione della concentrazione intracellulare di Ca2 + . CA2 + è il secondo messaggero universale per le cellule eucariotiche. Utilizzo di Ca2 +, cellule funzionano tramite diverse vie di segnalazione intracellulare e inducono varie uscite biologici. Ad esempio, in neuroni, rilascio delle vescicole sinaptiche al terminale presinaptico, espressione genica nel nucleo e induzione di plasticità sinaptica presso la postsynapse sono regolati da distinti segnali di Ca2 + che precisamente attivano l'appropriato enzimi a valle in siti adatti e con una tempistica precisa1.
Modelli specifici spatiotemporal di Ca2 + segnali attivano gli enzimi specifici a valle. CA2 + segnali vengono generati dal coordinamento tra le due diverse Ca2 + fonti: afflusso di Ca2 + dallo spazio extracellulare e il rilascio di Ca2 + dal reticolo endoplasmico (ER), che serve come una Ca intracellulare2 + negozio. Il spatiotemporal Ca2 + segnalazione modello significativo per indurre una funzione specifica delle cellule è supportato anche da nanodomini di 10 – 100 µM Ca2 + generato in prossimità di canali del Ca2 + sulla membrana plasmatica o ER membrana2. D'importanza, la fonte di Ca2 + segnali è uno dei fattori più critici che determinano l'uscita biologico a valle. Nei neuroni, afflusso di Ca2 + e il rilascio di Ca2 + hanno effetti opposti sul clustering di acido gamma - aminobutirrico (GABA) recettoriA (GABAAR) alle sinapsi GABAergica, che è responsabile dell'inibizione della eccitabilità di un neurone3. Afflusso di CA2 + accompagnato da massiccia eccitazione neuronale induce la dispersione di sinaptica GABAAR cluster, mentre persistente Ca2 + rilasciare dall'ER promuove il clustering di sinaptica GABAARs. Altri gruppi hanno anche riferito che la direzione ottimizzazione dei coni di crescita è dipenda criticamente sulla fonte del Ca2 + segnale: afflusso di Ca2 + induce repulsione, mentre il rilascio di Ca2 + guide l'attrazione della crescita neuronale cono4. Di conseguenza, per comprendere appieno il Ca2 + sottostante uscite cellulari specifiche vie di segnalazione, è importante identificare la fonte di Ca2 + segnali descrivendo il Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare.
In questo protocollo, descriviamo un Ca2 + metodo di imaging per segnalare Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare, che consente la stima del Ca2 + di sorgenti di segnale (Figura 1). CA2 + microdomini appena sotto la membrana plasmatica con successo sono monitorati da codificato geneticamente Ca2 + indicatori (GECIs) mirati alla membrana del plasma tramite il collegamento del segnale della membrana plasmatica-localizzazione Lck all'interno di Src chinasi a N-termini di GECIs5. Per rilevare il modello Ca2 + segnale nelle vicinanze di ER con una migliore risoluzione spaziale e temporale, abbiamo recentemente sviluppato OER-GCaMP6f, in cui GCaMP6f6 obiettivi ER membrana esterna, utilizzando la proteina transmembrana ER. OER-GCaMP6f sensibile può segnalare il rilascio di Ca2 + dall'ER una migliore risoluzione spatiotemporal rispetto convenzionale GCaMP6f immaturi di cellule COS-77 e di cellule HEK2938, evitando la diffusione di Ca2 + e GECIs . Inoltre abbiamo confermato che la spontanea Ca2 + elevazione in astrociti ippocampali coltivati segnalato da OER-GCaMP6f ha mostrato un modello spatiotemporal diverso rispetto a quella monitorata da GCaMP6f membrana plasmatica targeting (Lck-GCaMP6f)7 ,9, che indicano che il Ca2 + imaging con OER-GCaMP6f in combinazione con Lck-GCaMP6f contribuisce alla dissezione di Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare per identificare le loro fonti.
Attualmente, abbiamo dettaglio il protocollo per la dissezione Ca2 + segnale in cellule HeLa e neuroni-astrociti placcati su vetrini coprioggetti colture miscelati. Il Ca2 + tecnica di imaging con GECIs indicato qui, Lck-GCaMP6f, plasma-membrana-mirati RCaMP210 (Lck-RCaMP2), e OER-GCaMP6f (Figura 1) sono applicabili a tutte le celle in cui questi GECIs può essere espresso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Ione calcio (Ca2 +) è una molecola universale messaggero intracellulare che spinge le vie multiple di segnalazione, che conduce alle uscite biologici diversi. Il coordinamento delle sorgenti di segnale due Ca2 + — "Ca2 + afflusso" all'esterno della cellula e memorizzare "Rilascio2 + Ca" da Ca2 + intracellulare del reticolo endoplasmatico (ER) — è considerato per essere alla base i diversi modelli spazio-temporali di Ca 2 + segnali che causano funzioni biologiche nelle cellule. Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un nuovo Ca2 + metodo di imaging che consente il monitoraggio del momento di "Afflusso di Ca2 +" e "Ca2 + release". OER-GCaMP6f è un codificato geneticamente Ca2 + indicatore (GECI) composto da GCaMP6f, che si rivolge alla membrana esterna ER. OER-GCaMP6f può monitorare il rilascio di Ca2 + a una risoluzione temporale superiore convenzionale GCaMP6f. Combinato con membrana plasmatica targeting GECIs, lo spazio-temporali modello Ca2 + segnale può essere descritto in una risoluzione subcellulare. I targeting subcellulare Ca2 + indicatori descritti qui sono, in linea di principio, disponibile per tutti i tipi di cellulari, anche per in vivo imaging dei neuroni di Caenorhabditis elegans . In questo protocollo, introduciamo il Ca2 + imaging in cellule da linee cellulari, neuroni e cellule gliali in colture primarie dissociate e descrivere la preparazione di azione congelate dei neuroni corticali del ratto.

LCK-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sono stati espressi in cellule HeLa, ed entrambi i segnali sono stati registrati simultaneamente mediante suddivisione dell'immagine ottica, 24 ore dopo la trasfezione (Figura 3A e Video 1). Le immagini sono state acquisite a 10 Hz. istamina (sua, 1 µM), che induce il rilascio di Ca2 + dall'ER, è stato aggiunto durante la registrazione. Al momento dell'applicazione del suo, è aumentato l'intensità del segnale di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, come mostrato dal display pseudocolor ΔF/F0, che rappresenta il cambiamento dall'intensità di fluorescenza iniziale (Figura 3B). I corsi di tempo di Ca2 + elevazione (ΔF/F0) segnalati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sono stati confrontati nella stessa regione di interesse (ROI) (Figura 3). I valori ΔF/F0 sono stati normalizzati i valori di picco per consentire il confronto di corso di tempo tra le due GECIs diversi, che hanno livelli di espressione diversa e distribuzioni. Entrambi i sensori segnalato un'oscillazione-come Ca2 + elevazione. LCK-RCaMP2 e OER-GCaMP6f ha mostrato lo stesso corso di tempo per Ca2 + quota altimetrica in due cellule tra i tipi di cinque cella esaminato (Figura 3, ROI 1 e 3). Tuttavia, il Ca2 + elevazioni mostrate da Lck-RCaMP2 è rimasto a un livello superiore rispetto a quella mostrata da OER-GCaMP6f (Figura 3 C, ROI 2, 4 e 5). I risultati indicano che il Ca2 + quota altimetrica è prolungata in prossimità della membrana plasmatica, mentre viene terminato prima nei dintorni di ER, che è la fonte di questo Ca2 + segnale indotto dalla sua stimolazione.
Spontaneo Ca2 + segnali dagli astrociti in neuroni-astrociti mescolato cultura da ippocampi di ratto (Figura 4A) e cortexes (Figura 4B) sono stati indicati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f (Figura 4, Video 2, Video 3 , Video 4e 5). Colture corticali sono stati fatti rivivere da stock congelati che è stato preparato come descritto in questo protocollo. LCK-RCaMP2 e OER-GCaMP6f segnali sono stati registrati in sequenza a 2 Hz dalle cellule stesse. Tre ROIs sono stati selezionati nell'area che ha mostrato Ca2 + altezza da ogni GECI, e il corso di tempo del ΔF/Fbase (cioè, l'intensità di fluorescenza) cambiato dall'intensità di fluorescenza media durante il periodo di registrazione intera (Fbase ). Quando la fluorescenza di base è stabile e Ca2 + elevazioni sono meno frequenti, Fbase diventa una linea di base utile per rilevare gli eventi di Ca2 + elevazione. Ca2 + elevazioni spontanee erano visibili solo al processo astrocytic, non al corpo cellulare. Questo risultato è coerente con le precedenti relazioni su astrocytic spontanea Ca2 + segnali da altri GECIs visualizzati in vitro13 e vivo in14. Negli astrociti ippocampali sia corticali, Ca2 + elevazioni mostrate da Lck-RCaMP2 (in alto) erano più frequenti rispetto a quelli indicati da OER-GCaMP6f. Questo risultato è coerenza con la nostra precedente dimostrazione che Ca2 + le elevazioni in astrociti a causa di Lck-GCaMP6f sono state rilevate più frequentemente rispetto a quelli a causa di OER-GCaMP6f7 e suggerisce che questa nozione è anche applicabile presso il livello di singola cellula.
A 2 Hz (Figura 5A e Video 6) sono stati osservati spontanea Ca2 + aumenti di Lck-GCaMP6f in neuroni ippocampali di ratto acerbo (10 DIV). I corsi di tempo di ΔF/F0 in cinque differenti ROIs suggeriscono che queste elevazioni di Ca2 + localmente sono confinate ai domini subcellulari. Figura 5B (Video 7) Mostra il Ca2 + risposte in neuroni ippocampali matura del topo (30 DIV) infettate con vettori AAV OER-GCaMP6f-espressione. I neuroni sono stati stimolati con 100 µM DHPG, che è l'agonista per i recettori metabotropici del glutammato, inducendo il rilascio di Ca2 + . DHPG Ca2 + rilascio indotto dovuto OER-GCaMP6f è stato rilevato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figura 1: diagramma mostra targeting membrana GECIs. Diagramma schematico di GECIs targeting della membrana plasmatica (Lck-GCaMP6f e Lck-RCaMP2) ed esterno ER targeting membrana GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figura 2: diagramma di flusso per la preparazione delle cellule ippocampali e corticali, trasfezione di plasmide e infezione AAV. Le immagini al microscopio sono rappresentativi, appena placcato DIV-6 cellule corticali (a sinistra) e rivivere le cellule dallo stock congelati (a destra). Barra della scala = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figura 3: esempio della formazione immagine simultanea di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f in cellule HeLa. (A) rappresentazione schematica della separazione del segnale con suddivisione dell'immagine ottica. Lo stesso campo di vista per Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f contemporaneamente è proiettata sulla fotocamera. Una registrazione rappresentanza acquistata a 10 Hz da una telecamera CMOS è fornita nel Video 1e un frame di questa registrazione viene visualizzato nel pannello A (a destra). (B) immagini di pseudo-colore ΔF/F0 per Lck-GCaMP2 (in alto) e OER-GCaMP6f (in basso). Istamina (sua, 1 µM) è stato aggiunto a 0 s. (C) rappresentante tempo normalizzato ΔF/F0 corso di Lck-GCaMP2 (magenta) e OER-GCaMP6f (verde). I dati sono stati normalizzati al valore massimo di ΔF/F0 per ciascuna parcella. Le barre grigie indicano i tempi della sua applicazione. I dati sono stati analizzati con un software su misura TI Workbench15. Barra della scala = 50 µm (immagine microscopica).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figura 4: Spontanea Ca2 + elevazione negli astrociti monitorati per espressione Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f. (A) rappresentante hippocampal e astrociti corticali (B) transfettati con Lck-RCaMP2 (in alto) e OER-GCaMP6f (in basso). Cellule corticali sono stati fatti rivivere da colture stock congelate. LCK-RCaMP2 e OER-GCaMP6f immagini in sequenza sono stati acquisiti nella stessa cella, a 2 Hz, con una telecamera EM-CCD. Le trame sulla sinistra mostrano i corsi di tempo di ΔF/Fbase misurati nella ROIs indicato nell'immagine microscopica. I dati sono stati analizzati con TI Workbench. Film reali sono forniti in Video 2e Video 3, Video 4 Video 5. La barra della scala = 20 µm (immagine microscopica). La deriva della linea di base suggerisce i cambiamenti in Ca2 + livello globale nella cella.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figura 5: Esempi di Ca2 + imaging in neuroni con Lck-GCaMP6f e OER-GCaMP6f. Neuroni ippocampali di ratto rappresentativo di (A) che esprime Lck-GCaMP6f a 10 DIV (a sinistra) e trame mostrando il tempo corsi di ΔF/F0 misurata in ROIs (cerchi gialli) sono state indicate nell'immagine (a destra). I numeri nel corso tempo corrispondono ai numeri ROI nell'immagine. Si noti che lo schema temporale di Ca2 + quota altimetrica è diverso tra le varie regioni di interesse. La deriva della linea di base suggerisce l'aumento del Ca2 + livello globale in questo neurone. (B) un esempio di neuroni ippocampali di matura del topo (DIV 30) infettati con vettori di AAV espressione OER-GCaMP6f (a sinistra). Il tempo terreno di corso di ΔF/F0 misurato Mostra il Ca2 + risposta a 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) applicato la tempistica indicata dalla barra grigia. Cerchi gialli indicano la posizione di ROIs dove il corso di tempo è stato ottenuto. Le immagini sono state acquisite a 2 Hz con una telecamera CCD raffreddata (pannello A) o una telecamera di EM-CCD (pannello B) e analizzate con Workbench TI. Barra della scala = 20 µm (immagine microscopica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: esempio di formazione immagine simultanea di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f in cellule HeLa. Rappresentante registrazione acquisita a 10 Hz e presentato in Figura 3. Barra della scala = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Transitorio2 + Ca spontanea osservata nel Lck-RCaMP2 in astrociti ippocampali. Rappresentante registrazione acquisita a 2 Hz (Figura 4A), registrato lo stesso campo di vista come Video 3. Barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Transitorio2 + Ca spontanea osservata in OER-GCaMP6f in un Astrocita hippocampal. Rappresentanza registrazione acquisita a 2 Hz (Figura 4A), nello stesso campo di vista come Video 2. Barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Transitorio2 + Ca spontanea osservata nel Lck-RCaMP2 in un Astrocita corticale rappresentante registrazione acquisita a 2 Hz (Figura 4B), registrata nello stesso campo di vista come Video 5. Barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Transitorio2 + Ca spontanea osservata in OER-GCaMP6f in un Astrocita corticale. Rappresentanza registrazione acquisita a 2 Hz (Figura 4B), nello stesso campo di vista come Video 4. La barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Esempio di Ca2 + imaging in un neurone hippocampal del ratto (DIV 10) da Lck-GCaMP6f. Esempio di un neurone Ca2 + segnali registrati a 2 Hz (Figura 5A). Barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + rilascio in un neurone ippocampale con mouse (DIV 30) espressione OER-GCaMP6f. Esempio di Ca2 + segnali neuronali registrato in un neurone hippocampal del mouse infettato con vettori di AAV espressione OER-GCaMP6f (figura 5B). Il neurone è stato stimolato con 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) applicato a 30 s per evocare il rilascio di Ca2 + dall'ER. Barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">per favore clicca qui per scaricare questo video.</a>

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

La dissezione dei segnali di calcio a risoluzione subcellulare, è uno dei passaggi più importanti per decodificare i segnali di calcio intracellulare che determinano il fenomeno biologico di uscita. Questo protocollo descrive un nuovo metodo di imaging del calcio che consente il monitoraggio del momento stesso dell'afflusso di calcio e del rilascio di calcio. Questo protocollo è applicabile a tutti i tipi di cellule che consentono l'espressione di indicatori di calcio geneticamente codificati.Crediamo che il nostro metodo abbia il potenziale per essere esteso alla dissezione dei segnali di calcio alla risoluzione subcellulare negli animali viventi nella cultura di laboratorio. A dimostrare la procedura sarà Matsumi Hirose, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, posizionare lo scivolo di copertura in vetro di 18 millimetri di diametro in ogni pozzo di una piastra di 12 potta.Utilizzare acqua sterilizzata e preparare 12,5 millilitri di una soluzione 0,4%PEI per ogni piastra da 12 porvili utilizzata. Aggiungere un millilitro della soluzione PEI a ciascun pozzo e assicurarsi che non ci siano bolle sotto i coperchi. Incubare durante la notte in un incubatore di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, utilizzare un aspiratore per rimuovere la soluzione PEI. Aggiungere un millilitro di acqua sterilizzata ad ogni pozzo e agitare la piastra in modo che la soluzione PEI tra lo scivolamento del coperchio e la piastra sia lavata accuratamente. Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte con acqua fresca sterilizzata.Dopo il lavaggio finale, aspirare completamente l'acqua da ogni pozzo. All'interno del cappuccio, utilizzare una luce ultravioletta per asciugare e sterilizzare i coperchi scivola per almeno 15 minuti. Il piatto rivestito in PEI può essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di due mesi.Quando sei pronto a procedere, illumina i piatti con la luce ultravioletta per 15 minuti, poco prima dell'uso. Aggiungere cinque millilitri di acqua distillata sterile nello spazio tra i pozzi per evitare l'evaporazione del mezzo di coltura. In primo luogo, lavare i cortici con incubazione salina.Quindi, incubare i cortici con tripside e DNAsi in incubazione salina per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, lavare i cortici tre volte con l'incubazione ghiacciata salina. Rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri di mezzo di placcatura integrati con 150 microlitri di materiale DNASI I.Dissociare le cellule tubazioni venti volte o meno e filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare con una dimensione dei pori di 70 micrometri. Quindi, lavare il filtro cellulare con 20 millilitri del mezzo di placcatura. Per la preparazione del calcio cellulare congelato, lavare le cellule con 20 millilitri del mezzo di lavaggio.Diluire le cellule corticali con un mezzo di placcatura ad una densità di 140 000 cellule vitali per millilitro. Quindi, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita ai coperchi rivestiti in PEI nelle piastre di coltura di 12 pozzi. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per due o tre giorni.Quando le celle sono stabili, da due a tre giorni dopo la placcatura, cambiare il mezzo di coltura nel mezzo di manutenzione. Per la preparazione del calcio cellulare congelato, girare verso il basso la cella, usando un rotore oscillante per centrifugare le cellule a 187 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante e aggiungere il mezzo di crioconservazione, mantenuto a quattro gradi Celsius, per ottenere una densità cellulare di 10 milioni di cellule per millilitro.Aliquota un millilitro della sospensione cellulare in tubi criogenici. Posizionare i tubi in un contenitore di congelamento cellulare con un tasso di congelamento di meno un grado Celsius al minuto, fino a raggiungere una temperatura di meno 80 gradi Celsius. Trasferire il contenitore di congelamento in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.Per ravvivare le cellule congelate, pre-riscaldare il mezzo di lavaggio e il mezzo di mantenimento per le cellule corticali congelate. Successivamente, scongelare rapidamente le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Diluire delicatamente le cellule con mezzo di lavaggio pre-riscaldato e centrifugare con un rotore oscillante a 187 volte G per tre minuti.Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di mezzo di lavaggio e misurare la densità cellulare praticabile. Quindi, diluire le cellule con il mezzo di mantenimento per le cellule corticali congelate, per produrre una densità cellulare di 300 000 cellule per millilitro. Cedere un millilitro di questa sospensione cellulare nei pozzi delle piastre a 12 pozzi rivestite in PEI.Per la trasfezione da tre a otto giorni dopo la placcatura, etichettare due tubi, uno per il DNA plasmatico e l'altro per il reagente di trasfezione. Aggiungere 50 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo, ad ogni tubo. Aggiungere 0,5 microgrammi di DNA plasmatico per slittamento di copertura e un microlitro di integratore accompagnato da reagente di trasfezione per neuroni, per pozzo al tubo del DNA plasmatico.Per la co-trasfezione di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, mescolare 0,5 microgrammi di ogni plasmide e un microlitro di integratore in 50 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo. Quindi, aggiungere un microlitro di reagente di trasfezione per pozzo al tubo del reagente di trasfezione. Vortice entrambi i tubi per uno o due secondi.Quindi, aggiungere la miscela di reagente di trasfezione alla miscela di DNA. Pipettare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Caricare questa miscela sulle cellule in modo drop-wise.Incubare in un incubatore di anidride carbonica per due o tre giorni fino a quando le proteine marcatori sono espresse. Mescolare L e O per fare l'infezione da AAC. Aggiungere tre microlitri di AAC per pozzo alla coltura mista neurone-astrocita.Dondolare delicatamente il piatto per mescolare. Mantenere la cultura per una o due settimane fino a quando non vengono espressi i GECI. Per prima cosa montare il coperchio contenente le celle trasfette con Lck-RCaMP2 e OER-CaMPG6f nella camera di registrazione del microscopio.Aggiungere 400 microlitri del mezzo di imaging e posizionare un coperchio sopra la camera. Scegliere il set di filtri per GCaMP6f e la sorgente luminosa. Individuare gli astrociti che esprimono OER-GCaMP6f.Scegliere quindi un set di filtri e una sorgente luminosa per RCaMP2 e verificare se Lck-RCaMP2 è espresso negli stessi astrociti. Registrare le immagini time lapse di Lck-RCaMP2 in due Hertz per due minuti e salvare i dati di imaging. Successivamente, modificare il filtro impostato su quello per GCaMP6f.Registrare le immagini time lapse di OER-GCaMP6f a due Hertz per due minuti e salvare i dati di imaging. In questo studio, Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sono espressi in celle HeLa ed entrambi i segnali sono stati registrati simultaneamente utilizzando ottiche di divisione delle immagini, 24 ore dopo la trasfezione. Con l'aggiunta di Istamina, l'intensità del segnale di Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f aumentò.I corsi di tempo di elevazione degli ioni di calcio riportati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f vengono confrontati nelle stesse regioni di interesse. Entrambi i sensori riportano un'elevazione degli ioni di calcio simile a un'oscillazione. Ed entrambi mostrano lo stesso corso di tempo in due delle cinque cellule esaminate.Tuttavia, le elevazioni degli ioni di calcio mostrate da Lck-RCaMP2 rimangono al livello più alto di OER-GCaMP6f nelle altre cellule. Questi risultati indicano che l'elevazione degli ioni di calcio è prolungata in prossimità della membrana plasmatica, mentre viene terminata prima intorno al ER, che è la fonte di questo segnale ionico di calcio indotto dalla stimolazione dell'istamina. I segnali spontanei di ioni di calcio dagli astrociti nella coltura mista neuronale-astrocita da ippocampi e cortici di ratto sono mostrati da Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f.Le elevazioni spontanee degli ioni di calcio sono visibili solo al processo astrocitico, non al corpo cellulare che è coerente con i rapporti precedenti. Le elevazioni spontanee degli ioni di calcio da parte di Lck-GCaMP6f nei neuroni immaturi dell'ippocampale del ratto sono viste in due Hertz. I corsi di tempo per cinque diverse regioni di interesse suggeriscono che queste elevazioni sono localmente limitate ai domini subcellulari.I neuroni ippocampali del topo maturi infettati da vettori AAV di espressione OER-GCaMP6f mostrano risposte agli ioni di calcio in risposta all'aggiunta di DHPG. Per l'imaging del calcio, il potere di luminazione dell'eccitazione è il fattore più critico. Si prega di mantenere la luce di eccitazione il più bassa possibile per evitare lo sbiancamento fotografico e la fototossicità.La fonte dei segnali di calcio può essere ulteriormente confermata da Pomakorzi usando inibitori specifici per canali di calcio. Decodificare i segnali di calcio per evocare un'uscita specifica è stata una questione biologica fondamentale. Questa tecnica di imaging del calcio apre la strada a descrivere la diversità dei segnali di calcio intracellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

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Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

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Imaging intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali di striatale astrociti da topi adulti utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificate

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Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

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Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

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