Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

この作業は次の補助金によってサポートされて: 日本科学技術振興機構 (JST)/前兆研究萌芽期の科学と技術 (プレスト) (JPMJPR15F8、日本);日本学術振興会 (JSPS) 科学研究 (科研費) (JP18H05414、JP17H05710、JP16K07316)、助成財団助成金/。著者 RCaMP2 とアーサー J.Y. 黄尾藤晴彦 (東京大学) に感謝し、トーマス McHugh (理化学研究所 CBS) の AAV のベクトルを提供と指示について AAV の準備。著者は、ビデオ撮影と編集の可視化実験のジャーナル編集者に感謝するも思います。

<ol>
	<li>Clapham, D. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" 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著者が明らかに何もありません。

多様な生物の出力は、Ca2 +シグナルによって開始されます。Ca2 +は多彩な細胞内シグナル伝達メッセンジャーです。基本的な生物学的質問をされている特定の出力を換起する Ca2 +信号をデコードし、Ca2 +信号の多様性を記述する Ca2 +イメージング技術が必要です。現在詳細なプロトコルは、細胞膜と小胞体 (図 3および図 4) とローカル Ca2 +ミクロ相分離構造 (図 4および図 5) セル内で異なる Ca2 +信号を検出できます。これは細胞内 Ca2 +シグナルの多様性を記述するのに貢献します。Ca2 +の時間分解能信号も Ca2 +と自分自身、GECIs 三次元拡散の影響を避けることができ、それを検出する可能性がありますので、細胞膜や小胞体 GECIs をターゲットに改善されました、Ca2 +流入や Ca2 +の膜が発生するリリースのまさにその瞬間。
プロトコルには、いくつかの制限があります。検出信号は「Ca2 +流入やリリースの瞬間」の和であることに注意してください"Ca2 +拡散うち Ca2 +元から「大規模な Ca2 +シグナルの特にと。たとえば、HeLa 細胞の彼の刺激を呼び起こす Ca が2 +からのリリース ER、その結果の Ca2 +シグナルは ER 対象 OER GCaMP6f だけでなく、プラズマ膜ターゲット Lck RCaMP2 (図 3) も検出されます。別の制限は、Ca2 +シグナルの時空間パターンの Ca2 +シグナルの出力の唯一の決定要因をできない場合があります。下流エフェクター蛋白質の分布 (Ca2 +など-依存型キナーゼとホスファターゼ)2の決定要因があります。細胞内 Ca2 +シグナルを完全にデコードするには、このプロトコルでは扱いません、下流の酵素の動作の解析が不可欠です。
成功した Ca2 +イメージングのための最も重要な側面の 1 つは、イメージングのセットアップおよびイメージの取得条件、その他ライブ イメージング研究は同様。我々 は以前、期間および励起の強度と暴露時間と取得周波数16を含むイメージ取得条件付きで、細胞内 Ca2 +応答が強く依存していることを示した。励起光パワーは、光毒性と GECIs の変質を引き起こす可能性が最も重要な要因です。露光時間、周波数、励起光の強度、および録音の期間の記録の記録条件を最適化して、実験の目的に合わせてください。露出時間、退色とセルに光毒性を避けるために可能な限り、励起光の強度を減らすことをお勧めします。記録の頻度および記録の期間興味の Ca2 +上昇イベントをカバーするために十分なはずですがも退色と光毒性を避けるために可能な限り低きます。最初記録の頻度と期間を決定して、GECIs の変質を最小限になるよう、光の強さと露光時間を最適化することをお勧めします。もう一つの重要な要因は、GECIs の表現レベルです。GECIs がある Ca2 +-緩衝効果彼らは、Ca2 +-結合蛋白質。したがって、GECIs の過剰発現は、生理学的、細胞に必要な Ca2 +、バッファリングの結果します。GECI 発現量は、GECIs を多量に発現するイメージング細胞を避けるために最小限に抑える必要があります。 
  結論としては、Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での郭清は、出力の生物学的現象を決定する細胞内の Ca2 +信号をデコードするための最も重要な手順の 1 つです。このプロトコルは、Ca2 +シグナルこれらの信号間の多様性を記述するための解剖のための新しい方法を提供します。現在、この手法は in vitro 実験で制限されています。しかし、Lck GCaMP6f は in vivo Ca2 +イメージング マウス17で既に使用されている、小田急電鉄 GCaMP6f は、Ca2 +を監視する線虫7 VD 運動ニューロンにおける生体内で信号を確認しました。したがって、細胞レベル下コンパートメントに GECIs をターゲットと、in vivo イメージング、将来、したがって有効にする Ca2 +解離体内に拡張する可能性があります。

Ca2 +シグナルは、細胞内 Ca2 +濃度の上昇を表しています。Ca2 +は真核細胞に普遍的な二次メッセンジャーです。Ca2 +を使用して、セルは多様な細胞内シグナル伝達経路を介して機能し、さまざまな生物学的出力を誘発します。たとえば、ニューロン、シナプス前終末でシナプス小胞の放出核、および、postsynapse におけるシナプスの可塑性の誘導における遺伝子発現の正確に有効適切な個別の Ca2 +シグナルによって規制されて正確なタイミング1と右のサイトで下流の酵素。
Ca2 +シグナルの時空間パターンの特定には、特定の下流の酵素が有効にします。Ca2 +シグナルの 2 つの異なる Ca2 +ソース間の調整によって生成される: 細胞外空間、細胞内 Ca 2 +となる小胞体 (ER) からの Ca2 +放出からの Ca2 +流入を格納します。意味のある時空間 Ca2 +シグナル パターン特定の細胞機能を誘導するためには 10-100 μ M Ca2 +細胞膜や小胞体膜2上の Ca2 +チャネル近傍に生成されたナノドメインでもサポートされます。重要なは、Ca2 +シグナルのソースは、下流の生物学的出力を決定する最も重要な要因の 1 つです。ニューロンの Ca2 +流入し、Ca2 +放出があるガンマ-アミノ酪酸 (GABA)の受容体 (GABAAR) gaba 作動性シナプスでのクラスタ リングに対する効果の反対の阻止に責任があります。神経細胞の興奮3。Ca2 +流入大規模な神経興奮に伴うシナプス GABAAR クラスターの分散を誘導する、永続的な Ca2 +小胞体から放出に対しシナプス GABAARs のクラスタ リングを促進します。他のグループはまた成長円錐のチューニングの方向が Ca2 +シグナルの元に大きく依存することを報告している: Ca2 +流入 Ca2 +放出は神経の成長の魅力をガイドしながら、反発を誘発します。コーン4。したがって、完全に理解、Ca2 +シグナル伝達経路の特定細胞出力の基になる、する、Ca2 +シグナルで細胞レベル下の解像度を記述することによって Ca2 +シグナルのソースを識別するために重要です。
このプロトコルでは Ca2 +イメージングを報告するメソッド、Ca2 +シグナル ソース (図 1) の推定を可能にする細胞レベル下の解像度で Ca2 +シグナルをについて説明します。Ca2 +ミクロ ドメインの膜のすぐ下には、遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) 細胞膜局在化シグナル Src 内 Lck の添付ファイルを介して細胞膜を対象としたによって監視される正常にGECIs5の N 末端キナーゼ。よく空間的で、一時的な解決で ER 近傍 Ca2 +信号パターンを検出するため最近 OER-GCaMP6f で培って GCaMP6f6ターゲット ER 外膜、小胞体膜貫通型タンパク質を使用します。小田急電鉄 GCaMP6f は、Ca2 +と GECIs の拡散を避けることによって COS 7 細胞7 HEK293 細胞8、従来の標的 GCaMP6f よりもより良い時空間解像度で小胞体からの Ca2 +放出を報告できる敏感に.小田急電鉄 GCaMP6f によって報告された培養海馬アストロ サイトの自発的 Ca2 +上昇が別の時空間パターンを示したことをまた確認した膜をターゲットとした GCaMP6f では監視と比較して (Lck GCaMP6f)7 ,9, Ca2 +イメージング OER GCaMP6f Lck GCaMP6f との組み合わせでは、Ca2 +シグナルのソースを識別するために細胞レベル下の解像度での郭清に寄与することを示します。
現在、我々 は HeLa 細胞とニューロン ・ グリア ガラス coverslips にメッキ文化の混合で Ca2 +シグナル解剖のプロトコルを詳しく説明します。Ca2 +イメージング技法 GECIs は Lck GCaMP6f、プラズマ膜ターゲット RCaMP210 (Lck RCaMP2)、ここに示す、これら GECIs を表現できるすべてのセルに適用される小田急電鉄 GCaMP6f (図 1)。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

カルシウム イオン (Ca2 +) は、多様な生物の出力につながる複数のシグナル伝達経路を駆動する普遍的な細胞内メッセンジャー分子です。2 つの Ca2 +シグナル ソースの調整-「Ca2 +流入」から細胞外 Ca2 +からの解放は「細胞内 ca 2 + ストア小胞体 (ER) と -Ca の多様な時空間的パターン根底にある2 +細胞に複数の生物学的機能を引き起こす信号。このプロトコルの目的は、Ca2 +のイメージング手法により「Ca2 +流入"と"Ca2 +リリース"の瞬間を監視するを説明します。小田急電鉄 GCaMP6f は、遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECI) 小胞体の外膜を対象に GCaMP6f を構成します。小田急電鉄 GCaMP6f は、従来の GCaMP6f よりも高い時間分解能で Ca2 +放出を監視できます。プラズマ膜ターゲット GECIs と組み合わせると、時空の Ca2 +シグナル パターンは細胞レベル下の解像度で記述できます。対象と細胞内 Ca2 +インジケーターここで説明は、原則として、すべてのセルで使用できますも生体内で結像のため線虫ニューロンの。このプロトコルでセル行, ニューロン, とグリア細胞解離の初代培養から細胞内 Ca2 +イメージングを紹介し、ラット大脳皮質ニューロンの冷凍ストックの準備を記述します。

Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f HeLa 細胞に表現され、同時に画像分割光学系、(図 3 aとビデオ 1) トランスフェクション後 24 h を使用して両方の信号が記録されました。画像は、10 hz ヒスタミン (彼、1 μ M)、小胞体からの Ca2 +放出を誘導する、録音中に追加された、買収されました。彼の申請には、Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f の信号強度の増加、ΔF/f0 の初期の蛍光強度 (図 3 b) からの変更を表す擬似カラー表示で示すように。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f によって報告された Ca2 +上昇 (ΔF/F0) の時間コースは、利益率 (ROI) (図 3) の同じ地域で比較しました。ΔF/F0 の値は、異なる表現のレベルと分布を持つ 2 つの異なる GECIs 時間コース比較するためピーク値に正規化されました。両方のセンサーは振動のような Ca2 +上昇を報告しました。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 5 つの細胞のタイプ間の 2 つのセルで Ca2 +上昇の同じ時間経過を示した (図 3、投資収益率 1 と 3) を検討しました。しかし、Ca2 +標高 Lck RCaMP2 によって示されているは、OER GCaMP6f (図 3 C、投資収益率 2、4、および 5) で示すと比較してより高いレベルにとどまっています。終了以前 ER の周り彼の刺激による Ca2 +信号源である一方、プラズマ膜近傍 Ca2 +上昇を延長することが示唆されました。
自発的 Ca2 +ニューロン ・ グリア (図 4 a) ラットなったから文化を混合アストロ サイトからの信号は、Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f (図 4、ビデオ 2、ビデオ 3 によって示されていた皮質 (図 4 b)、動画 4、動画 5)。皮質の文化は、このプロトコルで説明されているように準備された凍結ストックから復活しました。Lck RCaMP2 および小田急電鉄 GCaMP6f 信号は同じ細胞から 2 Hz で順番に記録されました。3 ・ ロワは、各 GECI で Ca2 +上昇を示した領域で選択され、ΔF/F基本(すなわち、蛍光強度) の時間コースが全体の録音期間 (F基本中に平均蛍光強度から変更).ベースラインの蛍光は安定するいると、Ca2 +標高がそれほど頻繁に Ca2 +上昇イベントを検出する有用な基準に F基本なります。自発的 Ca2 +標高はアストロ サイトのプロセスは細胞体ではなく、表示されていた。この結果は他 GECIs 可視化体外13体内14によるアストロ サイトの自発的 Ca2 +信号前のレポートに一貫しました。海馬と皮質アストロ サイトの Ca2 +標高 Lck RCaMP2 (トップ) で示されていた OER GCaMP6f によって示されているよりも頻繁。この結果 Lck GCaMP6f によるアストロ サイトの Ca2 +高度が小田急電鉄 GCaMP6f7のためのそれらよりも多く検出されたこと私達の前のデモンストレーションと一貫性のある、この概念もに適用可能であることを示唆している、単一セルのレベル。
自発的 Ca2 +標高 Lck GCaMP6f による幼若ラット海馬ニューロン (10 部) では、2 Hz (図 5 aとビデオ 6) で見られました。これらの Ca2 +上昇が細胞内ドメインにローカルに限られている 5 つの異なる Roi の ΔF/F0 の時間コースがお勧めします。図 5B(動画 7) は、Ca2 +応答成熟マウス海馬ニューロン (30 部) に小田急電鉄 GCaMP6f 発現 AAV ベクターに感染を示しています。100 μ m の Ca2 +放出を誘発する代謝型グルタミン酸受容体のアゴニストである DHPG は、ニューロンが刺激されました。DHPG による OER GCaMP6f による Ca2 +放出が検出されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> 図 1: 図膜ターゲット GECIs 。プラズマ膜ターゲット GECIs (Lck GCaMP6f および Lck RCaMP2) と外側の ER の模式図膜ターゲットと GCaMP6f (OER-GCaMP6f)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> 図 2: 海馬と大脳皮質細胞の準備、プラスミド トランスフェクション AAV 感染にフローチャート。顕微鏡の画像は代表、たてメッキ DIV 6 大脳皮質細胞 (左)、(右) 凍結ストックから細胞を復活します。スケールバー = 100 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> 図 3: Lck RCaMP2 と HeLa 細胞で OER GCaMP6f の同時可視化の例です。画像分割光学系と信号分離の模式図 (A)。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f のためのビューの同じフィールドは、カメラに同時に投影されます。ビデオ 1、CMOS カメラが 10 Hz で取得した代表的な記録は、この録音の 1 つのフレームは (右) パネルAに表示されます。(B) ΔF/F0 Lck GCaMP2 (トップ) と小田急電鉄 GCaMP6f (下) のための擬似カラー画像。(彼、1 μ M) ヒスタミンは、Lck GCaMP2 (マゼンタ) と小田急電鉄 GCaMP6f (緑) の正規化された ΔF/F0 時間コース 0, (C) 代表に追加されました。データは、各プロットの最大の ΔF/F0 値を正規化されました。グレーのバーは、アプリケーションのタイミングを示します。データは、カスタムメイドのソフトウェア TI ワークベンチ15と分析されました。スケールバー = 50 μ m (顕微鏡画像)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> 図 4: 自発的 Ca2 +標高 Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 式の監視アストロ サイトにします。(A) 代表海馬と (B) 皮質アストロ サイト Lck RCaMP2 (トップ) と小田急電鉄 GCaMP6f (下) をトランスフェクトしました。大脳皮質細胞は、冷凍ストック文化から復活しました。Lck RCaMP2 と OER GCaMP6f 画像順次 EM CCD カメラで 2 Hz で同じセルに買収されました。ΔF/Fbase の時間コースを Roi の測定左ショーのプロットは、顕微鏡画像で示されます。データは、TI ワークベンチと分析されました。実際の映画は動画 2動画 3、 動画 4動画 5を提供しています。スケール バー = 20 μ m (顕微鏡画像)。ベースラインのドリフトでは、セルにグローバルの Ca2 +レベルの変化を示唆しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> 図 5: Lck GCaMP6f と OER GCaMP6f ニューロンの Ca2 +イメージングの例。(A) 代表的なラット海馬ニューロンの DIV 10 (左) と (右) イメージの ΔF/F0 ・ ロワ (黄色の円) 単位のコースを示している時間を示すプロットで Lck GCaMP6f を表現します。時間コース内の数字は画像の ROI の番号に対応します。メモ Ca2 +上昇の時系列パターンは興味の様々 な地域の間で異なる。ベースラインのドリフトは、このニューロンの Ca2 +のグローバル レベルの増加を示唆しています。(B) 成熟マウス海馬ニューロン (DIV 30) 小田急電鉄 GCaMP6f 式 AAV のベクトルを (左) に感染しているの例。ΔF/f0 測定コース プロットを示します 100 μ M の Ca2 +応答時間 (RS) - 3, 5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) は、灰色のバーが表示されるタイミングで適用されます。黄色の丸は、時間経過が得られた陰影の位置を示します。冷却 CCD カメラ(パネル)または EM CCD カメラ (パネルB) 画像 2 hz ・ TI ワークベンチで分析します。スケール バー = 20 μ m (顕微鏡画像)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> ビデオ 1: Lck RCaMP2 と HeLa 細胞で OER GCaMP6f の同時可視化の例です。代表的な録音は、10 Hz で取得し、図3。スケールバー = 50 μ m。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> ビデオ 2: 自発的 Ca2 +過渡観察 Lck RCaMP2 海馬アストロ サイトにします。2 Hz (図 4 a) で取得した代表的な録音は、ビデオ 3としてのビューの同じフィールドに記録されます。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> ビデオ 3: 自発的 Ca2 +過渡観察 OER GCaMP6f 海馬アストロ サイトにします。代表的な記録ビデオ 2としてのビューの同じフィールドで 2 Hz (図 4 a) で取得しました。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> ビデオ 4: 自発的 Ca2 +のトランジェントを Lck RCaMP2 皮質アストロ サイトで観測されたビデオ 5としてのビューの同じフィールドで 2 Hz (図 4 b) で取得した代表的な記録を記録しました。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> ビデオ 5: 自発的 Ca2 +過渡観察 OER GCaMP6f 皮質アストロ サイトにします。代表的な記録ビデオ 4としてのビューの同じフィールドで 2 Hz (図 4 b) で取得しました。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> ビデオ 6: Lck GCaMP6f によるラットの海馬ニューロン (DIV 10) における Ca2 +イメージングの例です。2 Hz (図 5 a) で記録された信号を神経細胞 Ca2 +の例。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> ビデオ 7: 小田急電鉄 GCaMP6f を表現するマウス海馬ニューロン (DIV 30) で Ca2 +リリース。小田急電鉄 GCaMP6f 式 AAV のベクトル (図 5 b) に感染したマウスの海馬ニューロンでニューロンの Ca2 +信号の例を記録しました。ニューロン刺激 100 μ M dihydroxyphenylglycine (DHPG) 30 で適用される小胞体からの Ca2 +放出を換起します。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーターの式をできるようにするすべてのセル型に適用されます。

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

細胞下解像度でのカルシウム信号の解剖は、出力生物学的現象を決定する細胞内カルシウム信号を解読するための最も重要なステップの1つである。このプロトコルは、カルシウム流入とカルシウム放出の瞬間を監視することを可能にする新しいカルシウムイメージング法を記述する。このプロトコルは、遺伝的にコード化されたカルシウム指標の発現を可能にするすべての細胞タイプに適用可能である。我々の方法は、実験室培養中の生きている動物の細胞下解像度でカルシウム信号の解剖に拡大される可能性があると考えています。この手順の実演を手伝うのが、研究室の技術者である「松美」です。この手順を開始するには、直径18ミリメートルのガラスカバースリップを12ウェルプレートの各ウェルに入れます。滅菌水を使用し、使用されている12ウェルプレートごとに0.4%PEI溶液12.5ミリリットルを調製します。各ウェルにPEI溶液の1ミリリットルを追加し、カバースリップの下に泡がないことを確認します。摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、吸引器を使用してPEI溶液を除去します。各ウェルに滅菌水1ミリリットルを加え、蓋スリップとプレートの間のPEI溶液が十分に洗い流されるようにプレートを振ります。この洗浄プロセスを、新鮮な滅菌水でさらに2回繰り返します。最終洗浄後、各井戸から水を完全に吸引する。フードの内側では、紫外線を使用してカバースリップを少なくとも15分間乾燥させ、滅菌します。PEIコーティングされた皿は2ヶ月まで摂氏4度で貯えることができる。先に進む準備ができたら、使用直前に15分間、紫外線で皿を照らします。培養液の蒸発を防ぐために、ウェル間の空間に5ミリリットルの無菌蒸留水を加える。まず、皮質をインキュベーション生理食酒で洗います。その後、トリプシンとDNAseをインキュベーション生理食前にして皮質を摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、氷冷培養生理食酒で皮質を3回洗います。上清を取り除き、150マイクロリットルのDNAse Iストックを添加しためっき培地2ミリリットルを加えます。20回以下のピペットで細胞を解離し、70マイクロメートルの細孔サイズで細胞ストレーナーを通して細胞を濾過する。次に、20ミリリットルのめっき培地で細胞ストレーナーを洗います。凍結した細胞ストックの調製のために、20ミリリットルの洗浄媒体で細胞を洗浄する。皮質細胞をメッキ培地で希釈し、1ミリリットル当たり140,000個の生存細胞の密度を高めます。次に、12ウェル培養プレートのPEI被覆伝票に希釈した細胞懸濁液を1ミリリットル加える。二酸化炭素インキュベーターで2〜3日間、セルを摂氏37度に保つ。細胞が安定している場合は、めっき後2~3日後、培養培地を維持培地に変更する。凍結細胞ストックの調製のために、スイングローターを使用して細胞を187回Gで3分間遠心分離するためにセルを回転させる。上清を吸引し、凍結保存培地を加え、摂氏4度に保ち、1ミリリットル当たり1000万個の細胞密度を得た。アリコート細胞懸濁液の1ミリリットルを極低温管にする。マイナス80°Cの温度に達するまで、毎分マイナス1度の凍結率で細胞凍結容器にチューブを入れます。冷凍容器をマイナス80度の冷凍庫に移します。凍結細胞を復活させるために、洗浄媒体及び凍結皮質細胞用維持培地を予め温める。次に、凍結した細胞を摂氏37度の水浴で急速に解凍する。あらかじめ温めた洗浄媒体で細胞を軽く希釈し、スイングローターを187倍Gで遠心分離機で3分間希釈します。ペレットを1ミリリットルの洗浄媒体に再懸濁し、生存可能な細胞密度を測定する。次いで、細胞を凍結皮質細胞用維持培地で希釈し、1ミリリットル当たり300000細胞の細胞密度を得た。この細胞懸濁液の1ミリリットルをPEI被覆12ウェルプレートのウェルに入れた。めっきの3~8日後のトランスフェクションの場合、2本のチューブを標識し、1つは血漿DNA用、もう1つはトランスフェクション試薬用に記載する。各チューブに、ウェルあたり50マイクロリットルの減らされた血清培地を加えます。カバースリップあたり0.5マイクログラムの血漿DNAと、ニューロン用トランスフェクション試薬を伴うサプリメント1マイクロリットルを、プラズマDNAチューブに十分に加えます。Lck-RCaMP2とOER-GCaMP6fの共同トランスフェクションの場合は、各プラスミドの0.5マイクログラムと1マイクロリットルのサプリメントを50マイクロリットルの減らされた血清培地によく混ぜます。次に、トランスフェクション試薬チューブに1ウェルあたり1マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。ボルテックス両チューブは1〜2秒間。次に、トランスフェクション試薬混合物をDNA混合物に加える。ピペットを軽く混ぜ、室温で5分間インキュベートします。この混合物をドロップワイズでセルにロードします。マーカータンパク質が発現するまで2~3日間、二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。LとOを混ぜてAAC感染を起分させる。混合ニューロン-アストロサイト培養物にAACの3マイクロリットルを加える。ミックスする皿をそっと揺らします。GEC が発現されるまで、1 週間から 2 週間培養を維持します。まず、Lck-RCaMP2およびOER-CaMPG6fを用いてトランスフェクトした細胞を含むカバースリップを顕微鏡の記録室に取り付けます。400マイクロリットルのイメージング媒体を加え、チャンバーの上に蓋を置きます。GCaMP6f用のフィルタセットと光源を選択します。OER-GCaMP6fを表現するアストロサイトを見つけます。次に、RCaMP2用のフィルタセットと光源を選択し、Lck-RCaMP2が同じアストロサイトで表現されているかどうかを確認します。2つのヘルツでLck-RCaMP2の時間経過画像を2分間記録し、イメージングデータを保存します。この後、GCaMP6fのフィルタセットを戻します。2つのヘルツでOER-GCaMP6fのタイムラプス画像を2分間記録し、イメージングデータを保存します。本研究では、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fはHeLa細胞で発現され、両方の信号をトランスフェクションの24時間後に画像分割光学を使用して同時に記録した。ヒスタミンの添加に際して、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fのシグナル強度が増加した。Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fによって報告されたカルシウムイオン標高の時間コースは、同じ関心領域で比較される。両方のセンサーは、振動状のカルシウムイオンの標高を報告します。そして、両方とも、検査された5つの細胞のうちの2つの同じ時間経過を示す。しかし、Lck-RCaMP2によって示されるカルシウムイオンの上昇は、他の細胞におけるOER-GCaMP6fよりも高いレベルにとどまっている。これらの結果は、カルシウムイオンの上昇が原形質膜付近で延長され、ヒスタミン刺激によって誘導されるこのカルシウムイオンシグナルの源であるERの周りに早期に終了することを示している。ラット海馬と皮質からのニューロン-アストロサイト混合培養中のアストロサイトからの自発的なカルシウムイオンシグナルは、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fによって示される。自発的なカルシウムイオンの標高は、以前の報告と一致する細胞体ではなく、アストロサイクプロセスでのみ表示されます。未熟ラット海馬ニューロンにおけるLck-GCaMP6fによる自発的なカルシウムイオン上昇は、2つのヘルツで見られる。関心のある 5 つの異なる地域のタイム コースは、これらの標高がローカルにサブセルラー ドメインに限定されることを示唆しています。OER-GCaMP6f-発現AAVベクターに感染した成熟したマウス海馬ニューロンは、DHPGの添加に応答してカルシウムイオン応答を示す。カルシウムイメージングの場合、励起光度が最も重要な因子です。光の漂白や光毒性を避けるために、励起光をできるだけ低くしてください。カルシウムシグナルの供給源は、カルシウムチャネルに特異的な阻害剤を用いてポマコリによってさらに確認することができる。特定の出力を呼び起こすためにカルシウム信号を解読することは、基本的な生物学的問題でした。このカルシウムイメージング技術は、細胞内カルシウムシグナルの多様性を記述する方法を開きます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

イメージング細胞内Ca<sup&gt; 2+</sup遺伝的にエンコードされたカルシウム指標を用いて成体マウスからの線条体アスト​​ロサイト&gt;シグナル

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

テタヌス刺激による局所CA1γ振動の発生

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...