Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: 일본 과학 및 기술 기관 (JST) / Precursory 연구 배아 과학 및 기술 (프레스 토) (JPMJPR15F8, 일본); 과학 (JSP)의 승진을 위한 일본 사회 / 다케다 기초 과학 연구 (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316)에 대 한 원조에 부여. 저자 RCaMP2 및 아서 재 황 제공 Haruhiko Bito (도쿄 대학)를 감사 하 고 토마스 맥 휴 (RIKEN CBS) AAV 벡터를 제공 하 고 대 한 지침은 AAV 준비에 관한. 저자는 또한 편집자 저널의 시각 실험 비디오 촬영 및 편집 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다.

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저자는 공개 없다.

다양 한 생물 학적 출력 캘리포니아2 + 신호에 의해 시작 됩니다. 캘리포니아2 + 다양 한 세포내 신호 메신저입니다. 근본적인 생물학 질문 되었습니다 특정 출력 연상 캘리포니아2 + 신호 디코딩 그리고 캘리포니아2 + 이미징 기술을 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하기 위해 필요 합니다. 현재 상세한 프로토콜 고유 Ca2 + 원형질 막 및 응급실 (그림 3 및 그림 4)와 로컬 Ca2 + microdomains (그림 4 및 그림 5) 셀 내에서 신호 감지 수 있습니다. 이 세포내 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하는에 공헌 한다. 캘리포니아2 + 의 시간적 해상도 또한 캘리포니아2 + 그리고 GECIs,의 3 차원 확산의 효과 피할 수 있고 그것이 검출 가능성이 있기 때문에 원형질 막에 응급실 GECIs를 대상으로 개량 되었다 신호는 캘리포니아2 + 유입 또는 캘리포니아2 + , 막에 발생 하는의 아주 순간.
프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 사용자가 검색 된 신호는 "캘리포니아2 + 유입 또는 릴리스 순간"의 합계 염두에 두어야 할 "캘리포니아2 + 확산 밖으로 캘리포니아2 + 원본에서", 특히 큰 캘리포니아2 + 신호에 대 한 및. 예를 들어 비록 HeLa 세포에서 그의 자극 끝 캘리포니아2 + 릴리스 응급실, ER 대상 사이트-GCaMP6f에 의해 뿐만 아니라 플라즈마 막 대상 Lck-RCaMP2 (그림 3)에 의해2 + 신호 감지의 결과 Ca에서. 또 다른 한계는 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 패턴 캘리포니아2 + 신호 출력의 유일한 결정 요인이 되지 않을 수 있습니다. 다운스트림 effector 단백질의 분포 (Ca2 +같은-종속 kinases와 가수분해)2요소를 결정할 수도 있습니다. 완전히 세포내 캘리포니아2 + 신호 디코딩,이 프로토콜에 적용 되지 않습니다, 다운스트림 효소 행동의 분석은 절대적으로 필요 하다.
성공적인 캘리포니아2 + 이미징에 대 한 가장 중요 한 측면 중 하나는 이미지 설정 및 이미지 인수 조건, 뿐만 아니라 다른 라이브 이미징 연구에 관해서는. 우리는 이전 캘리포니아2 + 응답 셀에는 높게 지 기간 및 흥분의 강도에 노출 시간 및 수집 주파수16를 포함 한 이미지 획득 조건에 보였다. 조명 전원을 광 독성 및 photobleaching GECIs의 발생할 수 있습니다 가장 중요 한 요소입니다. 노출 시간, 주파수, 흥분 빛의 강도, 및 기간 기록의 기록의 기록 조건 실험의 목적에 따라 최적화 되어야 합니다. 노출 시간 및 흥분 빛의 강도 photobleaching와 phototoxicity 셀을 피하기 위해 가능한 한 많이 감소 하는 것이 좋습니다. 녹음 주파수와 녹음 기간 Ca2 + 상승 이벤트 관심을 커버 하기에 충분 해야 하지만 또한 photobleaching 및 phototoxicity을 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지 되어야 한다. 먼저 녹음 주파수와 기간을 결정 하 고는 GECIs photobleaching 최소화 되도록 노출 시간과 빛의 강도 최적화는 것이 좋습니다. 또 다른 중요 한 요소는 GECIs 식 수준입니다. GECIs는 캘리포니아2 +-그들은 캘리포니아2 +효과 버퍼링-바인딩 단백질. 따라서, GECIs의 overexpression 셀에 대 한 생리 적으로 필요한의 캘리포니아2 +, 버퍼링 발생 합니다. GECI 식의 양은 GECIs의 높은 금액을 표현 하는 이미징 셀을 피하기 위해 최소화 한다. 
  결론적으로, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부 세포내 캘리포니아2 + 출력 생물 학적 현상을 결정 하는 신호를 해독 하는 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜의 이러한 신호 중 다양성을 설명 하기 위해 캘리포니아2 + 신호 해 부에 대 한 새로운 방법을 제공 합니다. 현재,이 기술은 체 외 실험에 대 한 제한 됩니다. 그러나, Lck-GCaMP6f 이미 쥐17, vivo에서 캘리포니아2 + 이미징에 사용 되 고 그리고 OER GCaMP6f 모니터링 Ca2 + C. 선 충7에서에서 VD 모터 뉴런에 생체 신호 확인 했다. 따라서, subcellular 격실에 있는 GECIs를 타겟팅 vivo에서 이미징 미래에, 따라서 사용 하면 Ca2 + vivo에서 해 부에 확장 될 가능성이 있다.

캘리포니아2 + 신호는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 고 도를 나타냅니다. 캘리포니아2 + 진 핵 세포에 대 한 보편적인 두 번째 메신저입니다. 를 사용 하 여 Ca2 +세포 다양 한 세포내 신호 통로 통해 작동 하 고 다양 한 생물 학적 출력을 유도. 예를 들어 뉴런, 시 냅 스 소포 릴리스 연 접 맨끝에 있는 유전자 발현, 핵에는 postsynapse에서 시 냅 스가 소성의 유도 고유한 Ca2 + 신호를 정확 하 게 적절 한 활성화에 의해 통제 된다 다운스트림 효소와 정확한 타이밍1오른쪽 사이트에서.
캘리포니아2 + 신호 특정 spatiotemporal 패턴 특정 다운스트림 효소를 활성화합니다. 캘리포니아2 + 신호를 두 개의 서로 다른 Ca2 + 소스 사이의 조정에 의해 생성 됩니다: 세포 외 공간 및 바인딩과 그물 (응급실), 세포내 캘리포니아 2 +역할에서 Ca2 + 방출 캘리포니아2 + 유입 저장. 의미 있는 spatiotemporal 캘리포니아2 + 신호 패턴을 유도 하는 특정 세포의 기능 10-100 µ M Ca2 + 캘리포니아2 + 원형질 막 또는 ER 막2채널 주변에서 생성 된 nanodomains에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 캘리포니아2 + 신호 소스 다운스트림 생물 출력을 결정 하는 가장 중요 한 요인 중 하나입니다. 신경에 있는 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 릴리스는 감마-aminobutyric 산 (GABA)A 수용 체 (GABAAR) GABAergic 시 냅 스에서의 클러스터링에 대 한 반대 효과의 저해에 대 한 책임은 신경 흥분3. 캘리포니아2 + 유입 대규모 신경 흥분을 동반 시 냅 스 GABAAR 클러스터의 분산을 유도, 영구 캘리포니아2 + 응급실에서 출시 하는 반면 시 냅 스 GABAARs의 클러스터링을 촉진. 다른 그룹 또한 성장 콘의 튜닝 방향 비판적으로 Ca2 + 신호 소스에 의존은 보고: 캘리포니아2 + 유입 유도 반발, 동안 캘리포니아2 + 릴리스 가이드 신경 성장의 매력 콘4. 따라서, 완벽 하 게 이해 하는 캘리포니아2 + 특정 세포 출력 기본 경로 신호, 그것은 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 설명 하 여 캘리포니아2 + 신호 소스를 식별 하는 것이 중요.
이 프로토콜에 우리는 Ca2 + 이미징 메서드를 Ca2 + 신호 Ca2 + 신호 소스 (그림 1)의 평가 허용 한다 subcellular 해상도에 대해 설명 합니다. 바로 아래에 원형질 막 캘리포니아2 + microdomains는 성공적으로 지표에 의해 유전으로 인코딩된 캘리포니아2 + (GECIs) 플라즈마 멤브레인 지역화 신호 Src 내 Lck의 첨부 파일을 통해 플라즈마 멤브레인을 대상으로 모니터링 GECIs5의 N termini에 니. Ca2 + 신호 패턴 더 나은 공간과 시간 해상도 응급실 주변 감지, 우리 최근 개발 OER-GCaMP6f, 어느 GCaMP6f6 대상 응급실 외부 막에서 ER 막 횡단 단백질을 사용 하 여. OER-GCaMP6f 캘리포니아2 + 그리고 GECIs의 확산을 방지 하 여 민감하게 COS-7 셀7 와 HEK293 세포8, 기존의 nontargeted GCaMP6f 보다는 더 나은 spatiotemporal 해상도에 응급실에서 Ca2 + 자료를 보고할 수 있습니다. . 우리는 또한 사이트-GCaMP6f에 의해 보고 된 교양 hippocampal 이다에서 자발적인 Ca2 + 고도 다른 spatiotemporal 패턴을 보여 확인 원형질 막 표적으로 GCaMP6f에 의해 모니터링에 비해 (Lck-GCaMP6f)7 ,9, 나타내는 Lck-GCaMP6f와 함께에서 OER-GCaMP6f와 함께 캘리포니아2 + 이미징 캘리포니아2 + 신호 그들의 소스를 식별 하기 위해 subcellular 해상도 해 부에 기여.
현재, 우리는 캘리포니아2 + 신호 해 부 HeLa 세포와 신경-사이토 혼합 유리 coverslips에 도금 하는 문화에 대 한 프로토콜을 선발. 캘리포니아2 + 이미징 기술은 GECIs와 표시 여기, Lck-GCaMP6f, 플라즈마 막 대상 RCaMP210 (Lck-RCaMP2), 고 OER-GCaMP6f (그림 1) 이러한 GECIs를 표현할 수 있는 모든 셀에 적용 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

칼슘 이온 (캘리포니아2 +)은 다양 한 생물 학적 출력으로 이어지는 여러 개의 신호 경로 드라이브 보편적인 세포내 메신저 분자 이다. 두 캘리포니아2 + 신호 소스 조정-"Ca2 + 유입"에서 셀 외부 "캘리포니아2 + 릴리스"에서 세포내 Ca2 + 저장 바인딩과 그물 (ER)-기초 캘리포니아의 다양 한 spatio 시간적 패턴으로 간주 됩니다 2 + 셀에서 여러 생물 학적 기능을 일으키는 원인이 되는 신호. 이 프로토콜의 목적은 설명 새로운 Ca2 + 이미징 방법 "캘리포니아2 + 유입"와 "캘리포니아2 + 릴리스" 순간의 모니터링 하는 것입니다. OER-GCaMP6f는 유전으로 인코딩된 Ca2 + 표시기 (GECI) 구성 된 GCaMP6f는 응급실 외부 막에 대상 이다. OER-GCaMP6f Ca2 + 출시 기존의 GCaMP6f 보다 더 높은 시간 해상도 모니터링할 수 있습니다. 원형질 막 대상 GECIs와 결합, subcellular 해상도 spatio 시간적 캘리포니아2 + 신호 패턴을 설명할 수 있습니다. Subcellular 대상 Ca2 + 지표 설명, 원리, 모든 세포 유형에 사용할 수 있는에 vivo에서에 이미지 꼬마 선 충 의입니다. 이 프로토콜에서 우리 세포, 뉴런, 그리고 해리 주 문화, glial 세포에서 캘리포니아2 + 영상 셀에 소개 하 고 쥐 대뇌 피 질의 뉴런의 냉동된 재고의 준비를 설명.

Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER HeLa 세포에 표현 했다 고 두 신호가 동시에 이미지 분할 광학, transfection (그림 3A 및 비디오 1) 후 24 h를 사용 하 여 기록 되었다. 이미지 10 Hz. 히 스타 민 (그의 1 µ M), 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 유도, 녹음 하는 동안 추가 되었다에 취득 했다. 그의 응용 프로그램에 따라 Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도 증가, δ/F0, 초기 형광 강도 (그림 3B)에서 변화를 나타내는 모조 색상 표시에 의해 표시 된 것 처럼. 캘리포니아2 + 상승 (δ/F0)의 시간 과정 보고 Lck-RCaMP2 및 GCaMP6f OER (ROI) (그림 3C)의 같은 지역에 비교 되었다. Δ/F0 값 그들의 피크 값을 다른 식 수준 및 분포는 두 개의 다른 GECIs 사이 시간 과정 비교로 정규화 되었다. 두 센서 발진 같은 Ca2 + 고도 보고. Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f 5 셀 종류 중에서 두 개의 셀에 캘리포니아2 + 상승에 대 한 동일한 시간 과정을 보여주었다 (그림 3C, 투자 수익 1 및 3)을 검사 합니다. 그러나, 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2에 의해 표시 된 OER-GCaMP6f (그림 3 C, 2, 4, 및 5 ROI) 표시에 비해 더 높은 수준에 남아 있었다. 결과 종료 이전 응급실, 주위는 그의 자극에 의해 유도 된이 Ca2 + 신호 소스 동안 Ca2 + 상승 원형질 막 주변 장기를 나타냅니다.
자연 스러운 캘리포니아2 + 쥐 된 (그림 4A)에서 문화 혼합 신경 사이토에 이다에서 신호 및 이르렀다는 (그림 4B) Lck RCaMP2 및 OER-GCaMP6f (그림 4, 비디오 2, 비디오 3에 의해 보였다 , 동영상 4, 및 비디오 5). 대뇌 피 질의 문화는이 프로토콜에 설명 된 대로 준비 된 냉동된 주식에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 신호는 동일한 셀에서 2 Hz에서 순차적으로 기록 되었다. 3 ROIs 각 GECI, 캘리포니아2 + 고도 지역에 선정 됐다 고 δ/F기본 (즉, 형광 강도)의 시간 과정 (F기본 전체 녹음 기간 동안 평균 형광 강도 변경 ). 초기 형광 안정적 이며 캘리포니아2 + 고도 보다 적게 빈번한, F기본 Ca2 + 상승 이벤트를 감지 하는 유용한 기준 된다. 자연 스러운 캘리포니아2 + 고도 astrocytic 과정에서 세포 체에서 볼 수 있었다. 이 결과 astrocytic 자발적인 Ca2 + 신호 다른 GECIs 시각화 된 생체 외에서13 그리고 vivo에서14에 의해 이전 보고서와 일치. Hippocampal와 대뇌 피 질의 이다에서 캘리포니아2 + 고도 Lck-RCaMP2 (위)에 의해 표시 된 사이트-GCaMP6f에 의해 표시 된 것 보다 더 자주 했다. 이 결과 Lck GCaMP6f 때문 이다에서 캘리포니아2 + 고도 OER GCaMP6f7 때문에 그들 보다 더 자주 검색 된 우리의 이전 데모와 일치 하 고이 개념은 또한에서 적용 된 단일 셀 수준입니다.
자발적인 캘리포니아2 + 고도 Lck-GCaMP6f에 의해 미 성숙한 쥐 hippocampal 신경 (10 DIV)에서 2 Hz (그림 5A 및 비디오 6)에서 볼 수 있었다. 5 다른 ROIs에 δ/F0의 시간 과정 캘리포니아2 + 도 이러한 subcellular 도메인에 국한 로컬로 것이 좋습니다. 그림 5B (비디오 7) Ca2 + 응답 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (30 DIV)에 감염 된 사이트-GCaMP6f-식 AAV 벡터를 보여준다. 신경 세포는 100 µ M는 주 작동 근 metabotropic 글루타민 산 염 수용 체에 대 한 유도 하는 캘리포니아2 + 버전은 DHPG으로 자극 했다. DHPG 유도 캘리포니아2 + 릴리스 OER-GCaMP6f로 검색 되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> 그림 1: 막 대상 GECIs를 보여주는 다이어그램. 원형질 막 대상 GECIs (Lck-GCaMP6f 및 RCaMP2 Lck) 및 외부 응급실의 회로도 막 대상 GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> 그림 2: hippocampal 및 대뇌 피 질의 세포 준비, 플라스 미드 transfection 그리고 AAV 감염에 대 한 순서도. 미세한 이미지는 대표, 갓 도금된 DIV 6 대뇌 피 질의 세포 (왼쪽) 및 냉동된 주식 (오른쪽)에서 세포를 부활. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> 그림 3: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. (A) 이미지 분할 광학 신호 분리의 도식 적인 표현입니다. Lck RCaMP2 및 사이트-GCaMP6f에 대 한 보기의 동일한 필드 카메라에 동시에 예상 된다. CMOS 카메라 10 Hz에서 인수 대표 녹음 비디오 1, 제공 되 고이 녹음의 한 프레임 (오른쪽) 패널 A 에 표시 됩니다. (B) δ/F0 Lck-GCaMP2 (맨 위) 및 사이트-GCaMP6f (아래)의 의사 컬러 이미지. (그의 1 µ M) 히 스타 민 Lck-GCaMP2 (마젠타색) 및 사이트-GCaMP6f (녹색)의 정규화 된 δ/F0 시간 과정 0 미 (C) 대표에 추가 되었습니다. 데이터는 각 플롯에 대 한 최대 δ/F0 값으로 정규화 되었다. 회색 막대는 그의 응용 프로그램의 타이밍을 나타냅니다. 데이터 맞춤 소프트웨어 TI 작업 대15로 분석 되었다. 눈금 막대 = 50 µ m (미세한 이미지).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> 그림 4: 자연 스러운 캘리포니아2 + 상승 Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 식에 대 한 모니터링 이다에서. (A) 대표 hippocampal 고 Lck-RCaMP2 (맨 위)와 OER-GCaMP6f (아래) 페 (B) 피 질 이다. 대뇌 피 질의 세포 냉동된 주식 문화에서 부활 했다. Lck RCaMP2 및 OER GCaMP6f 이미지 순차적으로 동일한 셀, 2 Hz, EM-CCD 카메라와 함께 인수 했다. 왼쪽된 표시는 ROIs δ/Fbase의 시간 과정 측정에 플롯 현미경 이미지에 표시 된. 데이터는 TI 워크 벤치로 분석 되었다. 실제 영화 비디오 2 동영상 3 동영상 4, 비디오 5에서 제공 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). 베이스 라인 드리프트 셀의 글로벌 Ca2 + 수준에서 변경 내용을 제안합니다.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> OER-GCaMP6f Lck GCaMP6f와 신경에 캘리포니아2 + 영상의 그림 5: 예. (A) 대표 쥐 hippocampal 신경 Lck-GCaMP6f 사업부 10 (왼쪽)와 플롯 (오른쪽) 이미지에 δ/F0 ROIs (노란색 동그라미)에 측정의 과정 표시 된 시간을 보여주는 표현 시간 과정에 있는 숫자는 이미지에 투자 수익 번호에 해당합니다. 캘리포니아2 + 상승의 시간적 패턴은 관심의 다양 한 지역 중 다른 note. 베이스 라인 드리프트가이 신경의 글로벌 Ca2 + 수준에 증가 제안합니다. (B) 성숙한 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) OER GCaMP6f 식 AAV 벡터 (왼쪽)와 감염의 예. Δ/F0 측정의 과정 플롯 보여주는 100 μ m Ca2 + 응답 시간 (RS)-3, 5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) 회색 막대로 표시 된 타이밍에 적용. 노란 동그라미 시간 코스를 얻어 ROIs의 위치를 표시 합니다. 이미지 냉각 CCD 카메라 (패널 A) 또는 EM-CCD 카메라 (패널 B) 2 Hz에 인수 되었고 티 워크 벤치와 분석. 눈금 막대 = 20 µ m (미세한 이미지). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> 비디오 1: Lck RCaMP2 그리고 HeLa 세포에 OER-GCaMP6f의 동시 이미징의 예. 대표적인 녹음 10 Hz에서 취득 하 고 그림 3에 제시. 눈금 막대 = 50 µ m.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> 비디오 2: 자연 스러운 캘리포니아2 + 과도 관찰 Lck RCaMP2 hippocampal 사이토에. 2 Hz (그림 4A)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오3 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> 비디오 3: 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 OER GCaMP6f hippocampal 사이토에. 대표 녹화 비디오 2로 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4A)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> 비디오 4: 대뇌 피 질의 사이토에 Lck-RCaMP2에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰 2 Hz (그림 4B)에서 인수 하는 대표적인 녹음 비디오5 보기의 동일한 필드에 기록. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> 비디오 5: 대뇌 피 질의 사이토에 OER-GCaMP6f에서 자발적인 캘리포니아2 + 과도 관찰. 대표 녹화 비디오4 보기의 동일한 필드에 2 Hz (그림 4B)에서 인수. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Lck-GCaMP6f에 의해 쥐 hippocampal 신경 (DIV 10)에 캘리포니아2 + 영상의 비디오 6: 예. 신경 캘리포니아2 + 의 예 2 Hz (그림 5A)에 기록 된 신호. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> 비디오 7: 캘리포니아2 + 릴리스 마우스 hippocampal 신경 (DIV 30) 표현 OER-GCaMP6f. 신경 캘리포니아2 + 신호 예제 사이트 GCaMP6f 식 AAV 벡터 (그림 5B)와 감염 마우스 hippocampal 신경에 기록. 30에 있는 100 µ M dihydroxyphenylglycine (DHPG)으로 신경 자극 했다 캘리포니아2 + 출시는 응급실에서 연상 s. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

세포 내 분해능에서 칼슘 신호의 해부는 생체 학적 현상을 결정하는 세포 내 칼슘 신호를 해독하기 위한 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜은 칼슘 유입 과 칼슘 방출의 바로 그 순간의 모니터링을 가능하게 하는 새로운 칼슘 화상 진찰 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표의 발현을 허용하는 모든 세포 유형에 적용됩니다.우리는 우리의 방법이 실험실 문화에 있는 살아있는 동물에 있는 세포 분해능에 칼슘 신호의 해부로 확장될 가능성이 있다는 것을 믿습니다. 이 절차를 입증하는 데 도움이 되는 것은 실험실의 기술자인 히로즈 마쓰미입니다. 이 절차를 시작하려면 12 웰 플레이트의 각 웰에 18 밀리미터 직경유리 커버 슬립을 놓습니다.살균된 물을 사용하고 사용 중인 12개의 웰 플레이트당 0.4%의 PEI 용액을 12.5밀리리터를 준비합니다. PEI 솔루션 의 밀리리터 를 각 웰에 추가하고 커버 전표 아래에 거품이 없는지 확인합니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 밤동안 37도의 인큐베이터에 배양하십시오.다음 날, PEI 솔루션을 제거하기 위해 흡인기를 사용합니다. 각 우물에 살균 된 물 1 밀리리터를 추가하고 덮개 슬립과 플레이트 사이의 PEI 용액이 철저히 씻겨 되도록 접시를 흔들어줍니다. 이 세척 과정을 신선한 살균 물로 2회 추가로 반복하십시오.마지막 세척 후, 완전히 각 에서 물을 흡인. 후드 내부에는 자외선을 사용하여 뚜껑 전표를 15분 이상 건조하고 살균합니다. PEI 코팅 요리는 최대 2개월 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다.진행 준비를 마쳤을 때, 사용하기 직전에 자외선으로 요리를 15분 동안 조명하십시오. 배양 배지의 증발을 방지하기 위해 우물 사이의 공간에 멸균 증류수 5밀리리터를 첨가합니다. 먼저, 인큐베이션 식염수로 코르티스를 씻으시다.그런 다음 트립신과 DNAse로 코르티치를 37도에서 5분간 인큐베이션 식염수로 배양합니다. 그런 다음, 얼음 차가운 인큐베이션 식염수로 코르티스를 세 번 씻는다. 상체를 제거하고 DNAse I 재고의 150 마이크로 리터로 보충 도금 매체의 두 밀리리터를 추가합니다.20배 이하의 파이프를 통해 세포를 해리시키고 70마이크로미터의 모공 크기로 세포 여과기를 통해 세포를 필터링한다. 다음으로, 도금 매체의 20 밀리리터로 셀 스트레이너를 씻는다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 세척 매체의 20 밀리리터로 세포를 씻으라.밀리리터 당 140 000 실행 가능한 세포의 밀도로 도금 매체로 피질 세포를 희석시. 이어서, 12개의 웰 배양 판에 PEI 코팅 커버 슬립에 희석셀 현탁액1밀리리터를 첨가한다. 2 ~3 일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 유지하십시오.세포가 안정되면, 도금 후 2~3일, 배양 배지를 유지보수 매체로 변경한다. 냉동 셀 스톡의 제조를 위해, 3 분 동안 187 배 G에서 세포를 원심 분리하는 스윙 로터를 사용하여 셀아래로 회전하십시오. 상체를 흡인하고 냉동 보존 배지를 추가하여 섭씨 4도에 보관하여 밀리리터당 1,000만 개의 세포 밀도를 얻습니다.극저온 튜브에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 알리쿼트. 영하 80도의 온도에 도달 할 때까지, 분당 영하 1도의 동결 속도와 셀 동결 용기에 튜브를 배치합니다. 냉동 용기는 영하 80도에서 냉동고로 옮춥습니다.냉동 된 세포를 부활하려면, 냉동 피질 셀에 대한 세척 매체및 유지 보수 매체를 미리 따뜻하게. 다음으로, 냉동 된 세포를 37섭씨에서 수조에서 빠르게 해동하십시오. 3분 동안 187회 G의 스윙 로터로 미리 데워진 세척 매체와 원심분리기로 세포를 부드럽게 희석시.세척 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 실행 가능한 세포 밀도를 측정합니다. 이어서, 냉동 피질 세포에 대한 유지 보수 배지로 세포를 희석하고, 밀리리터당 300 000 세포의 세포 밀도를 산출한다. PEI 코팅 12 웰 플레이트의 우물에이 세포 현탁액의 Cede 1 밀리리터.도금 후 3~8일 간 트랜스펙트의 경우, 플라즈마 DNA용, 다른 하나는 형질 검사 시약용 2개의 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 튜브에 잘 당 50 마이크로 리터의 감소 된 혈청 배지를 추가합니다. 커버 슬립 당 혈장 DNA의 0.5 마이크로 그램과 뉴런에 대한 트랜스펙트 시약을 동반 보충의 마이크로 리터, 플라즈마 DNA 튜브에 잘 당 추가합니다.Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 공동 변환을 위해 각 플라스미드의 0.5 마이크로그램과 1마이크로리터의 보충제를 잘 당 50 마이크로리터에 섞는다. 다음으로, 경질 시약 튜브에 잘 당 형질 전환 시약의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1~2초 동안 두 튜브를 소용돌이시다.그런 다음, DNA 혼합물에 경전 시약 혼합물을 추가한다. 부드럽게 파이펫을 사용하여 실온에서 5분간 혼합하고 배양합니다. 이 혼합물을 드롭-현명한 방식으로 셀에 적재합니다.마커 단백질이 발현될 때까지 2~3일 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 배양한다. AAC 감염을 만들기 위해 L과 O를 혼합합니다. 혼합 된 신경 성상세포 문화에 잘 당 AAC의 3 개의 마이크로 리터를 추가합니다.부드럽게 혼합 접시를 흔들어. GECI가 표현될 때까지 1~2주 동안 문화를 유지한다. 먼저 Lck-RCaMP2 및 OER-CaMPG6f로 감염된 세포를 포함하는 커버 슬립을 현미경의 기록 챔버에 장착합니다.이미징 배지의 마이크로리터 400기를 추가하고 챔버 위에 뚜껑을 놓습니다. GCaMP6f 및 광원에 대한 필터 세트를 선택합니다. OER-GCaMP6f를 표현하는 성상세포를 찾습니다.다음으로 RCaMP2의 필터 세트 및 광원을 선택하고 Lck-RCaMP2가 동일한 성상세포로 표현되는지 확인합니다. 2분 동안 두 Hertz에서 Lck-RCaMP2의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 그런 다음 GCaMP6f의 필터 집합을 다시 변경합니다.2분 동안 두 Hertz에서 OER-GCaMP6f의 시간 경과 이미지를 기록하고 이미징 데이터를 저장합니다. 이 연구에서는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f가 HeLa 세포에서 발현되며 두 신호모두 회전 후 24시간 광학을 분할하는 영상을 사용하여 동시에 기록되었다. 히스타민이 추가되면서 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f의 신호 강도가 증가했습니다.Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 보고된 칼슘 이온 고도의 시간 과정은 관심의 동일 지구에서 비교됩니다. 두 센서 모두 진동과 같은 칼슘 이온 고도를 보고합니다. 그리고 둘 다 검사된 5개의 세포의 2에서 동일 시간 과정을 보여줍니다.그러나, Lck-RCaMP2에 의해 표시된 칼슘 이온 고도는 그밖 세포에 있는 OER-GCaMP6f 보다는 더 높은 수준에 남아 있습니다. 이러한 결과는 혈장 막 부근에서 칼슘 이온 고도가 연장되어 히스타민 자극에 의해 유도된 이 칼슘 이온 신호의 근원인 ER 주위에서 일찍 종료된다는 것을 나타낸다. 쥐 해마와 코르티체에서 뉴런 성상세포 혼합 배양에서 성상세포에서 자발적인 칼슘 이온 신호는 Lck-RCaMP2 및 OER-GCaMP6f에 의해 표시됩니다.자발적인 칼슘 이온 고도는 이전 보고서와 일치하는 세포 본체가 아닌 성상세포 공정에서만 볼 수 있습니다. 미성숙한 쥐 해마 뉴런에서 Lck-GCaMP6f에 의한 자발적인 칼슘 이온 고도는 두 헤르츠에서 볼 수 있습니다. 관심 있는 5개 영역의 시간 과정은 이러한 고도가 로컬로 셀룰러 하위 도메인에 국한되어 있음을 시사합니다.OER-GCaMP6f 발현 AAV 벡터에 감염된 성숙한 마우스 해마 뉴런은 DHPG의 첨가에 응하여 칼슘 이온 반응을 나타낸다. 칼슘 이미징의 경우, 흥분 발광 력이 가장 중요한 요소입니다. 사진 표백및 사진 독성을 피하기 위해 흥분빛을 가능한 한 낮게 유지하십시오.칼슘 신호의 근원은 칼슘 채널에 특정 억제제를 사용하여 Pomakorzi에 의해 추가로 확인될 수 있습니다. 특정 출력을 연상시키는 칼슘 신호를 해독하는 것은 근본적인 생물학적 질문이었습니다. 이 칼슘 이미징 기술은 세포 내 칼슘 신호의 다양성을 설명하는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

이미징 세포 내 칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt; 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...