Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av følgende tilskudd: Japan vitenskap og teknologi Agency (JSO) / Precursory forskning for embryonale vitenskap og teknologi (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) / gir bistand til vitenskapelig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Forfatterne takker Haruhiko Bito (Universitetet i Tokyo) for å gi RCaMP2 og Arthur J.Y. Huang og Thomas McHugh (RIKEN CBS) gir AAV vektorer eller instruksjoner om AAV forberedelse. Forfatterne vil også gjerne takke redaktører på Journal av visualisert eksperimenter for deres hjelp med filming og redigering.

Alle eksperimenter beskrevet her ble godkjent av RIKEN sikkerhet komiteen og dyr komiteen, ifølge retningslinjen utstedt av den japanske departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi.
1. forberedelse av celler
<ol><li>Forberedelse av poly (ethyleneimine)-belagt coverslips Merk: Poly(ethyleneimine) (PEI) belegg anbefales for glass apparater, som det tillater neurons og astrocyttene knytte tett til coverslips at deres utvikling. Men er andre belegg metoder (f.eks poly-ornithine, poly L-lysin, laminin belegg) også tilgjengelig, dersom det er nødvendig, for glass-bottom retter.<ol>
<li>Plass en 18 mm-diameter glass dekkglassvæske i hver brønn av en 12-vel plate. Forberede 0,04% PEI løsning (12.5 mL/12-vel plate) bruke steriliserte vann.</li>
		<li>Legg 1 mL av 0,04% PEI løsning i hver brønn. Kontroller at det ikke er noen bobler under coverslips.</li>
		<li>Inkuber plater i en CO2 inkubator overnatting på 37 ° C.</li>
		<li>Neste dag, vask den belagt coverslips 3 x med 1 mL sterilisert vann. Fjerne PEI løsningen med en aspirator, tilsett 1 mL sterilisert vann hver brønn og riste 12-vel platen slik at PEI løsningen mellom dekkglassvæske og plate kan vaskes grundig. Den gjenværende PEI er giftig for celler, kontrollere at vannet etter siste vask er pustende helt.</li>
		<li>Tørr og sterilisere coverslips i panseret med ultrafiolett (UV) lys i minst 15 min. PEI-belagt parabolen kan lagres på 4 ° C for opptil 2 måneder. Belyse retter med UV-lys i 15 min rett før bruk.</li>
		<li>Legge til 5 mL steril destillert vann i rommet mellom brønnene å hindre fordampning av kultur medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating linjer Merk: Denne protokollen gir transfection i celler fra pattedyr cellelinjer, som HeLa cellene og COS-7 bare ett eksempel. Brukerne kan bruke andre hva protokoller som er optimalisert for sine eksperimenter. I denne delen vil vi beskrive HeLa celle kultur protokollen, som også gjelder for COS-7 celler.<ol>
<li>Dagen før transfection, kultur cellene i en 10 cm kultur rett før de oppnår 70-90% samløpet.</li>
		<li>Prewarm kultur medium (se Tabell of Materials) til 37 ° C.</li>
		<li>Vask cellene 2 x med fosfat-bufret saltvann uten Ca2 + og Mg2 + (PBS [-]).</li>
		<li>Sug opp PBS(-) legge 1 mL av 0,5% trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning og ruge cellene på 37 ° C for 90 s før de oppnår en rund form.</li>
		<li>Legge til 9 mL prewarmed kultur medium å stoppe trypsinization. Fortynne cellene med kultur medium i forholdet 1:6.</li>
		<li>Ætt 1 mL utvannet cellene i PEI-belagt coverslips i 12-vel platene.</li>
	</ol></li>
	<li>Utarbeidelse av hippocampus Nevron-astrocytter blandet kultur fra rotter eller mus Merk: Deler 1.3 og 1.4 må først bli gjennomgått og godkjent av en dyr institusjon og bruke komité og må følge offisielt godkjente prosedyrer og bruk av forsøksdyr. Flytskjemaet neuronal kultur protokollen er vist i figur 2.<ol>
<li>Forberede reagenser under laminær strømning panseret. Sted Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) i to 100 mm kultur retter (ca 20 mL/parabolen) i en Isskap.</li>
		<li>Forberede 50 mL av disseksjon mediet består av 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og DMEM (se Tabell for materiale) og mediet til tre 60 mm kultur retter (ca 7 mL/parabolen) og åtte 35 mm kultur retter (ca 2 mL/dish). Plass retter i en annen Isskap.</li>
		<li>Forberede 50 mL inkubasjon saltoppløsning, består av Hanks' balansert salt løsning med 20 mM HEPES (se Tabell for materiale), og plasser 8 mL saltkildene i et 15 mL konisk rør på is.</li>
		<li>Forberede plating mediet med minimum viktig medium (MEM) med B-27, glutamin og penicillin-streptomycin (se Tabell for materiale). Opprettholde dette mediet ved romtemperatur (20-28 ° C).</li>
		<li>Sterilisere de kirurgiske instrumentene med 70% etanol.</li>
		<li>Sett et papirhåndkle i en glasskrukke med et lokk og 1 mL av isoflurane. La isoflurane fordampe for 1 min.</li>
		<li>Plasser en gravid rotten eller en mus i glasset utarbeidet etter trinn 1.3.6 og holde dyr i glasset til det er dypt anesthetized (ca 30 s til 1 min).</li>
		<li>Ta bedøvet dyret av glasset og desinfisere dyret og disseksjon utstyr ved å sprøyte med 70% etanol. Kutte ventrale midtlinjen med standard dissecting saks og pinsetter og ekstra livmoren fra gravid rotten eller mus.</li>
		<li>Ekstra E18 – 19 embryoer fra livmoren av en bedøvet kvinnelige rotte eller mus, med delikat dissecting saks, og plassere de utpakkede embryoene med en ring tang i iskalde DMEM i 10 cm parabol for kalde anestesi.</li>
		<li>Halshugge embryoet med fine disseksjon saks og plasser hodet i iskalde DMEM i 10 cm parabol.</li>
		<li>Pakk ut hjernen fra hver embryoet med 13 cm buet Semken tang og tang med fine tips. Hold hjernen i iskalde disseksjon medium i 60 mm parabol.</li>
		<li>Fjern hippocampi, bruke to tang med fine tips, i iskalde disseksjon medium i 35 mm retter og opprettholde isolert vevet i inkubasjon saltkildene plassert i en 15 mL konisk rør på is.</li>
		<li>Vask hippocampi med inkubering saltvann og ruge trypsin (1,25 mg/mL) og DNase jeg (0,25 mg/mL) i inkubasjon saltløsning i 5 min på 37 ° C. Anbefalte inkubasjon volumet er 2,7 mL inkubasjon saltkildene, 150 µL av 20 x lager trypsin og 150 µL av 20 x lager DNase (se Tabell for materiale).</li>
		<li>Vask hippocampi 3 x med iskald inkubasjon saltvann.</li>
		<li>Sug opp den inkubasjon saltvann og legge 1 mL av plating mediet som inneholder DNase jeg (10 µL av lagerløsning, se Tabellen for materiale). Suspendere vev av pipettering mer enn 20 x og måle tettheten av levedyktig celler, med en celle teller og Trypan blå analysen.</li>
		<li>Fortynne hippocampus cellene til en tetthet på 1,4 x 105 levedyktig celler/mL for rotter og 2,5 ganger 105 levedyktig celler/mL for mus. Frø 1 mL av utvannet celle suspensjon på PEI-belagt coverslips i 12-brønnen plater.</li>
		<li>Opprettholde cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator for 2-3 dager.</li>
		<li>Fjerne plating medium. Ikke la cellene tørke ut. Forsiktig og raskt legge prewarmed vedlikehold medium (se Tabell for materiale).</li>
	</ol></li>
	<li>Utarbeidelse av rotte kortikale Nevron-astrocytter blandet kultur og frosne celler og gjenopplivingen av frosne kulturer Merk: En kryonisk bevaring metoden for kortikale cellene var beskrevet previously11. Her tilbys en endret protokoll som kortikale celler kan lagres på-80 ° C i minst 3 måneder. Flytskjema for denne protokollen er vist i figur 2.<ol>
<li>Forberede DMEM, disseksjon medium, inkubasjon saltvann og plating medium som angitt i trinn 1.3.1–1.3.4 og Tabell for materiale.</li>
		<li>Forberede vask mediet utgjorde DMEM, inaktivert fosterets bovin serum og penicillin-streptomycin (se Tabell for materiale) om nødvendig.</li>
		<li>E18 – 19 embryoer fra livmoren av en bedøvet kvinnelige rotte eller mus, med delikat disseksjon saks, og bruker ring tang plassere hver utdraget embryoet i iskalde DMEM for kalde anestesi.</li>
		<li>Fjerne hjernen fra embryoene og holde dem i iskalde disseksjon medium. Fjerne cortexes og opprettholde dem i inkubasjon saltkildene plassert i en 15 mL konisk rør på is.</li>
		<li>Vask cortexes med inkubering saltvann og ruge cortexes med trypsin (1,25 mg/mL) og DNase I (0,25 mg/mL) i inkubasjon saltløsning i 5 min på 37 ° C. Anbefalte inkubasjon volumet for 12 cortexes er 5.4 mL inkubasjon saltvann, 300 µL av 20 x lager trypsin og 300 µL av 20 x lager DNase jeg.</li>
		<li>Vask cortexes 3 x med iskald inkubasjon saltvann.</li>
		<li>Fjern nedbryting og legge 2 mL plating medium supplert med 150 µL av DNase jeg lager. Distansere cellene av pipettering mindre enn 20 slag, og filtrere cellene med en celle sil med en porestørrelse på 70 µm.</li>
		<li>Vask celle silen med 20 mL plating mediet for plating. For utarbeidelse av frosne celle lager, vask cellene med 20 mL vask medium (se Tabell for materiale)</li>
		<li>Måle tettheten av levedyktig cellene, bruke en celle teller og metoden Trypan blå.</li>
		<li>Fortynne kortikale cellene til en tetthet på 1,4 x 105 levedyktig celler/mL med plating mediet og legger 1 mL av utvannet celle suspensjon PEI-belagt coverslips i 12-brønnen platene.</li>
		<li>Opprettholde cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator for 2-3 dager og endre kultur medium til vedlikehold medium.</li>
		<li>Etter trinn 1.4.9, forberede frosne kortikale celle aksjen ved sentrifugering cellene 187 x g for 3 min, ved hjelp av en swing rotor.</li>
		<li>Sug opp nedbryting og legge kryonisk bevaring medium (se Tabell for materiale) holdt på 4 ° C, vil ha en celle tetthet av 1 x 107 celler/mL. Aliquot 1 mL av cellen suspensjon i Kryogenisk rør.</li>
		<li>Plasser rør i en celle fryse beholderen med en frysing rate av-1 ° C/min, til en temperatur på-80 ° C, og overføre fryse beholderen til en-80 ° C fryser. Cellene kan lagres i minst 3 måneder på-80 ° C.</li>
		<li>For å gjenopplive frosne celler, prewarm vask medium (ca 13 mL for hver kryogene rør) og vedlikehold medium for frosne kortikale celler (se Tabell for materiale).</li>
		<li>Tine frossen cellene raskt på 37 ° C i et vannbad.</li>
		<li>Fortynne tinte cellene forsiktig med prewarmed vask medium. Sentrifuge cellene 187 x g for 3 min, ved hjelp av en swing rotor.</li>
		<li>Avbryte pellet 1 mL av vask medium og måle levedyktig celle tetthet.</li>
		<li>Fortynne cellene med vedlikehold mediet for frosne kortikale celler å gi en celle tetthet på 3,0 x 105 levedyktig celler/mL og frø 1 mL av cellen suspensjon i PEI-belagt 12-vel platene.</li>
	</ol></li>
</ol>2. uttrykk for membran målrettede GECIs
<ol><li>
Hva med celler
	<ol>
<li>Legge til 250 ng av GECI plasmider (dvs. Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 eller OER-GCaMP6f med CMV promoter)7,8,9 til 100 µL av redusert serum medium (se Tabell for materiale) per brønn. For cotransfection av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, bruk 250 ng av hver plasmider i 100 µL av redusert serum medium i hver brønn.</li>
		<li>Legge til 0,5 µL av transfection reagensen (se Tabell for materiale) per brønn i plasmider-redusert serum middels blandingen. For cotransfection av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, legge 0,5 µL av transfection reagensen per brønn.</li>
		<li>Inkuber blandingen for 30 min ved romtemperatur (20-28 ° C).</li>
		<li>Legge til 100 µL av blandingen i hver dekkglassvæske på en drop-wise måte.</li>
		<li>Inkuber celler for 48-72 timer i en CO2 inkubator på 37 ° C å gi uttrykk for GECIs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hva og adeno-assosiert virusinfeksjon i hippocampus eller kortikale nerveceller Merk: Hva for 3-5 dager i vitro (DIV) resulterer i høyere transfection sats for neurons. Hva på 6 – 8 DIV anbefales for optimal uttrykk for GECIs i astrocyttene. For uttrykk for GECIs i dissosiert kultur neurons etter 9 DIV gir infeksjon av adeno-assosiert virus (AAV) vektorer et bedre uttrykk effekt. AAV vektorer for uttrykket av Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f under EF1a arrangører ble utarbeidet som beskrevet tidligere, bruker HEK293 celler12 (se Tabell for materiale).<ol>
<li>For hva 3-8 dager etter plating, etiketten to rør for plasmider DNA og den andre for hva reagens.</li>
		<li>Legge til 50 µL av redusert serum medium (se Tabell for materiale) per brønn til hver tube.</li>
		<li>Legg til 0,5 µg av plasmider DNA per dekkglassvæske og 1 µL av supplement ledsaget av transfection reagens for neurons (se Tabell for materiale) per brønn til plasmider DNA røret. For cotransfection av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, er 0,5 µg av hver plasmider og 1 µL av tillegget blandet i 50 µL av redusert serum medium per brønn.</li>
		<li>Legge 1 µL av transfection reagensen (se Tabell for materiale) per brønn i transfection reagens røret. Samme mengde transfection reagens brukes til cotransfection.</li>
		<li>Vortex både rør for 1-2 s.</li>
		<li>Legg transfection reagens blandingen (fra trinn 2.2.4) til DNA blanding (fra trinn 2.2.3). Blande av pipettering forsiktig og ruge blandingen (100 µL per dekkglassvæske) i 5 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Legg denne blandingen på cellene på en drop-wise måte.</li>
		<li>Inkuber cellene i en CO2 inkubator for 2-3 dager før merketråden proteiner er uttrykt.</li>
		<li>AAV infisert, Legg 3 µL av AAV per brønn til blandet Nevron-astrocytter kultur. Bland forsiktig av rocking parabolen. For dobbel infeksjon Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f introduseres 3 µL av hver AAV per brønn. Dersom antallet celler som uttrykker GECIs er utilstrekkelig, bør optimal AAV beløpet for infeksjon fastsettes.</li>
		<li>Opprettholde kultur for 1-2 uker før GECIs uttrykkes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ca2 + Imaging
<ol><li>
Samtidige imaging celler uttrykke Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f Merk: Samtidig posten Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f signaler, bilde-deling optikk er nødvendig. Optikk aktivere skillet mellom RCaMP2 og GCaMP6f og deres anslaget på samme fotografiske rammen av kameraet (figur 3A). Samtidige imaging også krever (1) lyskilder som kan samtidig eksitasjon lys i blå (450-490 nm) og grønn (500-560 nm) spectra, (2) dobbel-band filter og dichroic speil setter i mikroskopet, og (3) utslipp filtre for RCaMP2 og GCaMP6f. For detaljer, se Tabellen for materiale.<ol>
<li>Slå på bildeenheter og datamaskiner minst 30 min før innspillingen. Prewarm mikroskopet oppvarming kammer til 37 ° C. Angi bilde-deling enhet, filtre og lyskilde. Justere bilde-deling optikk slik at det samme synsfeltet vises på kameraet. Velg den aktuelle linsen (se Tabell for materiale).</li>
		<li>Transfekterte Mount dekkglassvæske som inneholder celler med Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i innspillingen kammeret, legge til passende tenkelig medium eller bufferen (400 µL for 18 mm coverslips) i kammeret, og plassere den på mikroskopet scenen. Legg lokk på opptak kammeret å unngå fordampning av mediet.</li>
		<li>Finne cellene uttrykke både Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f av fluorescerende tenkelig. Minimere eksitasjon lysintensiteten for å hindre photobleaching og Phototoksisitet.</li>
		<li>Fjern lokket og starte en tid-lapse innspillingen ved 10 Hz. Under denne innspillingen, kan du legge til Agonistiske til chamber å fremkalle Ca2 + svar (f.eks histamin for HeLa celler, ATP for COS-7 celler).</li>
		<li>Lagre time-lapse dataene i det hard diskett kjøre (HDD).</li>
		<li>Analysere dataene med analyseprogramvare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Innspillingen spontan aktiviteter av astrocyttene uttrykke Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f Merk: Uten bilde-deling optikk overvåkes Ca2 + signaler på plasma membranen og de rundt ER i samme celle. Her beskrives sekvensiell opptak av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i de samme astrocyttene. En oljeneddyp objektiv med en numerisk blenderåpning større enn 1,3 anbefales for spontane Ca2 + -aktivitet.<ol>
<li>Slå på mikroskopet, kamera, lyskilde og mikroskopet oppvarming kammer minst 30 min før opptak.</li>
		<li>Montere dekkglassvæske som inneholder cellene transfekterte med Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i innspillingen kammeret og legge til 400 µL av tenkelig medium. Sett et lokk over kammeret.</li>
		<li>Velg filtersettet for GCaMP6f og lyskilden (blått eksitasjon lys, f.eks 470– 490 nm, se Tabellen for materiale). Finn astrocyttene uttrykke OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Velge et filter og lyskilden for RCaMP2 (grønn eksitasjon lys, f.eks 510-560 nm, se Tabellen for materiale) og bekrefte om Lck-RCaMP2 uttrykkes i de samme astrocyttene. Unngå lang eksponering til lyskilden å hindre photobleaching.</li>
		<li>Ta time-lapse bilder av Lck-RCaMP2 på 2 Hz i 2 min. lagre tenkelig dataene på harddisken.</li>
		<li>Endre satt som for GCaMP6f. Ta time-lapse bilder av OER-GCaMP6f i det samme synsfeltet, på 2 Hz i 2 min. lagre dataene på harddisken.</li>
		<li>Analysere dataene med bilde analyseprogramvare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Innspillingen spontan neuronal aktivitet og indusert Ca2 + høyde i nerveceller Merk: Mikroskopet oppsettet for neuronal imaging er den samme som beskrevet i del 3.2. Her beskrives avbilding av spontane Ca2 + høyde på grunn av Lck-GCaMP6f og Ca2 + heving av mGluR aktivisering på grunn av OER-GCaMP6f.<ol>
<li>For å registrere spontan neuronal aktivitet, montere dekkglassvæske inneholder celler som uttrykker Lck-GCaMP6f i innspillingen kammeret og legge til 400 µL Imaging medium. Sett et lokk over kammeret.</li>
		<li>Angi filteret og lyskilden (blå eksitasjon, f.eks 470-790 nm, se Tabellen for materiale) de for GCaMP6f. Finne neurons uttrykke Lck-GCaMP6f og viser spontan aktivitet.</li>
		<li>Hente bilder på 2 Hz eller raskere. Lagre dataene på harddisken.</li>
		<li>Analysere dataene med bilde analyseprogramvare.</li>
		<li>For å registrere indusert Ca2 + høyde, montere coverslips inneholder celler som uttrykker OER-GCaMP6f med 400 µL imaging medium. Sett et lokk over kammeret.</li>
		<li>Bruke filtersettet for GCaMP6f, finne neurons uttrykke OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Fjern lokket. Starte det tid-lapse innspillingen på 2 Hz eller raskere. Under innspillingen, legge agonister for en Gq-protein-kombinert reseptor (f.eks mGluR5 Agonistiske [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) å fremkalle en Ca2 + utgivelse fra ER.</li>
		<li>Lagre time-lapse bildene på HDD og analysere dataene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Variert biologisk utganger er initiert av Ca2 + signaler. Ca2 + er en allsidig intracellulær signalnettverk messenger. Dekoding av Ca2 + signaler å fremkalle bestemt utganger har vært et grunnleggende biologisk spørsmål Ca2 + imaging teknikker å beskrive mangfoldet av Ca2 + signaler er nødvendig. Øyeblikket detaljert protokollen gjør at påvisning av forskjellige Ca2 + signaler i plasma membranen og ER (Figur 3 og Figur 4) og lokale Ca2 + microdomains inne i en celle (Figur 4 og figur 5). Dette bidrar til å beskrive mangfoldet av intracellulær Ca2 + signaler. Timelige oppløsningen av Ca2 + signaler ble også forbedret av målretting GECIs i plasma membranen og ER fordi den kan unngå effekten av en tredimensjonal spredning av Ca2 + og GECIs seg, og den har potensial til å oppdage den øyeblikk av Ca2 + tilstrømningen eller Ca2 + utgivelse, som oppstår på membranen.
Protokollen har noen begrensninger. Brukere bør huske på at oppdaget signaler er summering av "øyeblikk av Ca2 + tilstrømningen eller release" og "Ca2 + diffust ut fra den opprinnelige Ca2 + kilden", spesielt for store Ca2 + signaler. For eksempel, selv om hans stimulering i HeLa celler fremkaller Ca slipp2 + fra ER, den resulterende Ca2 + signaler oppdages ikke bare av ER målrettede OER-GCaMP6f, men også av plasma membran-målrettede Lck-RCaMP2 (Figur 3). En annen begrensning er at spatiotemporal mønster av Ca2 + signaler ikke kan være den eneste Determinanten av produksjonen av Ca2 + signaler. Fordelingen av nedstrøms effektor proteiner (for eksempel Ca2 +-avhengige kinaser og phosphatases) kan også være en fastsettelse faktor2. Å fullstendig dekode intracellulær Ca2 + signaler, er analyse av nedstrøms enzym atferd, som ikke dekkes i denne protokollen, absolutt nødvendig.
En av de viktigste aspektene for vellykket Ca2 + imaging er tenkelig oppsett og bilde oppkjøpet forhold, så vel som for andre live-imaging studier. Vi viste tidligere at Ca2 + svar i cellen er svært avhengige varighet og intensitet av eksitasjon og bilde oppkjøpet forhold, herunder eksponering tid og oppkjøp frekvens16. Eksitasjon belysning kraften er den mest kritiske faktoren, som det kan føre til lys giftighet og photobleaching av GECIs. Innspillingen betingelsene for eksponeringstid, frekvens, eksitasjon lav intensitet og varighet av innspillingen skal optimaliseres etter eksperimentet. Det anbefales å redusere eksponeringstid og eksitasjon lysintensiteten så mye som mulig for å unngå photobleaching og Phototoksisitet til cellen. Innspillingen hyppigheten og varigheten av innspillingen bør være tilstrekkelig til å dekke Ca2 + høyde hendelsene rundt men bør holdes så lavt som mulig for å unngå photobleaching og Phototoksisitet også. Vi anbefaler å bestemme opptak hyppigheten og varigheten først og optimalisere lysintensiteten og eksponeringstid, slik at photobleaching av GECIs er minimert. En annen viktig faktor er det uttrykket GECIs. GECIs har en Ca2 +-bufring effekt som de er Ca2 +-bindende proteiner. Derfor, overuttrykte GECIs resulterer i bufring av Ca2 +, som er fysiologisk nødvendig for cellene. Mengden av GECI uttrykk bør minimaliseres for å unngå tenkelig celler uttrykke store mengder GECIs. 
  Avslutningsvis er Disseksjon av Ca2 + signaler på en subcellular løsning en av de viktigste trinnene for dekoding intracellulær Ca2 + signaler som bestemmer det produksjon biologiske fenomenet. Denne protokollen gir en ny metode for Disseksjon av Ca2 + signaler å beskrive mangfoldet blant disse signalene. Denne teknikken er for tiden begrenset ved in vitro eksperimenter. Men Lck-GCaMP6f brukes allerede for i vivo Ca2 + bildebehandling i mus17, og OER-GCaMP6f ble bekreftet å overvåke Ca2 + signaler i vivo i VD motor neurons i C. elegans7. Derfor har målretting GECIs i subcellular rommet potensial til å bli utvidet til i vivo imaging i fremtiden, dermed muliggjør Ca2 + disseksjon i vivo.

Ca2 + signaler representerer høyden av intracellulær Ca2 + konsentrasjonen. Ca2 + er universell andre messenger for eukaryote celler. Bruker Ca2 +, celler funksjon via ulike intracellulær signalveier og indusere biologiske resultatdata. For eksempel i neurons, synaptic vesicle utgivelsen på presynaptic terminalen, genuttrykk i kjernen og induksjon av synaptiske plastisitet på postsynapse er regulert av forskjellige Ca2 + signaler som nettopp aktiverer riktig nedstrøms enzymer i riktig steder og med nøyaktige tidspunktet1.
Bestemt spatiotemporal mønstre av Ca2 + signaler aktivere bestemte nedstrøms enzymer. Ca2 + signaler genereres av koordinering mellom to ulike Ca2 + kilder: Ca2 + tilstrømningen ekstracellulære romslighet og Ca2 + utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER), som fungerer som en intracellulær Ca2 + lagre. Meningsfull spatiotemporal Ca2 + signalnettverk mønsteret å indusere en bestemt celle funksjon støttes også av nanodomains av 10-100 µM Ca2 + generert i Ca2 + kanaler på plasma membran eller ER membran2. Viktigere, er kilden av Ca2 + signaler en av de viktigste faktorene fastsettelse nedstrøms biologiske utdataene. I neurons har Ca2 + tilstrømningen og Ca2 + utgivelsen motsatt effekt på klynger av gamma - aminobutyric acid (GABA)A reseptorer (GABAAR) på GABAergic synapser, som er ansvarlig for hemming av neuronal excitability3. Ca2 + tilstrømningen ledsaget av massiv neuronal eksitasjon induserer spredning av synaptic GABAAR klynger, mens vedvarende Ca2 + slipp fra ER fremmer klynger av synaptic GABAARs. Andre grupper har også rapportert at tuning retning av veksten kjeglene er kritisk avhengig av kilden av Ca2 + : Ca2 + tilstrømningen induserer repulsjon, mens Ca2 + utgivelsen styrer tiltrekningen av den dannes hemmer nevronal veksten kjegle4. Derfor, å fullt ut forstå den Ca2 + signalnettverk trasé underliggende bestemt mobilnettet utganger, er det viktig å identifisere kilden til Ca2 + signaler ved å beskrive Ca2 + signaler på subcellular oppløsning.
I denne protokollen beskriver vi en Ca2 + bildebehandling metode for å rapportere Ca2 + signaler på subcellular oppløsning, som lar estimering av Ca2 + signalkildene (figur 1). Ca2 + microdomains like under plasma membranen overvåkes vellykket av genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) rettet mot plasma membranen via feste plasma membran-lokalisering signalet Lck i Src kinase til N-jernbanestasjonen termini GECIs5. For å oppdage Ca2 + signal mønsteret i ER bedre romlige og tidsmessige oppløsning, utviklet vi nylig OER-GCaMP6f, i som GCaMP6f6 mål ER ytre membran, bruker ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan sensitively rapportere Ca2 + utgivelse fra ER bedre spatiotemporal oppløsning enn konvensjonelle nontargeted GCaMP6f COS-7 celler7 og HEK293 celler8, ved å unngå spredningen av Ca2 + og GECIs . Vi også bekreftet at den spontane Ca2 + høyden i kulturperler hippocampus astrocyttene rapportert av OER-GCaMP6f viste et annet spatiotemporal mønster forhold som overvåkes av plasma membranen målrettede GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, som indikerer at Ca2 + bildebehandling med OER-GCaMP6f i kombinasjon med Lck-GCaMP6f bidrar til Disseksjon av Ca2 + signaler på subcellular oppløsningen å identifisere sine kilder.
For tiden detalj vi protokollen for Ca2 + signal dissection HeLa celler og Nevron-astrocytter blandet kulturer belagt på glass coverslips. Ca2 + tenkelig teknikk med GECIs angitt her, Lck-GCaMP6f, plasma membran-målrettede RCaMP210 (Lck-RCaMP2), og OER-GCaMP6f (figur 1) gjelder for alle celler som disse GECIs kan uttrykkes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Kalsium ion (Ca2 +) er en universell intracellulær messenger molekyl som driver flere signalveier, fører til ulike biologiske utganger. Samordning av to Ca2 + signalkilder-"Ca2 + tilstrømningen" fra utenfor cellen og "Ca2 + release" fra den intracellulær Ca2 + lagre endoplasmatiske retikulum (ER)-regnes som ligger til grunn for mangfoldig spatio-temporale mønstre av Ca 2 + signaliserer at flere biologiske funksjoner i cellene. Formålet med denne protokollen er å beskrive en ny Ca2 + bildebehandling metode som aktiverer overvåking av øyeblikket av "Ca2 + tilstrømningen" og "Ca2 + release". OER-GCaMP6f er en genetisk kodet Ca2 + indikator (GECI) består av GCaMP6f, som er rettet mot den ER ytre membranen. OER-GCaMP6f kan overvåke Ca2 + utgivelsen høyere timelige oppløsning enn konvensjonelle GCaMP6f. Kombinert med plasma membran-målrettet GECIs, kan spatio-temporale Ca2 + signal mønsteret beskrives subcellular oppløsning. Subcellular-målrettet Ca2 + indikatorene beskrevet her er, i prinsippet, tilgjengelig for alle celletyper, selv for i vivo bildebehandling av Caenorhabditis elegans neurons. I denne protokollen, vi introdusere Ca2 + imaging i celler fra cellelinjer, nerveceller og gliacellene i dissosiert primære kulturer og beskrive utarbeidelse av frosne lager av rotte kortikale nevroner.

LCK-RCaMP2 og OER-GCaMP6f ble uttrykt i HeLa celler, og begge signaler ble innspilt samtidig bruke bilde-deling optikk, 24 timer etter transfection (figur 3A og Video 1). Bildene ble anskaffet på 10 Hz. histamin (hans, 1 µM), som induserer Ca2 + utgivelse fra ER, ble lagt under innspillingen. Ved anvendelsen av hans økt signal intensiteten av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, som vist med pseudofarger, det vil vise ΔF/F0, som representerer endringen fra første fluorescens intensiteten (figur 3B). Tiden kurs av Ca2 + høyde (ΔF/F0) Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f ble sammenlignet i samme område av interesse (ROI) (Figur 3 c). ΔF/F0 verdiene var normalisert til toppen verdiene aktivere tid kurs sammenligningen mellom de to forskjellige GECIs, som har ulike uttrykk nivåer og distribusjoner. Begge sensorer rapporterte en svingning som Ca2 + høyde. LCK-RCaMP2 og OER-GCaMP6f viste samme tid kurset for Ca2 + høyde i to celler blant de fem celletyper undersøkt (Figur 3 c, ROI 1 og 3). Imidlertid forble Ca2 + elevations vist av Lck-RCaMP2 på et høyere nivå sammenlignet med som vist av OER-GCaMP6f (Figur 3 C, ROI 2, 4 og 5). Resultatene indikerer at Ca2 + høyden er forlenget i plasma membranen, mens det avsluttes tidligere rundt ER, som er kilden til denne Ca2 + signal forårsaket av hans stimulering.
Spontan Ca2 + signaler fra astrocyttene i Nevron-astrocytter blandet kultur fra rotte hippocampi (figur 4A) og cortexes (figur 4B) ble vist av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f (Figur 4, Video 2, Video 3 , Video 4og Video 5). Kortikale kulturer ble gjenopplivet fra frosne lager som var forberedt som beskrevet i denne protokollen. LCK-RCaMP2 og OER-GCaMP6f signaler innspilt sekvensielt på 2 Hz fra de samme cellene. Tre ROIs ble valgt i området som viste Ca2 + heving av hver GECI og time course of ΔF/Fbase (dvs. fluorescens intensiteten) endres fra gjennomsnittlig fluorescens intensiteten i hele innspillingen perioden (Fbase ). Når planlagte fluorescens er stabil og Ca2 + høyder er sjeldnere, blir Fbase en nyttig baseline å oppdage Ca2 + høyde hendelser. Spontan Ca2 + elevations var synlig bare astrocytic prosessen, ikke på celle kroppen. Dette resultatet er i samsvar med tidligere rapporter på astrocytic spontan Ca2 + signaler av andre GECIs visualisert i vitro13 og i vivo14. I både hippocampus og kortikale astrocyttene var Ca2 + elevations vist av Lck-RCaMP2 (øverst) oftere enn de som vises av OER-GCaMP6f. Dette resultatet samsvarer med våre tidligere demonstrasjon at Ca2 + høyder i astrocyttene på grunn av Lck-GCaMP6f fant oftere enn de på grunn av OER-GCaMP6f7 og foreslår at dette begrepet er også tilgjengelig i den encellede nivå.
Spontan Ca2 + elevations av Lck-GCaMP6f i umodne rotte hippocampus neurons (10 DIV) ble sett på 2 Hz (figur 5A og Video 6). Tiden kurs av ΔF/F0 i fem forskjellige ROIs foreslår at disse Ca2 + elevations lokalt er begrenset til subcellular domener. Figur 5B (Video 7) viser på Ca2 + svarene i eldre musen hippocampus neurons (30 DIV) infisert med OER-GCaMP6f-uttrykket AAV vektorer. Neurons ble stimulert med 100 µM DHPG, som agonist for metabotropic glutamat reseptorer, inducing Ca2 + utgivelsen. DHPG-indusert Ca2 + utgivelsen skyldes OER-GCaMP6f ble oppdaget.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figur 1: Diagram som viser membran målrettede GECIs. Skjematisk diagram av plasma membranen målrettede GECIs (Lck-GCaMP6f og Lck-RCaMP2) og ytre ER membran-målrettet GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figur 2: flytskjema for hippocampus og kortikale celle forberedelse, plasmider transfection og AAV infeksjon. Mikroskop-bildene er representant, fersk belagt DIV-6 kortikale celler (venstre) og gjenopplivet celler fra frosne lager (høyre). Skala bar = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figur 3: eksempel på samtidige avbilding av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa celler. (A) skjematisk fremstilling av signal separasjon med bilde-deling optikk. Samme synsfelt Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f vises samtidig på kameraet. En representant innspilling ervervet ved 10 av en CMOS kameraet leveres i Video 1, og en ramme med denne innspillingen vises i panelet A (høyre). (B) pseudo fargebilder av ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (øverst) og OER-GCaMP6f (nederst). Histamin (hans, 1 µM) ble lagt på 0 s. (C) representant normaliserte ΔF/F0 gang løpet av Lck-GCaMP2 (rosa) og OER-GCaMP6f (grønn). Data var normalisert til ΔF/F0 maksimumsverdien for hver tomt. De grå feltene angi tidspunktet for søknaden. Dataene ble analysert med en skreddersydd programvare TI Workbench15. Skala bar = 50 µm (mikroskopisk bilde).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figur 4: Spontan Ca2 + høyde i astrocyttene overvåkes for Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f. (A) representant hippocampus og (B) kortikale astrocyttene transfekterte med Lck-RCaMP2 (øverst) og OER-GCaMP6f (nederst). Kortikale celler ble gjenopplivet fra frosne lager kulturer. LCK-RCaMP2 og OER-GCaMP6f bilder anskaffet sekvensielt i samme celle, på 2 Hz, med en EM-CCD kamera. Tomter på venstre viser tiden kurs av ΔF/Fbase målt i ROIs angitt i mikroskopiske bildet. Dataene ble analysert med TI Workbench. Faktiske filmer er gitt i Video 2, Video 3, Video 4og Video 5. Baren skala = 20 µm (mikroskopisk bilde). Den opprinnelige drift tyder endringer i globalt Ca2 + nivå i cellen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figur 5: Eksempler på Ca2 + imaging i neurons med Lck-GCaMP6f og OER-GCaMP6f. (A) representant rotte hippocampus neurons uttrykke Lck-GCaMP6f DIV 10 (venstre) og tomter viser tiden kurs av ΔF/F0 målt i ROIs (gule sirkler) har vært indikert i bildet (høyre). Tallene i time course tilsvarer Avkastningen tallene i bildet. Merk at timelige mønster av Ca2 + høyde er forskjellig blant de ulike regionene rundt. Den opprinnelige drift antyder økningen i det globale Ca2 + nivået i denne Nevron. (B) et eksempel modne musen hippocampus neurons (DIV 30) infisert med OER-GCaMP6f uttrykk AAV vektorer (venstre). Tiden kurs tomt ΔF/F0 målt viser Ca2 + svaret 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) brukt på tidspunktet vist av den grå linjen. Gule sirkler viser plasseringen av ROIs der time course ble innhentet. Bildene ble kjøpt på 2 Hz med en avkjølt CCD kamera (panel A) eller en EM-CCD kamera (panel B) og analysert med TI Workbench. Skala bar = 20 µm (mikroskopisk bilde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: eksempel på samtidige imaging Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa celler. Representant innspillingen ervervet ved 10 Hz og presentert i Figur 3. Skala bar = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontan Ca2 + forbigående observert i Lck-RCaMP2 i hippocampus astrocytter. Representant opptak ervervet ved 2 Hz (figur 4A), registrert i samme synsfelt som Video 3. Skala bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontan Ca2 + forbigående observert i OER-GCaMP6f i en hippocampus astrocytter. Representant innspilling ervervet ved 2 Hz (figur 4A), i samme synsfelt som Video 2. Skala bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontan Ca2 + forbigående observert i Lck-RCaMP2 i en kortikale astrocytter representant opptak ervervet ved 2 Hz (figur 4B), registrert i samme synsfelt som Video 5. Skala bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontan Ca2 + forbigående observert i OER-GCaMP6f i en kortikale astrocytter. Representant innspilling ervervet ved 2 Hz (figur 4B) i samme synsfelt som Video 4. Baren skala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Eksempel på Ca2 + imaging i en rotte hippocampus Nevron (DIV 10) av Lck-GCaMP6f. Eksempel på neuronal Ca2 + signaler registrert på 2 Hz (figur 5A). Skala bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + utgivelse i en mus hippocampus Nevron (DIV 30) uttrykker OER-GCaMP6f. Eksempel på neuronal Ca2 + signaler registrert i en mus hippocampus Nevron infisert med OER-GCaMP6f uttrykk AAV vektorer (figur 5B). Nevron ble stimulert med 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) brukt på 30 å fremkalle Ca2 + utgivelse fra ER. Skala bar = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Disseksjon av lokale Ca2 + signaler i kulturperler celler av membran målrettede Ca2 + indikatorer

Her presenterer vi en protokoll for Ca2 + imaging i neurons og gliacellene, som gjør Disseksjon av Ca2 + signaler på subcellular oppløsning. Denne prosessen gjelder alle celletyper at uttrykket av genetisk kodet Ca2 + indikatorer.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Disseksjonen av kalsiumsignaler ved en subcellulær oppløsning, er et av de viktigste trinnene for dekoding av intracellulære kalsiumsignaler som bestemmer utgangsbiologisk fenomen. Denne protokollen beskriver en ny kalsiumavbildningsmetode som gjør det mulig å overvåke selve øyeblikket av kalsiumtilstrømningen og kalsiumutgivelsen. Denne protokollen gjelder for alle celletyper som tillater uttrykk for genetisk kodede kalsiumindikatorer.Vi mener at vår metode har potensial til å bli utvidet til disseksjon av kalsiumsignaler ved subcellulær oppløsning hos levende dyr i laboratoriekulturen. Å demonstrere prosedyren vil være Matsumi Hirose, en tekniker fra laboratoriet vårt. For å starte denne prosedyren, plasser 18 millimeter diameter glassdeksel slip i hver brønn av en 12 brønnplate.Bruk sterilisert vann, og klargjør 12,5 milliliter av en 0,4% PEI-løsning for hver 12 brønnplate som brukes. Tilsett en milliliter PEI-løsningen på hver brønn, og sørg for at det ikke er bobler under dekselslippene. Inkuber over natten i en karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius.Neste dag, bruk en aspirator for å fjerne PEI-løsningen. Tilsett en milliliter sterilisert vann til hver brønn og rist platen slik at PEI-løsningen mellom dekselet glir og platen vaskes grundig ut. Gjenta denne vaskeprosessen to ekstra ganger med friskt sterilisert vann.Etter den endelige vasken, aspirer vannet fra hver brønn helt. Inne i hetten, bruk et ultrafiolett lys til å tørke og sterilisere dekselslippene i minst 15 minutter. PEI-belagt parabolen kan lagres ved fire grader Celsius i opptil to måneder.Når du er klar til å fortsette, belyse oppvasken med det ultrafiolette lyset i 15 minutter, like før bruk. Tilsett fem milliliter sterilt destillert vann i mellomrommet mellom brønnene for å forhindre fordampning av kulturmediet. Vask først kortikene med inkubasjonss saltvann.Deretter inkubere kortiklene med Trypsin og DNAse i inkubasjonsvann i fem minutter ved 37 grader Celsius. Vask deretter kortikene tre ganger med iskald inkubasjonss saltvann. Fjern supernatant og legg til to milliliter plating medium supplert med 150 mikroliter av DnAse jeg lager.Dissosier cellene ved å pipettere tjue ganger eller mindre og filtrere cellene gjennom en cellesil med en porestørrelse på 70 mikrometer. Vask deretter cellesilen med 20 milliliter av platingmediet. For fremstilling av frossen cellelager, vask cellene med 20 milliliter av vaskemediet.Fortynn de kortikale cellene med plating medium til en tetthet på 140 000 levedyktige celler per milliliter. Deretter legger du til en milliliter av den fortynnede cellefjæringen til PEI-belagte dekselslippene i de 12 brønnkulturplatene. Opprettholde cellene ved 37 grader Celsius i en karbondioksid inkubator i to til tre dager.Når cellene er stabile, to til tre dager etter plating, endre kulturmediet til vedlikeholdsmediet. For fremstilling av frossen cellelager, spinn ned cellen, ved hjelp av en svingrotor for å sentrifuge cellene ved 187 ganger G i tre minutter. Aspirer det overnaturante og legg til kryopreservasjonsmediet, holdt på fire grader Celsius, for å oppnå en celletetthet på 10 millioner celler per milliliter.Aliquot en milliliter av celle suspensjon i kryogene rør. Plasser rørene i en cellefrysingsbeholder med en frysehastighet på minus en grader Celsius per minutt, til en temperatur på minus 80 grader Celsius er nådd. Overfør frysebeholderen til en fryser ved minus 80 grader Celsius.For å gjenopplive de frosne cellene, forvarm vaskemediet og vedlikeholdsmediet for frosne kortikale celler. Deretter tiner de frosne cellene raskt i et vannbad ved 37 grader Celsius. Fortynn cellene forsiktig med forvarmet vaskemedium og sentrifuge med en svingrotor ved 187 ganger G i tre minutter.Re-suspendere pellet i en milliliter vask medium og måle levedyktig celle tetthet. Deretter fortynner cellene med vedlikeholdsmediet for frosne kortikale celler, for å gi en celletetthet på 300 000 celler per milliliter. Cede en milliliter av denne celle suspensjon i brønnene av PEI belagt 12 brønnplater.For transfection tre til åtte dager etter plating, merke to rør, en for plasma DNA og den andre for transfection reagens. Tilsett 50 mikroliter med redusert serummedium per brønn, til hvert rør. Tilsett 0,5 mikrogram plasma-DNA per dekselslipp og ett mikroliter supplement ledsaget av transfection reagens for nevroner, per brønn til plasma-DNA-røret.For samtidig transfeksjon av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f, bland 0,5 mikrogram av hver plasmid og en mikroliter supplement i 50 mikroliter med redusert serum medium per brønn. Deretter legger du til en mikroliter transfeksjonsreagens per brønn til transfection reagensrøret. Vortex begge rørene i ett til to sekunder.Deretter legger du transfection reagensblandingen til DNA-blandingen. Pipette forsiktig for å blande og inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Last denne blandingen på cellene på en drop-wise måte.Inkuber i en karbondioksidinkubator i to til tre dager til markørproteinene uttrykkes. Bland L og O for å gjøre AAC infeksjon. Legg til tre mikroliter AAC per brønn til den blandede nevron-astrocyttkulturen.Klipp forsiktig parabolen for å blande. Opprettholde kulturen i en til to uker til GECIer uttrykkes. Monter først dekkseddelen som inneholder cellene som er infisert med Lck-RCaMP2 og OER-CaMPG6f i mikroskopets registreringskammer.Tilsett 400 mikroliter av bildemediet og legg et lokk på toppen av kammeret. Velg filtersettet for GCaMP6f og lyskilden. Finn astrocytter som uttrykker OER-GCaMP6f.Deretter velger du et filtersett og lyskilde for RCaMP2 og bekrefter om Lck-RCaMP2 uttrykkes i samme astrocytter. Ta opp tidsforløp av bilder av Lck-RCaMP2 på to Hertz i to minutter og lagre bildedataene. Etter dette, kan du endre filteret satt tilbake til det for GCaMP6f.Ta opp tidsforløp av bilder av OER-GCaMP6f på to Hertz i to minutter og lagre bildedataene. I denne studien uttrykkes Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f i HeLa-celler, og begge signalene ble registrert samtidig ved hjelp av bildesplittoptikk, 24 timer etter transinfeksjon. Ved tilsetning av Histamin økte signalintensiteten til Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f.Tidskursene for kalsiumionøkning rapportert av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f sammenlignes i de samme interesseområdene. Begge sensorene rapporterer en svingningslignende kalsiumionhøyde. Og begge viser samme tidskurs i to av de fem cellene som undersøkes.Imidlertid forblir kalsiumionøkningene vist av Lck-RCaMP2 på høyere nivå enn OER-GCaMP6f i de andre cellene. Disse resultatene indikerer at kalsiumionøkningen forlenges i nærheten av plasmamembranen, mens den avsluttes tidligere rundt ER, som er kilden til dette kalsiumionsignalet indusert av histaminstimulering. Spontane kalsiumionsignaler fra astrocytter i neuron-astrocytt blandet kultur fra rotte hippocampi og kortikalier er vist av Lck-RCaMP2 og OER-GCaMP6f.Spontane kalsiumionøkninger er bare synlige ved astrocytisk prosess, ikke i cellekroppen som er i samsvar med tidligere rapporter. Spontane kalsiumionforhøyelser av Lck-GCaMP6f i umodne rotte hippocampal nevroner er sett på to Hertz. Tidskursene for fem ulike interesseområder tyder på at disse høydene er lokalt begrenset til undercellulære domener.Modne mus hippocampal nevroner infisert med OER-GCaMP6f-uttrykk AAV vektorer viser kalsiumion svar som svar på tillegg av DHPG. For kalsiumavbildning er eksitasjonslysekraften den mest kritiske faktoren. Hold eksitasjonslyset så lavt som mulig for å unngå fotobleking og fototoksisitet.Kilden til kalsiumsignalene kan ytterligere bekreftes av Pomakorzi ved hjelp av spesifikke hemmere til kalsiumkanaler. Dekoding av kalsiumsignaler for å fremkalle spesifikk utgang har vært et grunnleggende biologisk spørsmål. Denne kalsiumavbildningsteknikken baner vei for å beskrive mangfoldet av intracellulære kalsiumsignaler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Kapasitans Målinger og Ca 2 + Imaging ved Singel nerveterminaler i Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i striatale Astrocytter fra voksne mus Bruke genetisk kodet Kalsium Indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ Imaging av enteric nervesystemet

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generasjon Lokale CA1 γ Svingninger av tetanic Stimulering

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nevroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...