Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pelos seguintes subsídios: o Japão de ciência e tecnologia agência (JST) / Precursory pesquisa embrionária ciência e tecnologia (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japão); Sociedade para a promoção da ciência (JSPS) Japão / concede auxílio para a investigação científica (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Fundação Takeda. Os autores agradecer Haruhiko Bito (Universidade de Tóquio) para fornecer RCaMP2 e Arthur J.Y. Huang e Thomas McHugh (RIKEN CBS) para a prestação de vetores AAV e para obter instruções sobre a preparação de AAV. Os autores também gostaria de agradecer editores do Journal of Experiments visualizado por sua ajuda com filmagem e edição de vídeo.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Diversas saídas biológicas são iniciadas por Ca2 + sinais. CA2 + é um mensageiro de sinalização intracelular versátil. Decodificação de Ca2 + sinais para evocar saídas específicas tem sido uma questão biológica fundamental, e Ca2 + técnicas de imagem para descrever a diversidade de Ca2 + sinais são necessárias. O protocolo atualmente detalhado permite a detecção de Ca2 + sinais distintos na membrana plasmática e ER (Figura 3 e Figura 4) e Ca2 + microdomains local dentro de uma célula (Figura 4 e Figura 5). Isto contribui para descrever a diversidade de Ca2 + sinais intracelulares. A resolução temporal de Ca2 + sinaliza também foi melhorado pela segmentação GECIs na membrana plasmática e ER porque pode evitar o efeito de uma difusão tridimensional do Ca2 + e GECIs próprios, e tem o potencial para detectar o momento do influxo de Ca2 + ou Ca2 + lançamento, que ocorre na membrana.
O protocolo tem algumas limitações. Os usuários devem ter em mente que os sinais detectados são o somatório do "momento de influxo de Ca2 + ou release" e "Ca2 + difusa para fora da fonte original de Ca2 +" , especialmente para grandes Ca2 + sinais. Por exemplo, embora sua estimulação em células HeLa evoca Ca2 + versão do PS, sua resultante Ca2 + sinais são detectados, não só pela OER-GCaMP6f ER-alvo, mas também por plasma-membrana-alvo Lck-RCaMP2 (Figura 3). Outra limitação é que o padrão spatiotemporal de Ca2 + sinais pode não ser o único determinante da saída de Ca2 + sinais. A distribuição das proteínas efetoras a jusante (tais como Ca2 +-dependentes quinases e fosfatases) pode também ser uma determinação do fator2. Para decodificar completamente os sinais intracelulares de Ca2 + , análise do comportamento da enzima a jusante, não abrangida no presente protocolo, é absolutamente necessário.
Um dos aspectos mais críticos para a bem sucedida Ca2 + imagem latente é a aquisição de imagens de instalação e imagem condições, bem como para outros estudos de imagem ao vivo. Mostramos anteriormente que Ca2 + respostas na célula são altamente dependentes da duração e intensidade da excitação e sobre as condições de aquisição de imagem, incluindo a exposição tempo e aquisição de frequência16. Poder da iluminação da excitação é o fator mais crítico, pois pode causar toxicidade leve e fotobranqueamento do GECIs. As condições de gravação de tempo de exposição, frequência, intensidade de luz de excitação e duração da gravação de gravação devem ser otimizadas de acordo com a finalidade do experimento. Recomenda-se reduzir o tempo de exposição e a intensidade de luz de excitação tanto quanto possível para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade à célula. A frequência de gravação e a duração da gravação devem ser suficientes para cobrir os Ca2 + elevação eventos de interesse, mas devem ser mantidas tão baixas quanto possível para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade também. Recomendamos que determinar a frequência de gravação e a duração primeiro e otimizando a intensidade da luz e o tempo de exposição para que o fotobranqueamento dos GECIs é minimizado. Outro fator importante é o nível de expressão dos GECIs. GECIs tem um Ca2 +-buffer efeito como eles estão Ca2 +-proteínas de ligação. Portanto, a superexpressão do GECIs resultados no buffer de Ca2 +, que é fisiologicamente necessário para as células. A quantidade de expressão Lino deve ser minimizada para evitar imagem células expressando quantidades elevadas de GECIs. 
  Em conclusão, a dissecação de Ca2 + sinais em uma resolução subcellular é um dos mais importantes passos para descodificando Ca2 + sinais intracelulares que determinam o fenômeno biológico de saída. Este protocolo fornece um novo método para a dissecação de Ca2 + sinais para descrever a diversidade entre esses sinais. Atualmente, esta técnica é limitada para experimentos in vitro. No entanto, Lck-GCaMP6f já está sendo usado para a vivo em Ca2 + imagem latente em ratos17e OER-GCaMP6f foi confirmado monitorar Ca2 + sinais em in vivo, os neurônios motores VD em c. elegans7. Portanto, visando GECIs no compartimento subcelular tem potencial para ser expandido para in vivo de imagem no futuro, assim permitindo Ca2 + dissecação em vivo.

CA2 + sinais representam a elevação da concentração Ca2 + intracelular. CA2 + é o segundo mensageiro universal para as células eucarióticas. Usando Ca2 +, células funcionam através de diversas vias de sinalização intracelulares e induzem várias saídas biológicas. Por exemplo, nos neurônios, liberação da vesícula sináptica no terminal pré-sináptica, expressão gênica no núcleo e indução da plasticidade sináptica no postsynapse são regulados por distintas Ca2 + sinais de que precisamente, ativam o apropriado a jusante enzimas nos locais certo e com sincronismo exato1.
Padrões específicos de spatiotemporal de Ca2 + sinais ativam as enzimas específicas a jusante. CA2 + sinais são gerados pela coordenação entre duas diferentes Ca2 + fontes: Ca2 + influxo do espaço extracelular e Ca2 + lançamento do retículo endoplasmático (ER), que serve como uma Ca intracelular2 + loja. O significativo spatiotemporal Ca2 + sinalização padrão para induzir uma função de célula específica também é suportado pelo nanodomains de 10 a 100 µM Ca2 + gerado nas proximidades de Ca2 + canais na membrana plasmática ou membrana de ER2. Importante, a fonte de Ca2 + sinais é um dos fatores mais críticos determinando a saída biológica a jusante. Nos neurônios, influxo de Ca2 + e liberação de Ca2 + têm efeitos opostos sobre o agrupamento de ácido gama - aminobutírico (GABA)A receptores (GABAAR) nas sinapses gabaérgica, que é responsável para a inibição da excitabilidade neuronal3. CA2 + influxo acompanhado de excitação neuronal maciça induz a dispersão dos aglomerados de GABAAR sinápticas, Considerando que o persistente Ca2 + versão do PS promove a aglomeração de sináptica GABAARs. Outros grupos também relataram que a direção de ajuste dos cones de crescimento é criticamente dependente da fonte do sinal de Ca2 + : induz o influxo de Ca2 + repulsão, enquanto a liberação de Ca2 + orienta a atração do crescimento neuronal cone4. Portanto, para compreender o Ca2 + sinalização de caminhos subjacentes saídas celulares específicas, é importante identificar a fonte de Ca2 + sinais descrevendo Ca2 + sinais na resolução subcellular.
Neste protocolo, descrevemos um Ca2 + método de imagem para Ca2 + os sinais na resolução subcelular, que permite a estimativa das Ca2 + fontes de sinal (Figura 1). CA2 + microdomains logo abaixo da membrana plasmática com êxito são monitorados por geneticamente codificado Ca2 + indicadores (GECIs) direcionados para a membrana plasmática através de penhora de sinal a membrana plasmática-localização Lck dentro Src quinase para a N-termini do GECIs5. Para detectar o Ca2 + sinal padrão nas proximidades do ER em uma melhor resolução espacial e temporal, recentemente desenvolvemos OER-GCaMP6f, no qual GCaMP6f6 alvos a ER exterior da membrana, usando a proteína transmembrana de ER. OER-GCaMP6f com sensibilidade pode relatar Ca2 + lançamento da emergência em uma melhor resolução spatiotemporal do que GCaMP6f convencional de células COS-77 e de células HEK2938, evitando a difusão de Ca2 + e GECIs . Também confirmamos que a espontânea Ca2 + elevação no culturas astrócitos hippocampal relatado por OER-GCaMP6f mostrou um padrão spatiotemporal diferente em comparação com monitorado pelo GCaMP6f membrana plasmática-alvo (Lck-GCaMP6f)7 ,9, indicando que o Ca2 + imagem com OER-GCaMP6f em combinação com Lck-GCaMP6f contribui para a dissecação de Ca2 + sinais na resolução subcellular para identificar suas fontes.
Atualmente, detalhamos o protocolo para o Ca2 + sinal dissecção em células HeLa e neurônio-astrocyte misturadas culturas chapeadas em lamelas de vidro. A Ca2 + técnica de imagem com GECIs indicado aqui, Lck-GCaMP6f, plasma-membrana-alvo RCaMP210 (Lck-RCaMP2), e OER-GCaMP6f (Figura 1) são aplicáveis a todas as células em que estes GECIs podem ser expressa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Íon cálcio (Ca2 +) é uma molécula de mensageiro intracelular universal que impulsiona múltiplas vias de sinalização, levando a diversas saídas biológicas. A coordenação de duas Ca2 + sinal fontes — "Ca2 + influxo" de fora da célula e "Ca2 + libertado" do Ca2 + intracelular armazenar retículo endoplasmático (ER) — é considerado fundamentam os padrões espaço-temporais diversos de Ca 2 + sinais que causam várias funções biológicas nas células. O propósito do presente protocolo é descrever um Nova Ca2 + método de imagem que permite a monitoração do momento do "Ca2 + influxo" e "Ca2 + release". OER-GCaMP6f é um geneticamente codificado Ca2 + indicador (Lino) composto por GCaMP6f, que é direcionado para a membrana externa do ER. OER-GCaMP6f pode monitorar Ca2 + lançamento em uma maior resolução temporal que GCaMP6f convencional. Combinado com a membrana plasmática-alvo GECIs, o espaço-temporais Ca2 + sinal padrão pode ser descrito em uma resolução subcellular. Os subcellular-alvo Ca2 + indicadores descritos aqui são, em princípio, disponível para todos os tipos de célula, mesmo para a vivo em imagem de neurônios Caenorhabditis elegans . Neste protocolo, apresentamos Ca2 + imagem latente nas células de linhas de células, neurônios e células gliais em culturas primárias dissociadas e descrever a preparação de estoque congelado de neurônios corticais de rato.

Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f foram expressas em células HeLa, e ambos os sinais foram gravados simultaneamente divisão de imagem óptica, 24h depois do transfection (Figura 3A e vídeo 1). As imagens foram adquiridas em 10 Hz. histamina (dele, 1 µM), que induz o Ca2 + lançamento da emergência, foi adicionado durante a gravação. O pedido dele, aumentou a intensidade do sinal de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, conforme mostrado pelo visor pseudocolorida de ΔF/F0, que representa a variação da intensidade da fluorescência inicial (Figura 3B). Os cursos de tempo de Ca2 + elevação (ΔF/F0) relatados pelo Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f foram comparados na mesma região de interesse (ROI) (Figura 3). Os valores ΔF/F0 foram normalizados para seus valores de pico para permitir a comparação de curso do tempo entre os dois GECIs diferentes, que têm distribuições e níveis diferentes de expressão. Ambos os sensores relataram uma oscilação, como Ca2 + elevação. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f mostrou o mesmo tempo de curso para elevação de Ca2 + em duas células entre os tipos de cinco célula examinados (Figura 3, ROI 1 e 3). No entanto, Ca2 + elevações mostradas pela Lck-RCaMP2 permaneceram em um nível mais elevado em comparação ao mostrado por OER-GCaMP6f (Figura 3 C, ROI, 2, 4 e 5). Os resultados indicam que a elevação de Ca2 + é prorrogada nas proximidades da membrana plasmática, enquanto que seja finalizada antes em torno da ER, que é a origem deste Ca2 + sinal induzido por sua estimulação.
Espontânea Ca2 + sinais de astrócitos no neurônio-astrocyte misturado a cultura do hipocampo de rato (Figura 4A) e corticais (Figura 4B) foram mostrados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f (Figura 4, vídeo 2, vídeo 3 de , Vídeo 4e vídeo 5). Culturas corticais foram revividas do estoque congelado que foi preparado como descrito no presente protocolo. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f sinais sequencialmente foram gravados em 2 Hz a partir das mesmas células. Três ROIs foram selecionados na área que mostrou elevação de Ca2 + por cada Lino, e o curso do tempo de ΔF/Fbase (ou seja, a intensidade de fluorescência) alterado da intensidade da fluorescência média durante o período de gravação (Fbase ). Quando a fluorescência de base é estável e Ca2 + elevações são menos frequentes, Fbase torna-se uma base útil para detectar eventos de elevação do Ca2 + . Espontânea Ca2 + elevações eram visíveis apenas no processo de hamartomas, não para o corpo da célula. Este resultado é consistente com os relatórios anteriores sobre hamartomas Ca2 + sinais espontâneos por outros GECIs visualizado in-vitro13 e vivo em14. No hipocampo e corticais astrócitos, Ca2 + elevações mostradas pela Lck-RCaMP2 (topo) foram mais frequentes do que as mostradas pela OER-GCaMP6f. Este resultado é consistente com nossa demonstração anterior que Ca2 + elevações em astrócitos devido a Lck-GCaMP6f foram detectadas mais frequentemente do que as causadas por OER-GCaMP6f7 e sugere que esta noção também é aplicável na nível de célula única.
Espontânea Ca2 + elevações por Lck-GCaMP6f em neurônios hippocampal do rato imaturo (DIV 10) foram vistas em 2 Hz (Figura 5A e 6 de vídeo). Os cursos de tempo de ΔF/F0 em cinco diferentes ROIs sugerem que estas elevações de Ca2 + são localmente confinadas aos domínios subcellular. Figura 5B (Vídeo 7) mostraas Ca 2 + respostas nos neurônios hippocampal do rato maduro (DIV 30) infectadas com vetores AAV OER-GCaMP6f-expressão. Os neurônios foram estimulados com 100 µM DHPG, que é o agonista de receptores metabotrópicos de glutamato, induzindo a liberação de Ca2 + . Induzida por DHPG Ca2 + versão devido a OER-GCaMP6f foi detectado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figura 1: diagrama mostrando a membrana-alvo GECIs. Diagrama esquemático da membrana plasmática-alvo GECIs (Lck-GCaMP6f e Lck-RCaMP2) e ER exterior membrana-alvo GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figura 2: fluxograma para a preparação de células corticais e hippocampal transfeccao Plasmideo e infecção de AAV. As imagens microscópicas são representativos, recém chapeado DIV-6 células corticais (à esquerda) e células do estoque congelado (à direita) é revivido. Barra de escala = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figura 3: exemplo da imagem simultânea de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f em células HeLa. (A) representação esquemática da separação de sinal com a divisão de imagem óptica. Projeta-se simultaneamente o mesmo campo de visão para Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f da câmera. Uma gravação representante adquirida a 10 Hz por uma câmera do CMOS é fornecida em Video 1, e um quadro da gravação é mostrado no painel A (à direita). (B) imagens de pseudo cor de ΔF/F0 para Lck-GCaMP2 (topo) e OER-GCaMP6f (parte inferior). Histamina (dele, 1 µM) foi adicionada no representante de (C) 0 s. curso de hora ΔF/F0 normalizada de Lck-GCaMP2 (magenta) e OER-GCaMP6f (verde). Dados foram normalizados para o valor máximo de ΔF/F0 para cada parcela. As barras cinza indicam o momento de sua aplicação. Os dados foram analisados com um software feito por TI Workbench15. Barra de escala = 50 µm (imagem microscópica).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figura 4: Espontânea de Ca2 + elevação em astrócitos monitorado para expressão Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f. (A) representante hippocampal e (B) astrócitos corticais transfectados com Lck-RCaMP2 (topo) e OER-GCaMP6f (parte inferior). Células corticais foram revividas de culturas estoque congeladas. Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f imagens sequencialmente foram adquiridas na mesma cela, em 2 Hz, com uma câmera EM-CCD. As parcelas do show esquerdo ΔF/Fbase cursos de tempo medidos no ROIs indicaram na imagem microscópica. Os dados foram analisados com bancada de trabalho de TI. Filmes reais são fornecidos em vídeo 2, vídeo 3, vídeo 4e vídeo 5. Barra de escala = 20 µm (imagem microscópica). A deriva de base sugere que as alterações a nível global Ca2 + na célula.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figura 5: Exemplos de Ca2 + imagem nos neurônios com Lck-GCaMP6f e OER-GCaMP6f. (A) representante rato hippocampal neurônios expressando Lck-GCaMP6f no DIV 10 (à esquerda) e parcelas mostrando o tempo cursos de ΔF/F0 medidos no ROIs (círculos amarelos) tem sido indicados na imagem (à direita). Os números no curso de tempo correspondem aos números ROI na imagem. Note que o padrão temporal de elevação de Ca2 + é diferente entre as várias regiões de interesse. A deriva de base sugere o aumento do Ca2 + nível global neste neurônio. (B) um exemplo de neurônios hippocampal rato maduro (DIV 30) infectados com vetores AAV expressão OER-GCaMP6f (à esquerda). O tempo trama do curso de ΔF/F0 medidos mostra a Ca2 + resposta a 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado na hora mostrada pela barra cinza. Círculos amarelos mostram a posição de ROIs, onde obteve-se o curso do tempo. As imagens foram adquiridas em 2 Hz com uma câmara de refrigeração-CCD (painel A) ou uma câmera CCD EM (painel B) e analisadas com bancada de trabalho de TI. Barra de escala = 20 µm (imagem microscópica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: exemplo de imagem simultânea de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f em células HeLa. Gravação de representante adquiriu a 10 Hz e apresentado na Figura 3. Barra de escala = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Vídeo 2: Transiente de espontânea de Ca2 + observada em Lck-RCaMP2 em astrocyte hippocampal. Gravação representante adquiriu a 2 Hz (Figura 4A), gravado no mesmo campo de visão como vídeo 3. Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Vídeo 3: Transiente de espontânea de Ca2 + observada em OER-GCaMP6f em um astrocyte hippocampal. Gravação representante adquirida a 2 Hz (Figura 4A), no mesmo campo de visão como vídeo 2. Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Vídeo 4: Transiente de espontânea de Ca2 + observada em Lck-RCaMP2 em um astrocyte cortical representante gravação adquiriu a 2 Hz (Figura 4B), gravado no mesmo campo de visão como Video 5. Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Vídeo 5: Transiente de espontânea de Ca2 + observada em OER-GCaMP6f em um astrocyte cortical. Gravação representante adquirida a 2 Hz (Figura 4B), no mesmo campo de visão como Video 4. Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Vídeo 6: Exemplo de Ca2 + imagem em um neurônio hippocampal rato (DIV 10) pela Lck-GCaMP6f. Exemplo de neuronal Ca2 + sinais gravados em 2 Hz (Figura 5A). Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Vídeo 7: Ca2 + lançamento em um neurônio hippocampal do rato (DIV 30) expressando OER-GCaMP6f. Exemplo de Ca2 + sinais neurológicos gravado em um neurônio hippocampal do rato infectado com vetores AAV OER-GCaMP6f expressão (Figura 5B). O neurônio foi estimulado com 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado em 30 s para evocar Ca2 + lançamento da emergência. Barra de escala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

A dissecção de sinais de cálcio em uma resolução subcelular, é um dos passos mais importantes para a decodificação de sinais intracelulares de cálcio que determinam o fenômeno biológico da saída. Este protocolo descreve um novo método de imagem de cálcio que permite o monitoramento do momento do influxo de cálcio e liberação de cálcio. Este protocolo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de indicadores de cálcio geneticamente codificados.Acreditamos que nosso método tem potencial para ser expandido para a dissecção de sinais de cálcio na resolução subcelular em animais vivos na cultura de laboratório. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Matsumi Hirose, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque uma tampa de vidro de 18 milímetros de diâmetro em cada poço de uma placa de 12 poços.Use água esterilizada e prepare 12,5 mililitros de uma solução PEI de 0,4% para cada placa de poço que está sendo utilizada. Adicione um mililitro da solução PEI a cada poço e certifique-se de que não há bolhas por baixo dos deslizamentos de cobertura. Incubar durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.No dia seguinte, use um aspirador para remover a solução PEI. Adicione um mililitro de água esterilizada em cada poço e agite a placa para que a solução PEI entre o deslizamento da tampa e a placa seja completamente lavada. Repita este processo de lavagem duas vezes adicionais com água esterilizada fresca.Após a lavagem final, aspire a água de cada poço completamente. Dentro do capô, use uma luz ultravioleta para secar e esterilizar os deslizamentos de cobertura por pelo menos 15 minutos. O prato revestido pei pode ser armazenado a quatro graus Celsius por até dois meses.Quando estiver pronto para prosseguir, ilumine os pratos com a luz ultravioleta por 15 minutos, pouco antes de usar. Adicione cinco mililitros de água destilada estéril no espaço entre os poços para evitar a evaporação do meio cultural. Primeiro, lave os cortices com soro fisiológico de incubação.Em seguida, incubar os cortices com Trypsin e DNAse em soro fisiológico de incubação por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os cortices três vezes com soro fisiológico de incubação gelada. Remova o supernatante e adicione dois mililitros de meio de revestimento suplementados com 150 microliters de estoque DNAse I.Dissociar as células por pipetação vinte vezes ou menos e filtrar as células através de um coador de células com um tamanho de poro de 70 micrômetros. Em seguida, lave o coador de células com 20 mililitros do meio de revestimento. Para a preparação do caldo celular congelado, lave as células com 20 mililitros do meio de lavagem.Diluir as células corticais com o meio de chapeamento a uma densidade de 140 000 células viáveis por mililitro. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular diluída aos deslizamentos de tampa revestidos pei nas 12 placas de cultura de poço. Mantenha as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por dois a três dias.Quando as células estiverem estáveis, dois a três dias após o revestimento, mude o meio de cultura para o meio de manutenção. Para a preparação do caldo celular congelado, gire pela célula, usando um rotor de balanço para centrifugar as células a 187 vezes G por três minutos. Aspire o supernasce e adicione o meio criopreservador, mantido a quatro graus Celsius, para obter uma densidade celular de 10 milhões de células por mililitro.Alíquota de um mililitro da suspensão celular em tubos criogênicos. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento celular com uma taxa de congelamento de menos um grau Celsius por minuto, até que uma temperatura de menos 80 graus Celsius seja atingida. Transfira o recipiente de congelamento para um congelador a menos 80 graus Celsius.Para reviver as células congeladas, pré-aqueça o meio de lavagem e o meio de manutenção para células corticais congeladas. Em seguida, descongele as células congeladas rapidamente em um banho de água a 37 graus Celsius. Diluir as células suavemente com meio de lavagem pré-aquecido e centrífuga com um rotor de balanço a 187 vezes G por três minutos.Suspenda a pelota em um mililitro de meio de lavagem e meça a densidade celular viável. Em seguida, diluir as células com o meio de manutenção para células corticais congeladas, para produzir uma densidade celular de 300 000 células por mililitro. Ceda um mililitro desta suspensão celular nos poços do PEI revestido 12 placas de poço.Para transfecção de três a oito dias após o revestimento, rotule dois tubos, um para DNA de plasma e outro para o reagente de transfecção. Adicione 50 microliters de meio soro reduzido por poço, a cada tubo. Adicione 0,5 microgramas de DNA plasmá plasma por deslizamento de cobertura e um microliter de suplemento acompanhado de reagente de transfecção para neurônios, por bem ao tubo de DNA plasmá plasma.Para a co-transfecção de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f, misture 0,5 microgramas de cada plasmídeo e um microlitr de suplemento em 50 microliters de meio soro reduzido por poço. Em seguida, adicione um microliter de reagente de transfecção por poço ao tubo de reagente de transfecção. Vórtice ambos os tubos por um a dois segundos.Em seguida, adicione a mistura de reagente de transfecção à mistura de DNA. Pipeta suavemente para misturar e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque essa mistura nas células de uma maneira que caia.Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono por dois a três dias até que as proteínas marcadoras sejam expressas. Misture L e O para fazer a infecção aac. Adicione três microliters de AAC por poço à cultura neurônio-astrócito mista.Balance suavemente o prato para misturar. Mantenha a cultura por uma a duas semanas até que os GECIs sejam expressos. Primeiro monte o deslizamento de cobertura contendo as células transfeinadas com Lck-RCaMP2 e OER-CaMPG6f na câmara de gravação do microscópio.Adicione 400 microliters do meio de imagem e coloque uma tampa em cima da câmara. Escolha o conjunto de filtros para GCaMP6f e a fonte de luz. Localize os astrócitos expressando OER-GCaMP6f.Em seguida, escolha um conjunto de filtro e fonte de luz para RCaMP2 e confirme se Lck-RCaMP2 é expresso nos mesmos astrócitos. Registo de tempo de Lck-RCaMP2 em dois Hertz por dois minutos e salve os dados de imagem. Depois disso, altere o filtro para o GCaMP6f.Registo de tempo de OER-GCaMP6f em dois Hertz por dois minutos e salve os dados de imagem. Neste estudo, Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f são expressos em células HeLa e ambos os sinais foram registrados simultaneamente usando óptica de divisão de imagem, 24 horas após a transfecção. Após a adição de Histamina, a intensidade do sinal de Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f aumentou.Os cursos de tempo de elevação da íon de cálcio relatados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f são comparados nas mesmas regiões de interesse. Ambos os sensores relatam uma elevação de íons de cálcio semelhante à oscilação. E ambos mostram o mesmo curso de tempo em duas das cinco células examinadas.No entanto, as elevações de íons de cálcio mostradas por Lck-RCaMP2 permanecem no nível mais alto do que OER-GCaMP6f nas outras células. Estes resultados indicam que a elevação da íon de cálcio é prolongada nas proximidades da membrana plasmática, enquanto é interrompida mais cedo em torno do ER, que é a fonte deste sinal de íon de cálcio induzido pela estimulação de histamina. Sinais espontâneos de íons de cálcio de astrócitos na cultura mista neurônio-astrócito de hipocampi de ratos e cortices são mostrados por Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f.Elevações espontâneas de íons de cálcio são visíveis apenas no processo astrócito, não no corpo celular que é consistente com relatórios anteriores. Elevações espontâneas de íons de cálcio por Lck-GCaMP6f em neurônios hipocampais de ratos imaturos são vistas em dois Hertz. Os cursos de tempo para cinco regiões de interesse diferentes sugerem que essas elevações estão localmente confinadas aos domínios subcelulares.Neurônios hipocampais de camundongos maduros infectados com vetores AAV de expressão OER-GCaMP6f mostram respostas de íons de cálcio em resposta à adição de DHPG. Para a imagem de cálcio, o poder de luminação excitação é o fator mais crítico. Por favor, mantenha a luz de excitação o mais baixa possível para evitar o branqueamento de fotos e foto-toxicidade.A fonte dos sinais de cálcio pode ser confirmada por Pomakorzi usando inibidores específicos para canais de cálcio. A decodificação de sinais de cálcio para evocar saída específica tem sido uma questão biológica fundamental. Esta técnica de imagem de cálcio abre caminho para descrever a diversidade de sinais intracelulares de cálcio.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imagens intracelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitocondrial Ca2 + retenção capacidade do ensaio e Ca2 +-provocou inchaço mitocondrial do ensaio

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...