Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Эта работа поддерживается следующие гранты: Япония науки и техники Агентство (JST) / Precursory исследования эмбриональных науки и технологии (PRESTO) (JPMJPR15F8, Япония); Японское общество содействия развитию науки (JSP) / гранты в помощи для научных исследований (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Фонд Такэда. Авторы благодарят Haruhiko Бито (Университет Токио) за предоставление RCaMP2 и Артур Д.Ю Huang и Томас Макхью (RIKEN CBS) для предоставления векторы AAV и инструкции в отношении подготовки AAV. Авторы хотели бы также поблагодарить редакторов в журнал визуализировать эксперименты за их помощь с видео съемки и редактирования.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Разнообразные биологические выходы инициируются Ca2 + сигналов. CA2 + является универсальным внутриклеточных сигнальных messenger. Декодирование Ca2 + сигналы вызывают конкретные мероприятия был фундаментальный вопрос биологического, и Ca2 + методы для описания многообразия Ca2 + сигналов визуализации не требуется. В настоящее время подробный протокол позволяет обнаружение собственный Ca2 + сигналов на плазматической мембраны и ER (рис. 3 и рис. 4) и местные Ca2 + microdomains в ячейку (рис. 4 и 5). Это способствует описания самых различных внутриклеточных Ca2 + сигналов. Временное разрешение Ca2 + сигналов, также была улучшена путем ориентации GECIs в плазматической мембраны и ER, потому что это может избежать эффекта трехмерного диффузии Ca2 + и GECIs себя, и она имеет потенциал, чтобы обнаружить момент Ca2 + приток или Ca2 + релиз, в котором происходит на мембране.
Протокол имеет некоторые ограничения. Пользователи должны иметь в виду, что обнаруженные сигналы являются суммирование «момент Ca2 + приток или освобождения» и «Ca2 + рассеянный от первоначального Ca2 + источника», особенно для больших Ca2 + сигналов. Например хотя его стимуляции клеток HeLa вызывает Ca2 + освобождение от ER, его результирующей Ca2 + сигналы обнаруживаются не только ER-целевой ООР-GCaMP6f, но и плазмы мембраны ориентированные Lck-RCaMP2 (рис. 3). Другое ограничение состоит, что пространственно-временных шаблон Ca2 + сигналов не может быть единственным определяющим фактором вывода Ca2 + сигналов. Распределение по течению эффекторных белков (например Ca2 +-зависимые киназы и фосфатаз) также может быть определяющим фактором2. Полностью расшифровать внутриклеточные сигналы Ca2 + , анализ поведения течению фермента, который не рассматривается в настоящем Протоколе, является абсолютно необходимым.
Одним из наиболее важных аспектов для успешного Ca2 + изображений является изображения установки и изображения приобретение условия, а также как другие исследования жить изображений. Ранее мы показали, что Ca2 + ответы в ячейке сильно зависит от продолжительности и интенсивности возбуждения и на условиях приобретения изображений, включая воздействия времени и приобретение частот16. Мощность освещения возбуждения является самым важным фактором, как это может вызвать токсическое воздействие света и Фотообесцвечивание GECIs. Запись условия время экспозиции, запись частоты, интенсивности света возбуждения и продолжительность записи должны быть оптимизированы согласно цели эксперимента. Мы рекомендуем сократить время экспозиции и возбуждения света, насколько это возможно избежать Фотообесцвечивание и фототоксичности на ячейку. Запись частоты и продолжительности записи должно быть достаточно для покрытия Ca2 + высота события, представляющие интерес, но должны храниться как низкий, как можно избежать Фотообесцвечивание и Фототоксичность также. Мы рекомендуем сначала определить запись частоты и продолжительности и оптимизации интенсивности света и времени экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание GECIs. Еще одним важным фактором является уровень экспрессии GECIs. GECIs у Ca2 +-буферизация эффект, поскольку они Ca2 +-привязка белков. Таким образом гиперэкспрессия GECIs приводит к буферизации Ca2 +, который является физиологически необходимых для клеток. Чтобы избежать визуализации ячеек, выражая большое количество GECIs следует минимизировать количество ГЕЧИ выражения. 
  В заключение рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции является одним из наиболее важных шагов для декодирования внутриклеточных Ca2 + сигналы, которые определяют биологические явления вывода. Этот протокол обеспечивает новый метод для рассечения Ca2 + сигналов для описания многообразия среди этих сигналов. В настоящее время этот метод ограничен для экспериментов в пробирке. Однако уже Lck-GCaMP6f используется для в-vivo Ca2 + изображений в мышей17, и ООР-GCaMP6f было подтверждено следить Ca2 + сигналов in vivo в VD двигательных нейронов в C. elegans7. Таким образом ориентация GECIs в отсеке субцеллюлярные имеет потенциал, чтобы расширить в естественных условиях изображений в будущем, таким образом благоприятные Ca2 + рассечение в естественных условиях.

CA2 + сигналы представляют собой повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + . CA2 + является универсальной второй messenger для эукариотических клеток. С помощью Ca2 +, клетки функционировать через различных внутриклеточных сигнальных путей и побудить различных биологических материалов. Например в нейронах, релиз синаптических пузырьков на пресинаптическом терминале, экспрессии генов в ядро и индукции синаптической пластичности в postsynapse регулируются собственный Ca2 + сигналы, которые точно активировать соответствующий вниз по течению ферментов в правильные сайты и с точного времени1.
Определенных пространственно-временных закономерностей Ca2 + сигналов активировать специфических ферментов вниз по течению. CA2 + сигналы, генерируемые координацию между двумя различными Ca2 + источники: Ca2 + приток из внеклеточного пространства и Ca2 + освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER), который служит в качестве внутриклеточного Ca2 + магазин. Значимые пространственно-временных Ca2 + сигнализации шаблон вызвать функцию определенную ячейку также поддерживается nanodomains 10 – 100 мкм Ca2 + созданных вблизи Ca2 + каналов на плазматической мембраны или ER мембраны2. Важно отметить, что источником Ca2 + сигналов является одним из наиболее важных факторов, определяющих течению биологической вывода. В нейронах Ca2 + приток и Ca2 + выпуска имеют противоположный эффект на кластеризации гамма - аминомасляная кислота (ГАМК)A рецепторов (ГАМКAR) на ГАМК синапсы, который отвечает за торможение 3возбудимости нейронов. CA2 + приток сопровождается массовым возбуждения нейронов индуцирует дисперсии синаптических ГАМКAR кластеров, тогда как постоянные Ca2 + освобождение от ER способствует кластеризации синаптических ГАМКARs. Другие группы также сообщил, что тюнинг направление конусы роста зависит от источника Ca2 + сигнала: Ca2 + приток вызывает отвращение, в то время как Ca2 + выпуск руководства притяжения нейрональных роста 4конус. Таким образом чтобы полностью понять Ca2 + сигнальные пути, лежащих в основе определенных клеточных выходов, важно определить источник Ca2 + сигналов, описывая Ca2 + сигналы на субклеточном резолюции.
В этом протоколе мы описываем Ca2 + изображения метод, позволяющий сообщить Ca2 + сигналы на субклеточном резолюции, которая позволяет оценки Ca2 + источников сигнала (рис. 1). CA2 + microdomains только под плазматической мембраны успешно контролируются генетически закодированный Ca2 + индикаторов (GECIs) ориентированы на плазматической мембране через вложение плазматической мембраны локализация сигнала Lck в Src Киназа N-Термини GECIs5. Чтобы обнаружить Ca2 + шаблон сигнала вблизи ER с лучше пространственным и временным разрешением, мы недавно разработали ООР-GCaMP6f, в котором GCaMP6f6 целей ER внешней мембраны, используя белка трансмембранного ER. ООР-GCaMP6f чутко могут сообщать Ca2 + освобождение от ER лучше пространственно-временных разрешением, чем обычные неадресных GCaMP6f в клетки COS-77 и HEK293 клетки8, избегая распространения Ca2 + и GECIs . Мы также подтвердили, что спонтанное Ca2 + высота в культивированный гиппокампа астроциты, сообщает ООР-GCaMP6f показало различных пространственно-временных шаблон по сравнению с наблюдением ориентированные на плазматической мембране GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, указав, что Ca2 + изображений с ООР-GCaMP6f в сочетании с Lck-GCaMP6f способствует рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции для выявления их источников.
В настоящее время мы подробно протокол для Ca2 + сигнал вскрытия НеЬа клетки и нейрон экзоцитоз смешанных культур, покрытие на coverslips стекла. Ca2 + Тепловизионная техника с GECIs указано здесь, Lck-GCaMP6f, плазма мембраны ориентированных RCaMP210 (Lck-RCaMP2), и ООР-GCaMP6f (рис. 1), применимы ко всем ячейкам, в которые могут быть выражены эти GECIs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Ион кальция (Ca2 +) молекула универсальный внутриклеточным messenger диски несколько сигнальных путей, приводит к различных биологических материалов. Координация двух Ca2 + источников сигнала — «Ca2 + приток» из вне ячейки и «Ca2 + освобождение» от внутриклеточного Ca2 + хранить эндоплазменный ретикулум (ER) — считается лежат в основе различных пространственно временные закономерности Ca 2 + сигналы, которые вызывают несколько биологических функций в клетках. Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы описать новый Ca2 + изображения метод, который позволяет осуществлять мониторинг самого момента «Ca2 + приток» и «Ca2 + выпуск». ООР-GCaMP6f это генетически закодированный Ca2 + индикатор (ГЕЧИ) состоит из GCaMP6f, который предназначен для внешней мембраны ER. ООР-GCaMP6f может контролировать Ca2 + выпуска с более высоким временным разрешением чем обычных GCaMP6f. В сочетании с таргетингом на плазматической мембране GECIs, пространственно временной Ca2 + сигнал шаблон может быть описана в субцеллюлярные резолюции. Субцеллюлярные таргетингом Ca2 + индикаторы, описанные здесь в принципе, доступны для всех типов клеток, даже для в-vivo изображений Caenorhabditis elegans нейронов. В этом протоколе мы представляем Ca2 + изображения в ячейках от линий клеток, нейронов и глиальных клеток в диссоциированных первичных культур и описывают подготовку замороженных запас корковых нейронов крысы.

LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были выражены в клетки HeLa, и оба сигналы были записаны одновременно, используя изображение расщепление Оптика, 24 ч после трансфекции (Рисунок 3А и 1 видео). Изображения были приобретены в 10 Гц. гистамина (его, 1 мкм), который индуцирует Ca2 + освобождение от ER, был добавлен во время записи. По его заявлению увеличить интенсивность сигнала Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f, как показано в псевдоцветном отображение ΔF/F0, который представляет изменение от первоначального флуоресценции интенсивности (рис. 3B). Время курсы Ca2 + высота (ΔF/F0) сообщил Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были сопоставлены в том же регионе интереса (ROI) (рис. 3 c). ΔF/F0 значения были нормализованы к их максимальные значения для включения времени курс сравнение между двумя различными GECIs, которые имеют различные выражения уровня и распределения. Оба датчика сообщили Ca2 + высоте колебаний как. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f показал тот же курс время для Ca2 + высота в двух клетках среди типов пяти клеток изучены (рис. 3 c, ROI 1 и 3). Однако Ca2 + фасады, проявленная Lck-RCaMP2 оставалась на более высоком уровне, по сравнению с проявленной ООР-GCaMP6f (рис. 3 C, ROI, 2, 4 и 5). Результаты показывают, что Ca2 + высота затягивается вблизи плазматической мембраны, в то время как он завершается раньше вокруг ER, который является источником этого Ca2 + сигнала, вызванных его стимуляции.
Спонтанное Ca2 + сигналы от астроциты в нейрон экзоцитоз смешанной культуре от крыс гиппокампах (Рисунок 4A) и Кор (рис. 4B) были продемонстрированы Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f (рис. 4, 2 видео видео 3 , 4и 5 видео). Корковых культур были возрождены из замороженных запас, который был подготовлен, как описано в настоящем Протоколе. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f сигналов последовательно были записаны на 2 Гц от тех же ячейках. В районе, который показал Ca2 + высота каждой ГЕЧИ были отобраны три ROIs, и время курс ΔF/Fбазы (т.е., интенсивность флуоресценции) изменен с интенсивность средняя флуоресценции в период всей записи (Fбаза ). Когда базовые флуоресценции является стабильным и Ca2 + высотах менее часты, Fбазовый становится полезным базовых обнаружить Ca2 + высота события. Спонтанное Ca2 + фасады были видны только в рамках Астроцитарная процесса, а не в клетки тела. Этот результат согласуется с предыдущими докладами по Астроцитарная спонтанные Ca2 + сигналы других GECIs визуализация в пробирке13 и в естественных условиях14. В гиппокампе и корковые астроциты Ca2 + фасады, проявленная Lck-RCaMP2 (вверху) были более частыми, чем те показали ООР-GCaMP6f. Этот результат согласуется с нашей предыдущей демонстрации, что Ca2 + фасады в астроциты благодаря Lck-GCaMP6f обнаружены чаще, чем те из-за ООР-GCaMP6f7 и свидетельствует о том, что это понятие распространяется также на Одноместный клеточном уровне.
Спонтанное Ca2 + фасады по Lck-GCaMP6f в незрелых крыса гиппокампа нейронов (10 DIV) были замечены в 2 Гц (рис. 5А и 6 видео). Время курсы ΔF/F0 в пяти различных ROIs предполагают, что эти Ca2 + фасады локально ограничиваются субцеллюлярные доменов. Рисунок 5B (7 видео) показывает Ca2 + ответы в зрелых мыши гиппокампа нейронов (30 DIV) инфицированных векторы AAV ООР-GCaMP6f-выражение. Нейроны были стимулируется с 100 мкм ДХПГ, который является агонистом рецепторов глутамата Метаботропные, вызывая Ca2 + выпуска. Был обнаружен ДХПГ индуцированной Ca2 + выпуска ООР-GCaMP6f.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Рис 1: диаграмма, показывающая мембраны ориентированных GECIs. Принципиальная схема ориентированные на плазматической мембране GECIs (Lck-GCaMP6f и Lck-RCaMP2) и внешняя ER мембраны целевой GCaMP6f (ООР-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Рисунок 2: схема для подготовки гиппокампа и корковых клеток, плазмида transfection и инфекции AAV. Микроскопических изображений являются представительными, свежезаваренным покрытием DIV-6 корковых клеток (слева) и возродил клетки из замороженных запасов (справа). Шкалы бар = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Рисунок 3: пример одновременные снимки Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. (A) схематическое представление разделения сигнала изображения расщепление оптикой. Же поле зрения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f одновременно проецируется на камеру. В видео 1представитель записи, приобретенные на 10 Гц CMOS камера, и один кадр этой записи отображается в панели A (справа). (B) псевдо-цветных изображений ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Гистамин (его, 1 мкм) был добавлен на 0 с. (C) представитель нормированное время ΔF/F0 курс Lck-GCaMP2 (пурпурный) и ООР-GCaMP6f (зеленый). Данные были нормализованы максимальное значение ΔF/F0 для каждого участка. Серые линии показывают сроков его применения. Данные были проанализированы с программного обеспечения TI Workbench15. Шкалы бар = 50 мкм (микроскопических изображений).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Рисунок 4: Спонтанное Ca2 + высота в астроциты, мониторинг для выражения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f. (A) представитель гиппокампа и (B) корковых астроциты transfected с Lck-RCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Корковых клеток были возрождены из замороженных запасов культур. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f изображения последовательно были приобретены в той же ячейке, 2 Гц, с Эм-ПЗС-камеры. Участки на левой шоу время курсы ΔF/Fbase, измеряемая в ROIs указывается в микроскопических изображений. Данные были проанализированы с TI Workbench. В 2 видео, видео 3, видео 4и 5 видеопредоставляются фактические фильмы. В баре шкалы = 20 мкм (микроскопических изображений). Базовые дрейф предлагает изменения в глобальном Ca2 + уровне в ячейке.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Рисунок 5: Примеры Ca2 + изображений в нейронах с Lck-GCaMP6f и ООР-GCaMP6f. (A) представитель крыса гиппокампа нейронов, выражая Lck-GCaMP6f на 10 DIV (слева) и участки, указанием времени курсы ΔF/F0 измеряется в ROI (желтые круги) были указаны в изображении (справа). Номера в курсе времени соответствуют номерам ROI в изображении. Обратите внимание, что временная модель Ca2 + высота отличается между различными регионами интереса. Базовые дрейф предполагает увеличение уровня глобальной Ca2 + в этот нейрон. (B) пример зрелых мыши гиппокампа нейронов (DIV 30) инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (слева). Время курса участок ΔF/F0 измеряется показывает Ca2 + ответ до 100 мкм (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на сроки, проявленная на серой панели. Желтые круги показывают положение ROIs где время курс был получен. Изображения были приобретены 2 Гц с охлаждением ПЗС-камеры (группа A) или Эм-CCD камеры (группа B) и проанализированы с TI Workbench. Шкалы бар = 20 мкм (микроскопических изображений). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Видео 1: пример одновременного отображения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. Представитель запись приобрела на 10 Гц и представлен на рисунке 3. Шкалы бар = 50 мкм.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Видео 2: Спонтанное Ca2 + переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в гиппокампе экзоцитоз. Представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4A), записан в том же поле зрения как 3 видео. Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Видео 3: Спонтанное Ca2 + переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в гиппокампе экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4A), в том же поле зрения как 2 видео. Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Видео 4: Спонтанное Ca2 + переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в корковых экзоцитоз представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4B), записан в том же поле зрения как 5 видео. Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Видео 5: Спонтанное Ca2 + переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в корковых экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4B), в том же поле зрения как 4 видео. В баре шкалы = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Видео 6: Пример Ca2 + изображений в нейрон гиппокампа крысы (DIV 10) по Lck-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca2 + сигналы записаны в 2 Гц (рис 5A). Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Видео 7: Ca2 + релиз в мыши гиппокампа нейрон (DIV 30), выражая ООР-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca2 + сигналы записаны в мыши гиппокампа нейрон инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (Рисунок 5B). Нейрон была простимулирована с 100 мкм dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на 30 s вызывают Ca2 + освобождение от ER. Шкалы бар = 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Рассечение местных Ca2 + сигналов в культивируемых клеток мембрана ориентированных Ca2 + индикаторы

Здесь мы представляем собой протокол для Ca2 + изображений в нейронов и глиальных клеток, который позволяет рассечение Ca2 + сигналов на субклеточном резолюции. Этот процесс применяется для всех типов клеток, которые позволяют выражение генетически закодированный Ca2 + показателей.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Вскрытие сигналов кальция в субклеточном разрешении является одним из наиболее важных шагов для расшифровки внутриклеточных сигналов кальция, определяющих выход биологического явления. Этот протокол описывает новый метод визуализации кальция, который позволяет контролировать тот самый момент притока кальция и высвобождения кальция. Этот протокол применим ко всем типам клеток, что позволяет выражение генетически закодированных показателей кальция.Мы считаем, что наш метод может быть расширен до вскрытия сигналов кальция при субклеточном разрешении у живых животных в лабораторной культуре. Помочь продемонстрировать процедуру будет Мацуми Хиросе, техник из нашей лаборатории. Для начала этой процедуры поместите стеклянный покров диаметром 18 миллиметров в каждую колодец из 12 хорошо пластины.Используйте стерилизованную воду и приготовьте 12,5 миллилитров раствора 0,4% PEI для каждой используемой пластины из 12. Добавьте один миллилитр решения PEI к каждой хорошо, и убедитесь, что есть нет пузырьков под крышкой скользит. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию.На следующий день используйте аспиратор для удаления решения PEI. Добавьте один миллилитр стерилизованной воды к каждому хорошо и встряхните пластину так, чтобы раствор PEI между крышкой скольжения и пластины вымываются тщательно. Повторите этот процесс мытья два дополнительных раза со свежей стерилизованной водой.После окончательной стирки, аспирировать воду из каждого хорошо полностью. Внутри капота используйте ультрафиолетовый свет, чтобы высушить и стерилизовать крышку скользит, по крайней мере 15 минут. Блюдо с покрытием PEI может храниться при четырех градусах цельсия в течение двух месяцев.Когда готовы приступить, осветить посуду ультрафиолетовым светом в течение 15 минут, как раз перед использованием. Добавьте пять миллилитров стерильной дистиллированной воды в пространство между колодцами, чтобы предотвратить испарение среды культуры. Во-первых, мыть кортисы с инкубационный солевой раствор.Затем инкубировать кортис с трипсином и ДНК в инкубационный солевой раствор в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию. Затем, мыть кортисы три раза с ледяной инкубации солевой раствор. Удалите супернатант и добавьте два миллилитров покрытия среднего, дополненного 150 микролитров акций DNAse I.Отмежеваться от клеток, трубы двадцать раз или меньше, и фильтровать клетки через ситечко клетки с пор размером 70 микрометров. Затем вымойте клеточный ситечко 20 миллилитров среды покрытия. Для приготовления замороженного клеточного бульона промыть клетки 20 миллилитров среды для мытья.Разбавить корковые клетки с покрытием среды до плотности 140 000 жизнеспособных клеток на миллилитр. Затем добавьте один миллилитр разбавленной клеточной подвески в крышку с покрытием PEI в 12 пластин культуры хорошо. Поддерживайте клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе углекислого газа в течение двух-трех дней.Когда клетки стабильны, через два-три дня после покрытия, изменить культуру среды на обслуживание среды. Для подготовки замороженных запасов клеток, спина вниз клетки, используя ротор качели центрифугировать клетки на 187 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатант и добавить криоконсервации среды, хранится на четыре градуса по Цельсию, чтобы получить плотность клеток 10 миллионов клеток на миллилитр.Aliquot один миллилитр клеточной подвески в криогенные трубки. Поместите трубки в контейнер для замораживания клеток со скоростью замерзания минус один градус по Цельсию в минуту, пока температура не будет достигнута до минус 80 градусов по Цельсию. Перенесите замораживающий контейнер в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Чтобы оживить замороженные клетки, предварительно разогреть средство мытья и среды обслуживания для замороженных корковых клеток. Далее, оттепель замороженных клеток быстро в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Разбавить клетки мягко с предварительно разогретой среды мытья и центрифуги с качели ротора в 187 раз G в течение трех минут.Повторно приостанавливайте гранулы в один миллилитр среды мытья и измеряйте жизнеспособную плотность клеток. Затем разбавьте клетки средой обслуживания замороженных корковых клеток, чтобы дать плотность клеток 300 000 клеток на миллилитр. Сейд один миллилитр этой клеточной подвески в колодцы PEI покрытием 12 пластин скважины.Для трансфекции через три-восемь дней после покрытия, этикетка две трубки, одна для плазменной ДНК, а другой для реагента трансфекции. Добавьте 50 микролитров пониженной среды сыворотки на колодец, к каждой трубке. Добавьте 0,5 микрограмма плазменной ДНК на крышку скольжения и один микролитер дополнения сопровождается трансфекции реагент для нейронов, на хорошо плазменной трубки ДНК.Для совместной трансфекции Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f смешайте 0,5 микрограмма каждой плазмиды и один микролитер дополнения в 50 микролитров пониженной среды сыворотки на колодец. Затем добавьте один микролитер трансфектного реагента на колодец в трансфектную трубку реагентов. Vortex обе трубки в течение одной-двух секунд.Затем добавьте смесь трансфектного реагента в смесь ДНК. Аккуратно пипетку смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Загрузите эту смесь на клетки в капле мудрым образом.Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода в течение двух-трех дней, пока маркер белков выражаются. Смешайте L и O, чтобы сделать инфекцию AAC. Добавьте три микролитров AAC на колодец к смешанной культуре нейронов-астроцитов.Аккуратно качайте блюдо, чтобы смешать. Поддерживать культуру в течение одной-двух недель до тех пор, пока не будут выражены ГЭИ. Сначала смонтировать крышку скольжения, содержащие клетки трансфицированы с Lck-RCaMP2 и OER-CaMPG6f в камеру записи микроскопа.Добавьте 400 микролитров носителя изображения и поместите крышку поверх камеры. Выберите набор фильтров для GCaMP6f и источника света. Найдите астроциты, выражаюющие OER-GCaMP6f.Далее выберите набор фильтров и источник света для RCaMP2 и подтвердите, выражается ли Lck-RCaMP2 в тех же астроцитах. Запись промежуток времени изображения Lck-RCaMP2 на два Герц в течение двух минут и сохранить данные изображений. После этого измените набор фильтров обратно для GCaMP6f.Запись промежуток времени изображения OER-GCaMP6f на два Герц в течение двух минут и сохранить данные изображений. В этом исследовании, Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f выражаются в клетках HeLa и оба сигнала были записаны одновременно с помощью оптики расщепления изображения, через 24 часа после трансфекции. При добавлении гистамина интенсивность сигнала Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f увеличилась.Курсы времени высоты ионов кальция, о которые сообщают Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f, сравниваются в тех же областях, представляющих интерес. Оба датчика сообщают о колебаясь, как высота иона кальция. И оба показывают один и тот же курс времени в двух из пяти исследованных клеток.Тем не менее, высота иона кальция, показанная Lck-RCaMP2, остается на более высоком уровне, чем OER-GCaMP6f в других клетках. Эти результаты показывают, что высота ионов кальция продлевается в непосредственной близости от плазменной мембраны, в то время как она прекращается ранее вокруг ER, который является источником этого ионового сигнала кальция, индуцированного стимуляцией гистамина. Спонтанные ионные сигналы кальция от астроцитов в смешанной культуре нейрон-астроцитов от крысиных гиппокампов и кортиков показаны Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f.Спонтанные высоты ионов кальция видны только в астроцитическом процессе, а не в клеточном организме, что согласуется с предыдущими сообщениями. Спонтанные высоты ионов кальция Lck-GCaMP6f в незрелых нейронах крысиного гиппокампа видны в двух Герц. Курсы времени для пяти различных областей, представляющих интерес, свидетельствуют о том, что эти высоты локально ограничиваются субклеточных доменов.Зрелые мыши гиппокампа нейронов, инфицированных OER-GCaMP6f-выражение AAV векторы показывают реакции ионов кальция в ответ на добавление DHPG. Для визуализации кальция, возбуждение люминации власти является наиболее важным фактором. Пожалуйста, держите свет возбуждения как можно более низким, чтобы избежать фото-отбеливания и фототоксичности.Источник сигналов кальция может быть дополнительно подтвержден Pomakorzi с использованием конкретных ингибиторов кальциевых каналов. Декодирование сигналов кальция, чтобы вызвать определенный выход был фундаментальный биологический вопрос. Этот метод визуализации кальция прокладывает путь для описания разнообразия внутриклеточных сигналов кальция.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Патч-зажим измерения емкости и Са 2 + Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Изображений внутриклеточный Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в полосатом теле астроциты от мышей помощью взрослого генетически закодированные показатели кальция

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

В Ситу Ca 2+ изображений нервной системы кишечной

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Генерация местных СА1 γ колебаний тетанических стимуляции

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...