Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por las subvenciones siguientes: la ciencia de Japón y la Agencia de tecnología (JST) Precursory de investigaciones para la embrionaria ciencia y tecnología (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japón); la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) / becas de ayuda para la investigación científica (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Fundación Takeda. Los autores agradecen a Haruhiko Bito (Universidad de Tokio) para proporcionar RCaMP2 y Arthur J.Y. Huang y Thomas McHugh (RIKEN CBS) por sus vectores AAV y por instrucciones sobre preparación de AAV. Los autores quisieran agradecer a los editores en los diario de experimentos visualizados por su ayuda con video filmación y edición.

<ol>
	<li>Clapham, D. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Diversas salidas biológicos son iniciadas por las señales de Ca2 + . CA2 + es un versátil Mensajero de señalización intracelular. Decodificación de Ca2 + señales para evocar salidas específicas ha sido una pregunta biológica fundamental y Ca2 + técnicas de imagen para describir la diversidad de señales de Ca2 + se requiere. El protocolo actualmente detallado permite la detección de distintas señales de Ca2 + en la membrana plasmática y ER (figura 3 y figura 4) y Ca2 + microdominios local dentro de una célula (figura 4 y figura 5). Esto contribuye a describir la diversidad de señales de Ca2 + intracelulares. La resolución temporal de Ca2 + señales también fue mejorada por targeting GECIs en la membrana plasmática y ER porque puede evitar el efecto de una difusión tridimensional de la Ca2 + y GECIs ellos mismos, y tiene el potencial para detectar el momento de afluencia2 + Ca o Ca2 + lanzamiento, que se produce en la membrana.
El protocolo tiene algunas limitaciones. Los usuarios deben tener presente que las señales detectadas son la suma de "el momento de afluencia2 + Ca o liberación" y "Ca2 + difundido hacia fuera de la original fuente de Ca2 +" , especialmente para grandes señales de Ca2 + . Por ejemplo, aunque su estímulo en las células HeLa evoca Ca2 + la versión de la ER, su resultante Ca2 + señales son detectadas por orientada a ER rea-GCaMP6f, sino también por plasma membrana dirigidos Lck-RCaMP2 (figura 3). Otra limitación es que el patrón espacio-temporal de Ca2 + señales puede no ser el único determinante de la producción de señales de Ca2 + . La distribución de proteínas efectoras aguas abajo (tales como Ca2 +-dependiente de quinasas y fosfatasas) también se puede determinar un factor de2. Para descodificar completamente las señales de Ca2 + intracelulares, análisis del comportamiento de la enzima aguas abajo, que no está cubierto en este protocolo, es absolutamente necesario.
Uno de los aspectos más críticos para éxito Ca2 + proyección de imagen es la proyección de imagen adquisición imagen y configuración de las condiciones, así como por otros estudios de imágenes en vivo. Previamente demostramos que la Ca2 + respuestas en la célula son altamente dependientes de la duración e intensidad de la excitación y sobre las condiciones de adquisición de imagen, incluyendo la exposición tiempo y adquisición de frecuencia16. Potencia de iluminación de excitación es el factor más crítico, ya que puede causar toxicidad ligera y fotoblanqueo de GECIs. Las condiciones de grabación de tiempo de exposición, frecuencia, intensidad de luz de excitación y duración de grabación de grabación deben ser optimizadas según el propósito del experimento. Recomendamos reducir el tiempo de exposición y la intensidad de luz de excitación tanto como sea posible para evitar el fotoblanqueo y fototoxicidad a la celda. La frecuencia de la grabación y la duración de la grabación deben ser suficientes para cubrir los eventos de Ca2 + elevación de interés pero deben mantenerse tan bajas como sea posible para evitar también el fotoblanqueo y fototoxicidad. Se recomiendan determinar la frecuencia de la grabación y la duración primero y optimizar el tiempo de exposición y la intensidad de luz para que se minimice el fotoblanqueo de las GECIs. Otro factor importante es el nivel de expresión de las GECIs. GECIs tienen un Ca2 +-buffering efecto como Ca2 +-las proteínas. Por lo tanto, la sobreexpresión de GECIs resulta en el almacenamiento en búfer de Ca2 +, que es fisiológicamente necesario para las células. La cantidad de expresión GECI debe reducirse para evitar la proyección de imagen de las células que expresan altas cantidades de GECIs. 
  En conclusión, la disección de Ca2 + señales con una resolución subcelular es uno de los pasos más importantes para descifrar la Ca2 + señales intracelulares que determinan el fenómeno biológico de la salida. Este protocolo proporciona un nuevo método para la disección de Ca2 + señales para describir la diversidad entre estas señales. En la actualidad, esta técnica es limitada para los experimentos in vitro. Sin embargo, Lck-GCaMP6f ya está siendo utilizado en vivo Ca2 + imagen en ratones17y rea-GCaMP6f fue confirmado monitorear Ca2 + señales en vivo en las neuronas de motor VD en C. elegans7. Por lo tanto, dirigida a GECIs en el compartimento subcelular tiene el potencial de ampliarse en vivo la proyección de imagen en el futuro, así que Ca2 + disección en vivo.

CA2 + señales representan la elevación de la concentración de Ca2 + intracelular. CA2 + es el segundo mensajero universal de las células eucariotas. Con Ca2 +, las células funcionan a través de diversas vías de señalización intracelular e inducen varias salidas biológicos. Por ejemplo, en las neuronas, liberación de la vesícula sináptica a la terminal presináptica, la expresión génica en el núcleo y la inducción de la plasticidad sináptica en la dendrita son regulados por distintas Ca2 + señales que se activan precisamente la adecuada enzimas aguas abajo en los sitios de derecha y con sincronización precisa1.
Patrones espacio-temporales específicos de señales de Ca2 + activan las enzimas específicas de aguas abajo. CA2 + se generan mediante la coordinación entre dos distintas Ca2 + fuentes de señales: Ca2 + afluencia desde el espacio extracelular y Ca2 + liberación desde el retículo endoplásmico (ER), que sirve como un Ca intracelular2 + guardar. El significativa spatiotemporal Ca2 + señalización patrón para inducir una función específica de la célula también es apoyado por nanodomains de 10-100 μm Ca2 + generado en las proximidades de canales de Ca2 + en la membrana plasmática o membrana de ER2. Lo importante es la fuente de señales de Ca2 + es uno de los factores más críticos para determinar la salida biológica aguas abajo. En las neuronas, Ca2 + afluencia y comunicado de Ca2 + tienen efectos opuestos en el agrupamiento de los receptores ácido gamma - aminobutírico (GABA)A (GABAAR) en las sinapsis GABAérgicas, que es responsable de la inhibición de la excitabilidad neuronal3. CA2 + flujo acompañado de excitación neuronal masiva provoca la dispersión de grupos sinápticos de GABAAR, mientras que persistente Ca2 + lanzamiento de ER promueve la agrupación de synaptic GABAARs. Otros grupos también han informado de que la dirección de ajuste de conos de crecimiento es críticamente dependiente de la fuente de la señal de Ca2 + :2 + afluencia Ca induce la repulsión, mientras que el comunicado de Ca2 + guía la atracción del crecimiento neuronal cono4. Por lo tanto, para entender completamente el Ca2 + subyacente específicas celulares salidas de vías de señalización, es importante identificar la fuente de Ca2 + señales describiendo Ca2 + señales en la resolución subcelular.
En este protocolo, describimos un Ca2 + método de imagen para reportar señales de Ca2 + en la resolución subcelular, que permite la estimación de las Ca2 + fuentes de señal (figura 1). CA2 + microdominios justo debajo de la membrana plasmática son monitoreados con éxito por genéticamente codificados Ca2 + indicadores (GECIs) dirigidos a la membrana plasmática mediante el anclaje de la señal de localización de la membrana plasmática Lck dentro de Src quinasa en el termini N GECIs5. Para detectar el patrón de Ca2 + señal en las proximidades de ER en una mejor resolución espacial y temporal, recientemente desarrollamos OER-GCaMP6f, en que GCaMP6f6 metas ER externas de la membrana, utilizando la proteína transmembrana de ER. REA-GCaMP6f sensible puede reportar Ca2 + lanzamiento de ER en una mejor resolución espaciotemporal que GCaMP6f desea convencionales de células COS-77 y de las células HEK2938, evitando la difusión de Ca2 + y GECIs . También confirmamos que la espontánea Ca2 + elevación en los astrocitos de hipocampales cultivadas reportado por OER-GCaMP6f mostró un patrón espacio-temporal diferente comparado con el que por GCaMP6f dirigidos a membrana del plasma (Lck-GCaMP6f)7 ,9, indicando que el Ca2 + proyección de imagen con la rea-GCaMP6f en combinación con Lck-GCaMP6f contribuye a la disección de Ca2 + señales en la resolución subcelular para identificar sus fuentes.
En la actualidad, detallamos el protocolo para el análisis de Ca2 + señales en células HeLa y neurona-astrositos mezclado culturas sobre cubreobjetos de vidrio. La Ca2 + técnica de imagen con GECIs indicadas aquí, Lck-GCaMP6f, RCaMP2 plasma membrana dirigidos10 (Lck-RCaMP2), y rea-GCaMP6f (figura 1) son aplicables a todas las células en las que se pueden expresar estos GECIs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Ion calcio (Ca2 +) es una molécula de mensajero intracelular universal que impulsa múltiples vías de señalización, a diversos productos biológicos. La coordinación de dos fuentes de Ca2 + señal — «Ca2 + afluencia"de fuera de la célula y"Ca2 + lanzamiento"de la Ca2 + intracelular retículo endoplasmático (ER), se considera que subyacen a los diversos patrones espacio-temporales de Ca 2 + señales que provocan múltiples funciones biológicas en las células. El propósito de este protocolo es describir un nuevo Ca2 + método de imagen que permite la monitorización del momento de "Ca2 + afluencia" y "Ca2 + en libertad". REA-GCaMP6f es un genéticamente codificados Ca2 + indicador (GECI) compuesto por GCaMP6f, que está dirigido a la membrana externa de ER. REA-GCaMP6f puede controlar Ca2 + lanzamiento en una mayor resolución temporal que GCaMP6f convencionales. Combinado con GECIs orientada en la membrana plasmática, el espacio-temporal Ca2 + patrón de señal puede ser descrito en una resolución subcelular. El objetivo subcelular Ca2 + indicadores descritos aquí son, en principio, disponible para todos los tipos de células, incluso para el vivo en proyección de imagen de las neuronas de los elegans de Caenorhabditis . En este protocolo, introducimos el Ca2 + proyección de imagen en células de líneas de células, neuronas y glía en cultivos primarios disociados y describir la preparación de caldo congelado de neuronas corticales de rata.

RCaMP2 Lck y rea-GCaMP6f se expresaron en células HeLa, y ambas señales se registraron simultáneamente con separación de imagen óptica, 24 h después de transfección (Figura 3A y 1 vídeo). Las imágenes fueron adquiridas en 10 Hz. histamina (su, 1 μm), que induce Ca2 + liberación de ER, se añadió durante la grabación. La petición de su aumenta la intensidad de la señal de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f, como se muestra en la pantalla de pseudocolor de ΔF/F0, que representa el cambio de la intensidad de fluorescencia inicial (figura 3B). Se compararon los cursos tiempo de Ca2 + elevación (ΔF/F0) reportados por RCaMP2 Lck y rea-GCaMP6f en la misma región de interés (ROI) (figura 3). Los valores ΔF/F0 se normalizaron los valores de pico para permitir la comparación del curso de tiempo entre los dos GECIs diferentes, que tienen niveles de expresión diferente y distribuciones. Ambos sensores informaron una oscilación como Ca2 + elevación. RCaMP2 Lck y rea-GCaMP6f demostrada el mismo curso del tiempo de elevación de Ca2 + en dos células entre los tipos cinco celulares examinados (figura 3, ROI 1 y 3). Sin embargo, Ca2 + elevaciones de Lck-RCaMP2 mantuvieron en un nivel más alto en comparación con la de rea-GCaMP6f (figura 3 C, ROI 2, 4 y 5). Los resultados indican que la elevación del Ca2 + se prolonga en las proximidades de la membrana plasmática, mientras que se terminó antes alrededor de la sala de emergencia, que es la fuente de Ca2 + señal inducida por su estimulación.
Espontánea Ca2 + señales de astrocitos en la neurona-astrositos mezclado cultura de hipocampo de rata (Figura 4A) y cortexes (Figura 4B) fueron demostrados por Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f (figura 4, Video 2, Video 3 de , 4y 5 de vídeo). Las culturas corticales fueron revividas del material congelado que se preparó como se describe en este protocolo. Secuencialmente se registraron señales de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f a 2 Hz de las células del mismo. Tres ROIs fueron seleccionados en el área que mostró elevación del Ca2 + por cada GECI, y cambió el curso del tiempo de ΔF/Fbase (es decir, la intensidad de fluorescencia) de la intensidad de fluorescencia media durante el período de toda grabación (Fbase ). Cuando la fluorescencia basal es estable y Ca2 + elevaciones son menos frecuentes, Fbase se convierte en una referencia útil para detectar eventos de elevación de Ca2 + . Espontánea Ca2 + elevaciones eran visibles sólo en los procesos astrocytic, no en el cuerpo de la célula. Este resultado es consistente con los anteriores informes sobre astrocytic espontánea Ca2 + señales de otros GECIs visualizado in vitro13 y vivo en14. En los astrocitos de hipocampales y corticales, Ca2 + elevaciones de Lck-RCaMP2 (arriba) fueron más frecuentes que las que se muestran por OER-GCaMP6f. Este resultado es consistente con nuestra demostración anterior que elevaciones de Ca2 + en los astrocitos debido a Lck-GCaMP6f con más frecuencia se ha detectado que debido a la rea-GCaMP6f7 y sugiere que este concepto también es aplicable en el nivel unicelular.
Espontánea Ca2 + elevaciones de Lck-GCaMP6f en neuronas hipocampales de rata inmadura (DIV 10) fueron vistas en 2 Hz (figura 5A y 6 de vídeo). Los cursos de tiempo de ΔF/F0 en cinco diferentes ROIs sugieren que estas elevaciones de Ca2 + local se limitan a los dominios subcelulares. Figura 5B (Video 7) muestra las Ca2 + respuestas en neuronas hippocampal ratón maduro (30 DIV) infectadas con vectores AAV rea-GCaMP6f-expresión. Las neuronas fueron estimuladas con DHPG, que es el agonista de los receptores de glutamato metabotrópicos, induciendo comunicado de Ca2 + de 100 μm. Se detectó DHPG inducida por Ca2 + versión debido a OER-GCaMP6f.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figura 1: diagrama que muestra orientada a membrana GECIs. Diagrama esquemático de GECIs orientada en la membrana plasmática (Lck-GCaMP6f y RCaMP2 Lck) y ER externo membrana orientada GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figura 2: Diagrama de flujo para la preparación de células hipocampales y cortical, transfección del plásmido y la infección de AAV. Las imágenes microscópicas son representativos, recién plateado DIV-6 corticales células (izquierda) y revivieron las células del material congeladora (derecha). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figura 3: ejemplo de la proyección de imagen simultánea de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f en células HeLa. (A) representación esquemática de la separación de la señal con la división de imagen óptica. El mismo campo de visión de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f se proyecta simultáneamente en la cámara. Una grabación representación adquirida de 10 Hz por un CMOS de la cámara se proporciona en el Video 1, y un fotograma de esta grabación se muestra en el panel A (derecha). (B) imágenes pseudo-color de ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (arriba) y rea-GCaMP6f (parte inferior). Histamina (su, 1 μm) fue agregada en 0 s. representante de (C) curso normalizado tiempo ΔF/F0 de Lck-GCaMP2 (magenta) y rea-GCaMP6f (verde). Los datos fueron normalizados al valor máximo de ΔF/F0 para cada parcela. Las barras grises indican el momento de su aplicación. Datos se analizaron con un software por encargo de banco de trabajo de TI15. Barra de escala = 50 μm (imagen microscópica).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figura 4: Espontánea Ca2 + elevación en los astrocitos de seguimiento para la expresión de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f. (A) representante de hippocampal y (B) astrocitos corticales transfectados con Lck-RCaMP2 (arriba) y rea-GCaMP6f (parte inferior). Células corticales fueron revividas de culturas stock congeladas. RCaMP2 Lck y rea-GCaMP6f imágenes fueron adquiridos secuencialmente en la misma celda, a 2 Hz, con un EM-CCD de la cámara. Las parcelas en la demostración izquierda los cursos tiempo de ΔF/Fbase medidos en el ROIs se indican en la imagen microscópica. Datos se analizaron con Banco de trabajo de TI. Películas reales se encuentran en el Video 2, Video 3, Video 4y 5 de Video. La barra de escala = 20 μm (imagen microscópica). La deriva de referencia indica los cambios en el Ca2 + nivel global en la celda.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figura 5: Ejemplos de Ca2 + proyección de imagen en las neuronas con Lck-GCaMP6f y rea-GCaMP6f. (A) representante de la rata hipocampo las neuronas expresando Lck-GCaMP6f en DIV 10 (izquierda) y de la parcelas que muestra el tiempo cursos de ΔF/F0 mide en ROIs (círculos amarillos) se han indicado en la imagen (derecha). Los números en el curso del tiempo corresponden a los números ROI en la imagen. Tenga en cuenta que el patrón temporal de elevación del Ca2 + es diferente entre las distintas regiones de interés. La deriva de referencia sugiere el aumento de Ca2 + globalmente en esta neurona. (B) un ejemplo de neuronas hippocampal del ratón maduro (DIV 30) infectados con OER-GCaMP6f expresión vectores AAV (izquierdas). El tiempo de curso de ΔF/F0 mide muestra la Ca2 + respuesta a 100 μm (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado en el momento de la barra gris. Círculos amarillos muestran la posición de ROIs donde se obtuvo el curso del tiempo. Las imágenes adquiridas en 2 Hz con una cámara CCD refrescado (panel A) o una cámara EM-CCD (panel B) y analizaron con Banco de trabajo de TI. Barra de escala = 20 μm (imagen microscópica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: ejemplo de la proyección de imagen simultánea de Lck-RCaMP2 y rea-GCaMP6f en células HeLa. Grabación representativa adquirió en 10 Hz y presentado en la figura 3. Barra de escala = 50 μm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Transitorio2 + Ca espontánea observada en RCaMP2 Lck en astrositos hippocampal. Representante de grabación en 2 Hz (Figura 4A), registrado en el mismo campo de visión como Video 3. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Transitorio2 + Ca espontánea observada en rea-GCaMP6f en un hipocampo astrositos. Representante de grabación adquirida en 2 Hz (Figura 4A), en el mismo campo de visión como Video 2. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4:2 + transitoria espontánea Ca observada en Lck-RCaMP2 en una cortical astrositos representante grabación en 2 Hz (Figura 4B), registrado en el mismo campo de visión como de vídeo 5. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Transitorio2 + Ca espontánea observada en rea-GCaMP6f en una cortical astrositos. Representante de grabación adquirida en 2 Hz (Figura 4B), en el mismo campo de visión como Video 4. La barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Ejemplo de Ca2 + proyección de imagen en una neurona hippocampal de la rata (DIV 10) por Lck-GCaMP6f. Ejemplo de neuronal Ca2 + señales grabadas en 2 Hz (figura 5A). Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + lanzamiento en una neurona de hipocampo de ratón (DIV 30) expresar OER-GCaMP6f. Ejemplo de Ca2 + señales neuronales registrados en una neurona de hipocampo de ratón infectada con vectores de AAV de la expresión de OER-GCaMP6f (figura 5B). La neurona fue estimulada con 100 μm dihydroxyphenylglycine (DHPG) aplicado a 30 s para evocar el Ca2 + comunicado de la sala de emergencia. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">haga clic aquí para descargar este video.</a>

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Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Disección de Local Ca2 + señales en las células cultivadas por membrana dirigidos Ca2 + indicadores

Aquí presentamos un protocolo de Ca2 + proyección de imagen en neuronas y células gliales, que permite la disección de Ca2 + señales con resolución subcelular. Este proceso es aplicable a todo tipo de celular que permiten la expresión de indicadores de Ca2 + genéticamente codificados.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

La disección de señales de calcio a una resolución subcelular, es uno de los pasos más importantes para la decodificación de señales de calcio intracelulares que determinan el fenómeno biológico de salida. Este protocolo describe un nuevo método de diagnóstico por imágenes de calcio que permite el monitoreo del momento mismo de la afluencia de calcio y la liberación de calcio. Este protocolo es aplicable a todos los tipos celulares que permiten la expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente.Creemos que nuestro método tiene el potencial de ampliarse a la disección de señales de calcio a la resolución subcelular en animales vivos en el cultivo de laboratorio. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Matsumi Hirose, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, coloque el resbalón de la cubierta de vidrio de 18 milímetros de diámetro en cada pozo de una placa de 12 pozos.Utilice agua esterilizada y prepare 12,5 mililitros de una solución de 0,4%PEI para cada placa de 12 pozos que se utilice. Agregue un mililitro de la solución PEI a cada pozo, y asegúrese de que no haya burbujas debajo de los resbalones de la cubierta. Incubar durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.Al día siguiente, utilice un aspirador para eliminar la solución PEI. Añadir un mililitro de agua esterilizada a cada pozo y agitar la placa para que la solución PEI entre el resbalón de la cubierta y la placa se lave a fondo. Repita este proceso de lavado dos veces más con agua fresca esterilizada.Después del lavado final, aspirar el agua de cada pozo por completo. Dentro de la capucha, utilice una luz ultravioleta para secar y esterilizar los resbalones de la cubierta durante al menos 15 minutos. El plato recubierto de PEI se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos meses.Cuando esté listo para proceder, ilumine los platos con la luz ultravioleta durante 15 minutos, justo antes de su uso. Añadir cinco mililitros de agua destilada estéril en el espacio entre los pozos para evitar la evaporación del medio de cultivo. Primero, lavar los cortices con la incubación salina.Luego, incubar los cortices con Trypsin y DNAse en solución salina de incubación durante cinco minutos a 37 grados Centígrados. Luego, lave los cortices tres veces con la solución salina de incubación de hielo frío. Retire el sobrenadante y añada dos mililitros de medio de chapado complementados con 150 microlitros de DNAse I.Disociar las células pipeteando veinte veces o menos y filtrar las células a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 micrómetros. A continuación, lave el colador celular con 20 mililitros del medio de chapado. Para la preparación de material celular congelado, lave las células con 20 mililitros del medio de lavado.Diluir las células corticales con un medio de chapado a una densidad de 140 000 células viables por mililitro. A continuación, agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a los resbalones de cubierta recubiertos de PEI en las placas de cultivo de 12 pozos. Mantener las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres días.Cuando las células estén estables, de dos a tres días después del enchapado, cambie el medio de cultivo al medio de mantenimiento. Para la preparación de la célula congelada, gire por la célula, utilizando un rotor oscilante para centrifugar las células a 187 veces G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante y añadir el medio de criopreservación, mantenido en cuatro grados Celsius, para obtener una densidad celular de 10 millones de células por mililitro.Aliquot un mililitro de la suspensión celular en tubos criogénicos. Coloque los tubos en un recipiente de congelación celular con una velocidad de congelación de menos uno grados Celsius por minuto, hasta que se alcance una temperatura de menos 80 grados Centígrados. Transfiera el recipiente de congelación a un congelador a menos 80 grados Centígrados.Para revivir las células congeladas, precaliente el medio de lavado y el medio de mantenimiento para las células corticales congeladas. A continuación, descongelar las células congeladas rápidamente en un baño de agua a 37 grados centígrados. Diluir las células suavemente con medio de lavado precalegado y centrífuga con un rotor oscilante a 187 veces G durante tres minutos.Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de lavado y mida la densidad celular viable. Luego, diluir las células con el medio de mantenimiento para las células corticales congeladas, para producir una densidad celular de 300 000 células por mililitro. Cede un mililitro de esta suspensión celular en los pozos de las placas pei recubiertas de 12 pozos.Para la transfección de tres a ocho días después del chapado, etiquete dos tubos, uno para el ADN plasmático y el otro para el reactivo de transfección. Añadir 50 microlitros de medio sérico reducido por pozo, a cada tubo. Añadir 0,5 microgramos de ADN plasmático por hoja de cobertura y un microlitro de suplemento acompañado de reactivo de transfección para las neuronas, por pozo al tubo de ADN plasmático.Para la co-transfección de Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f, mezclar 0,5 microgramos de cada plásmido y un microlitro de suplemento en 50 microlitros de medio sérico reducido por pozo. A continuación, añada un microlitro de reactivo de transfección por pozo al tubo de reactivo de transfección. Vortex ambos tubos durante uno o dos segundos.A continuación, añada la mezcla de reactivos de transfección a la mezcla de ADN. Pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cargue esta mezcla en las células de una manera a gota.Incubar en una incubadora de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que se expresen las proteínas marcadoras. Mezclar L y O para hacer la infección AAC. Añadir tres microlitros de AAC por pozo a la cultura mixta de neurona-astrocito.Mece suavemente el plato para mezclar. Mantener el cultivo durante una o dos semanas hasta que se expresen los GECI. Primero monte el resbalón de cubierta que contiene las células transfectados con Lck-RCaMP2 y OER-CaMPG6f en la cámara de grabación del microscopio.Agregue 400 microlitros del medio de imagen y coloque una tapa en la parte superior de la cámara. Elija el conjunto de filtros para GCaMP6f y la fuente de luz. Localice los astrocitos que expresan OER-GCaMP6f.A continuación, elija un conjunto de filtros y una fuente de luz para RCaMP2 y confirme si Lck-RCaMP2 se expresa en los mismos astrocitos. Grabe imágenes de lapso de tiempo de Lck-RCaMP2 en dos Hertz durante dos minutos y guarde los datos de imagen. Después de esto, cambie el conjunto de filtros a ese para GCaMP6f.Grabe imágenes de lapso de tiempo de OER-GCaMP6f a dos Hertz durante dos minutos y guarde los datos de imagen. En este estudio, Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f se expresan en células HeLa y ambas señales se registraron simultáneamente utilizando la óptica de división de imágenes, 24 horas después de la transfección. Tras la adición de histamina, la intensidad de la señal de Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f aumentó.Los ciclos de tiempo de elevación de iones de calcio reportados por Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f se comparan en las mismas regiones de interés. Ambos sensores reportan una elevación de iones de calcio similar a una oscilación. Y ambos muestran el mismo curso de tiempo en dos de las cinco células examinadas.Sin embargo, las elevaciones de iones de calcio mostradas por Lck-RCaMP2 permanecen en el nivel más alto que OER-GCaMP6f en las otras células. Estos resultados indican que la elevación del iones de calcio se prolonga en las proximidades de la membrana plasmática, mientras que se termina antes alrededor de la sala de emergencias, que es la fuente de esta señal de iones de calcio inducida por la estimulación de histamina. Las señales de iones de calcio espontáneos de astrocitos en el cultivo mixto de neurona-astrocitos de hipocampos y cortices de rata se muestran por Lck-RCaMP2 y OER-GCaMP6f.Las elevaciones espontáneas de iones de calcio son visibles sólo en el proceso astrocítico, no en el cuerpo celular, lo que es consistente con los informes anteriores. Las elevaciones espontáneas de iones de calcio por Lck-GCaMP6f en neuronas hipocampales de rata inmaduras se observan en dos Hertz. Los cursos de tiempo para cinco regiones de interés diferentes sugieren que estas elevaciones se limitan localmente a los dominios subcelulares.Las neuronas de hipocampo de ratón maduros infectadas con vectores AAV de expresión OER-GCaMP6f muestran respuestas de iones de calcio en respuesta a la adición de DHPG. Para las imágenes de calcio, la potencia de luminación de excitación es el factor más crítico. Mantenga la luz de excitación lo más baja posible para evitar el foto-blanqueo y la foto-toxicidad.Pomakorzi puede confirmar aún más la fuente de las señales de calcio utilizando inhibidores específicos de los canales de calcio. La decodificación de señales de calcio para evocar una salida específica ha sido una cuestión biológica fundamental. Esta técnica de imágenes de calcio allana el camino para describir la diversidad de señales de calcio intracelulares.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

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La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

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Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en estriatal astrocitos de ratones adultos a través de indicadores de calcio codificados genéticamente-

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generación de oscilaciones γ CA1 locales por tetánica Estimulación

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...