Name: dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Detta arbete stöds av följande bidrag: det Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory forskning för embryonala vetenskap och teknik (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) / bidrag i stöd till vetenskaplig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Författarna tackar Haruhiko Bito (University of Tokyo) för att tillhandahålla RCaMP2 och Arthur J.Y. Huang och Thomas McHugh (RIKEN CBS) för att tillhandahålla AAV vektorer och anvisningar angående AAV förberedelse. Författarna vill även tacka redaktörer på Journal av visualiseras experimenten för hjälp med video Filmning och redigering.

Alla de experiment som beskrivs här godkändes av de RIKEN säkerhet och djurförsök kommittén, enligt de riktlinjer som utfärdats av det japanska ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik.
1. beredning av celler
<ol><li>Beredning av poly (ethyleneimine)-belagda coverslips Obs: Poly(ethyleneimine) (PEI) beläggning rekommenderas för glas apparatur, eftersom det tillåter nervceller och astrocyter att fästa tätt coverslips utan att hindra deras utveckling. Dock finns andra beläggning metoder (t.ex. poly-ornitin, poly L-Lysin, laminin beläggning) också, om det behövs för glasbotten rätter.<ol>
<li>Placera en 18 mm diameter täckglas i varje brunn 12-bra platta. Bered 0,04% PEI (12,5 mL/12-well platta) med steriliserat vatten.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL 0,04% PEI lösning till varje brunn. Se till att det finns inga bubblor under coverslips.</li>
		<li>Inkubera plattorna i en CO2 inkubator över natten vid 37 ° C.</li>
		<li>Nästa dag, tvätta den belagda coverslips 3 x med 1 mL steriliserat vatten. Ta bort PEI lösningen med en insugningsventil, tillsätt 1 mL steriliserat vatten till varje brunn och skaka 12-väl plattan så att PEI lösningen mellan täckglaset och plattan kan tvättas noggrant. Den återstående PEI är giftiga för celler, se till att vattnet efter den sista tvättningen är aspirerade helt.</li>
		<li>Torka och sterilisera coverslips inuti huven med ultraviolett (UV) ljus under minst 15 minuter. PEI-belagd skålen kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 månader. Belysa rätter med UV-ljus för 15 min strax före användning.</li>
		<li>Tillsätt 5 mL sterilt destillerat vatten i utrymmet mellan brunnarna att förhindra avdunstning av odlingssubstratet.</li>
	</ol></li>
	<li>Plätering cellinjer Obs: Detta protokoll ger bara ett exempel för transfection in i celler från däggdjur cellinjer, såsom HeLa cells och COS-7 celler. Användarna kan tillämpa andra transfection protokoll som är optimerade för sina experiment. I det här avsnittet beskriver vi protokollet HeLa cellen kultur, vilket gäller även för COS-7 celler.<ol>
<li>Dagen före transfection, odla cellerna i en 10 cm kultur maträtt tills de uppnå 70 – 90% sammanflödet.</li>
		<li>Prewarm odlingssubstratet (se Tabell för material) till 37 ° C.</li>
		<li>Tvätta cellerna 2 x med fosfatbuffrad saltlösning utan Ca2 + och Mg2 + (PBS [-]).</li>
		<li>Aspirera i PBS(-) och tillsätt 1 mL 0,5% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syra lösningen Inkubera cellerna vid 37 ° C för 90 s tills de uppnå en rund form.</li>
		<li>Lägga till 9 mL av förvärmd odlingssubstrat att stoppa trypsinization. Späd cellerna med odlingsmedium i förhållandet 1:6.</li>
		<li>Frö 1 mL PEI-belagd coverslips i 12-väl tallrikar utspädda celler.</li>
	</ol></li>
	<li>Beredning av Hippocampus neuron-astrocyten blandad kultur från råttor eller möss Obs: Avsnitt 1.3 och 1.4 först måste granskas och godkännas av en institutionell djur vård och använda kommittén och måste följa officiellt godkända förfaranden för skötsel och användning av försöksdjur. Flödesschemat i neuronala kultur protokollet visas i figur 2.<ol>
<li>Förbereda alla reagens under laminärt flöde huven. Plats Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) i två 100 mm kultur rätter (cirka 20 mL/maträtt) som är i en icebox.</li>
		<li>Förbereda 50 mL av dissektion medlet består av DMEM och 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) (se Tabell av material) och fördela medlet i tre 60 mm kultur rätter (cirka 7 mL/maträtt) och åtta 35 mm kultur rätter (cirka 2 mL/maträtt). Placera disken i en annan icebox.</li>
		<li>Förbereda 50 mL den inkubation koksaltlösning, består av Hanks balanserad saltlösning kompletteras med 20 mM HEPES (se Tabell för material), och placera 8 mL saltlösning i en 15 mL koniska rör på is.</li>
		<li>Förbereda plätering mediet med minsta viktigt medium (MEM) kompletteras med B-27, glutamin och penicillin-streptomycin (se Tabell för material). Upprätthålla detta medium vid rumstemperatur (20 – 28 ° C).</li>
		<li>Sterilisera kirurgiska instrument med 70% etanol.</li>
		<li>Placera en pappershandduk i en glasburk med lock och 1 mL isofluran. Låt den isofluran avdunsta för 1 min.</li>
		<li>Placera en gravid råtta eller mus i burken beredd enligt steg 1.3.6 och hålla djuret i burken tills det är djupt sövda (cirka 30 s till 1 min).</li>
		<li>Ta den sövda djuren ur burken och desinficera djuret och dissektion utrustning genom att spraya dem med 70% etanol. Skär den ventrala mittlinjen med standard dissekera sax och pincett och extrahera livmodern från gravid råtta eller mus.</li>
		<li>Extrahera E18 – 19 embryon från livmodern en sövda kvinnliga råtta eller mus, med delikat dissekera sax, och placera de extraherade embryona med en ring pincett i iskall DMEM i en 10 cm parabolantenn för kall anestesi.</li>
		<li>Halshugga embryot med fina dissektion sax och placera huvudet i iskall DMEM i en 10 cm skål.</li>
		<li>Extrahera hjärnan från varje embryo med 13 cm böjd Semken pincett och pincett med fina tips. Håll hjärnan i det iskalla dissektion mediet i en 60 mm maträtt.</li>
		<li>Avlägsna de hippocampi, med två pincett med fina tips, iskall dissektion medium i 35 mm rätter och bibehålla den isolerade vävnaden i de inkubation saltlösning placeras i en 15 mL koniska rör på is.</li>
		<li>Tvätta hippocampi med inkubation saltlösning och inkubera med trypsin (1,25 mg/mL) och DNAS jag (0,25 mg/mL) i den inkubation saltlösning under 5 minuter vid 37 ° C. Den rekommenderade inkubation är 2,7 mL den inkubation koksaltlösning, 150 µL 20 x lager trypsin och 150 µL 20 x lager DNAS (se Tabell för material).</li>
		<li>Tvätta hippocampi 3 x med iskall inkubation saltlösning.</li>
		<li>Aspirera på inkubation saltlösning och tillsätt 1 mL av plätering medium som innehåller DNAS jag (10 µL av stamlösning, se Tabell för material). Avbryta vävnaden av pipettering högst 20 x och mäta tätheten av viabla celler, använder en cell counter och Trypan blå assay.</li>
		<li>Späd Hippocampus celler till en densitet på 1,4 x 105 livskraftiga celler/mL för råtta och 2,5 x 105 livskraftiga celler/mL för möss. Frö 1 mL av de utspädda cellsuspensioner på den PEI-belagd coverslips i 12-väl kultur plattor.</li>
		<li>Upprätthålla cellerna vid 37 ° C i en CO2-inkubator för 2 – 3 dagar.</li>
		<li>Ta bort plätering medium. Låt inte cellerna torkar ut. Skonsamt och snabbt lägga till förvärmd underhåll mediet (se Tabell för material).</li>
	</ol></li>
	<li>Beredning av råtta kortikala neuron-astrocyten blandad kultur och frusna celler och återupplivandet av frysta kulturer Obs: En frysförvaring metod för kortikala celler var beskrivna previously11. Här finns ett modifierat protokoll där kortikala celler kan lagras vid-80 ° C under minst 3 månader. Flödesschemat för detta protokoll visas i figur 2.<ol>
<li>Förbereda DMEM, dissektion medium, inkubation saltlösning och plätering medium som anges i steg 1.3.1–1.3.4, Tabell för materialoch.</li>
		<li>Förbereda tvätt medlet utgjorde DMEM Värmeinaktiverade fetalt bovint serum och penicillin-streptomycin (se Tabell för material), om nödvändigt.</li>
		<li>Extrahera E18 – 19 embryon från livmodern en sövda kvinnliga råtta eller mus, med delikat dissektion sax, och använda ringen pincett för att placera varje extraherade embryo till iskall DMEM för kall anestesi.</li>
		<li>Ta bort hjärnan från embryon och hålla dem i iskall dissektion medium. Ta bort cortexes och behålla dem i den inkubation saltlösning placeras i en 15 mL koniska rör på is.</li>
		<li>Tvätta cortexes med inkubation saltlösning och inkubera i cortexes med trypsin (1,25 mg/mL) och DNAS jag (0,25 mg/mL) i inkubation saltlösning under 5 minuter vid 37 ° C. Den rekommenderade inkubation för 12 cortexes är 5,4 mL inkubation koksaltlösning, 300 µL 20 x lager trypsin och 300 µL 20 x lager DNAS jag.</li>
		<li>Tvätta cortexes 3 x med iskall inkubation saltlösning.</li>
		<li>Avlägsna supernatanten och tillsätt 2 mL av plätering medium kompletteras med 150 µL av DNAS lager. Separera celler genom att mindre än 20 slag med och filtrera de celler som använder en cell sil med en porstorlek på 70 µm.</li>
		<li>Tvätta cell Silen med 20 mL av plätering medium för plätering. För beredning av frysta cell lager, tvätta cellerna med 20 mL av tvätta medium (se Tabell för material)</li>
		<li>Mäta densiteten av livskraftiga celler, med hjälp av en cell-räknare och metoden Trypan blå.</li>
		<li>Späd kortikala celler till en densitet på 1,4 x 105 livskraftiga celler/mL med plätering medium och tillsätt 1 mL av den utspädda cellsuspensionen till PEI-belagd coverslips i 12-väl kultur tallrikar.</li>
		<li>Upprätthålla cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator för 2 – 3 dagar och ändra odlingssubstratet till underhåll medium.</li>
		<li>Efter steg 1.4.9, förbereda fryst kortikal cell beståndet genom centrifugering cellerna vid 187 x g i 3 min, med en swing rotor.</li>
		<li>Aspirera supernatanten och lägga till frysförvaring mediet (se Tabell för material) förvaras vid 4 ° C, för att erhålla en cell densiteten 1 x 107 celler/ml. Alikvotens 1 mL cellsuspension in Kryogen rören.</li>
		<li>Placera rören i en cell som fryser behållaren med en frysning-1 ° C/min, tills en temperatur på 80 ° C uppnås och överföra behållaren frysning till-80 ° C frys. Cellerna kan lagras i minst 3 månader vid-80 ° C.</li>
		<li>För att återuppliva frusna celler, prewarm tvätta medellång (cirka 13 mL för varje Kryogen tube) och underhåll medium för frusna kortikala celler (se Tabell för material).</li>
		<li>Tina de frysta cellerna snabbt vid 37 ° C i ett vattenbad.</li>
		<li>Späd de upptinade cellerna försiktigt med förvärmd tvätta medium. Centrifugera cellerna vid 187 x g i 3 min, med en swing rotor.</li>
		<li>Centrifugerade i 1 mL av tvätta medium och mäta livskraftig cell densiteten.</li>
		<li>Späd cellerna med underhåll medium för frysta kortikala celler för att ge en cell densiteten av 3.0 x 105 livskraftiga celler/mL och utsäde 1 mL cellsuspension i PEI-belagd 12-väl tallrikar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. redovisning av membran-riktade GECIs
<ol><li>
Transfection celler
	<ol>
<li>Lägga till 250 ng av GECI plasmiden (dvs Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 eller OER-GCaMP6f med CMV arrangören)7,8,9 till 100 µL av minskade serum medium (se Tabell för material) per brunn. För cotransfection Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f, Använd 250 ng av varje plasmid i 100 µL av minskade serum medium i varje brunn.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 µL transfection reagens (se Tabell för material) per brunn i plasmid-reducerad serum medellång blandningen. För cotransfection Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f, tillsätt 0,5 µL transfection reagens per brunn.</li>
		<li>Inkubera blandningen i 30 min i rumstemperatur (20 – 28 ° C).</li>
		<li>Tillsätt 100 µL av blandningen till varje täckglas på och sätt.</li>
		<li>Inkubera cellerna för 48 – 72 timmar i en CO2 inkubator vid 37 ° C så att uttrycket för GECIs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection och adeno-associerade virusinfektion av Hippocampus eller kortikala nervceller Obs: Transfection 3 – 5 dagar in vitro-(DIV) resulterar i en högre transfection för nervceller. Transfection på 6 – 8 DIV föredras av optimal uttryck för GECIs i astrocyterna. Av uttryck för GECIs i dissocierade kultur nervceller efter 9 DIV ger infektionen adeno-associerade virus (AAV) vektorer ett bättre uttryck-effekt. AAV vektorer av uttryck för Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f enligt den EF1a som initiativtagare var beredda som tidigare beskrivits, med hjälp av HEK293 celler12 (se Tabell för material).<ol>
<li>För transfection 3 – 8 dagar efter plätering, etikett två rör, en för plasmid DNA och den andra för transfection reagens.</li>
		<li>Tillsätt 50 µL av minskade serum medium (se Tabell för material) per brunn till varje rör.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 µg av plasmid DNA per täckglas och 1 µL tillägg åtföljs av transfection reagens för nervceller (se Tabell för material) per brunn till plasmid DNA röret. För cotransfection Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f blandas 0,5 µg av varje plasmid och 1 µL av tillägg i 50 µL av minskade serum medium per brunn.</li>
		<li>Tillsätt 1 µL transfection reagens (se Tabell för material) per brunn i transfection reagensröret. Samma mängd transfection reagens används för cotransfection.</li>
		<li>Vortex båda rör för 1 – 2 s.</li>
		<li>Tillsätt transfection reagens blandningen (från steg 2.2.4) till DNA blandningen (från steg 2.2.3). Blanda genom pipettering försiktigt och inkubera blandningen (100 µL per täckglas) under 5 minuter i rumstemperatur.</li>
		<li>Ladda denna blandningen på cellerna i ett och sätt.</li>
		<li>Inkubera cellerna i en CO2 inkubator i 2 – 3 dagar tills markör proteinerna uttrycks.</li>
		<li>För AAV infektion, tillsätt 3 µL AAV per brunn i blandade neuron-astrocyten kulturen. Blanda försiktigt genom att gunga skålen. För dubbel infektionen Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f införs 3 µL av varje AAV per brunn. Om antalet celler som uttrycker GECIs är otillräckliga, bör optimal AAV för infektion fastställas.</li>
		<li>Underhålla kulturen för 1 – 2 veckor tills GECIs uttrycks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ca2 + Imaging
<ol><li>
Samtidig avbildning av celler som uttrycker Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f Obs: Att samtidigt spela in Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f signaler, bild-delning optik krävs. Optiken möjliggör separation av RCaMP2 och GCaMP6f och deras projektion på samma fotografiska ram av kameran (figur 3A). Samtidiga imaging också kräver (1) ljuskällor som samtidigt kan avge excitation ljus i blå (450 – 490 nm) och grön (500 – 560 nm) spektra, (2) dubbel-band filter och dichroic spegel sätter i mikroskopet, och (3) utsläpp filter för RCaMP2 och GCaMP6f. För detaljer, se Tabell för material.<ol>
<li>Slå på imaging-enheter och datorer minst 30 min innan inspelningen. Prewarm mikroskopet värme kammaren till 37 ° C. Ställa in bild-delning enheten, filter och ljuskälla. Justera bild-delning optiken så att samma synfält visas på kameran. Välj det lämpliga objektivet (se Tabell för material).</li>
		<li>Montera den täckglas som innehåller celler transfekterade med Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f i inspelning kammaren, lägga till lämpligt imaging medium eller buffert (400 µL för 18 mm coverslips) i kammaren, och placera den på Mikroskop scenen. Placera ett lock på inspelning kammaren för att undvika avdunstning av mediet.</li>
		<li>Leta upp de celler som uttrycker både Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f av fluorescerande imaging. Minimera excitation ljusintensiteten för att förhindra fotoblekning och fototoxicitet.</li>
		<li>Ta bort locket och starta en time-lapse inspelning vid 10 Hz. Under denna inspelning, lägga till agonist till kammaren att framkalla Ca2 + svaren (exempelvis histamin för HeLa cells, ATP för COS-7 celler).</li>
		<li>Spara time-lapse data i den hårddisk driva (HDD).</li>
		<li>Analysera data med hjälp av bild analys programvara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spela in spontana aktiviteter av astrocyter uttrycker Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f Obs: Utan bild-delning optik, kan Ca2 + signalerna på plasmamembranet och dem omkring ER övervakas i samma cell. Här beskrivs den sekventiella inspelningen av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f i samma astrocyterna. Ett Oljeimmer mål med en numerisk bländare större än 1,3 rekommenderas för spontan Ca2 + aktivitet.<ol>
<li>Slå på mikroskopet, kamera, ljuskälla och Mikroskop uppvärmning avdelningen minst 30 min innan inspelning.</li>
		<li>Montera den täckglas som innehåller celler transfekterade med Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f i inspelning kammaren och tillsätt 400 µL av imaging medium. Placera ett lock ovanpå kammaren.</li>
		<li>Välj filter för GCaMP6f och ljuskällan (blått excitation ljus, e.g. 470– 490 nm; se Tabell för material). Leta upp astrocyterna uttrycker OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Välj ett filter set och ljuskällan för RCaMP2 (grönt excitation ljus, t.ex. 510 – 560 nm, se Tabell av material) och bekräfta huruvida Lck-RCaMP2 uttrycks i samma astrocyterna. Undvik lång exponering för att förhindra fotoblekning ljuskällan.</li>
		<li>Spela in time-lapse bilder av Lck-RCaMP2 vid 2 Hz för 2 min. spara imaging data på hårddisken.</li>
		<li>Byta ställa till det för GCaMP6f. Spela in time-lapse bilder av OER-GCaMP6f i samma synfält, vid 2 Hz för 2 min. spara data på hårddisken.</li>
		<li>Analysera data med hjälp av bild analys programvara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inspelning spontana neuronal aktivitet och inducerad Ca2 + höjd i nervceller Obs: Den Mikroskop setup för neuronal imaging är densamma som beskrivs i avsnitt 3.2. Här beskrivs avbildning av spontana Ca2 + höjd på grund av Lck-GCaMP6f och Ca2 + höjd inducerad av mGluR aktivering på grund av OER-GCaMP6f.<ol>
<li>För att spela in spontana neuronal aktivitet, montera den täckglas som innehåller de celler som uttrycker Lck-GCaMP6f i inspelning kammaren och tillsätt 400 µL imaging medium. Placera ett lock ovanpå kammaren.</li>
		<li>Ställ in filtret och ljuskällan (blå magnetisering, e.g. 470 – 790 nm, se Tabell för material) som för GCaMP6f. Hitta de nervceller att uttrycka Lck-GCaMP6f och visar spontan aktivitet.</li>
		<li>Skaffa bilder på 2 Hz eller snabbare. Spara data på hårddisken.</li>
		<li>Analysera data med hjälp av bild analys programvara.</li>
		<li>För att registrera inducerad Ca2 + höjd, montera den coverslips innehållande de celler som uttrycker OER-GCaMP6f med 400 µL imaging medium. Placera ett lock ovanpå kammaren.</li>
		<li>Med filtret för GCaMP6f hitta de nervceller som uttrycker OER-GCaMP6f.</li>
		<li>Ta bort locket. Starta den time-lapse inspelning 2 Hz eller snabbare. Under inspelningen, lägga till agonister för en Gq-protein-kopplade receptor (t.ex. mGluR5 agonist [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) att frammana en Ca2 + release från ER.</li>
		<li>Spara time-lapse bilderna på hårddisken och analysera data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca(2+)+Sensing:+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling.">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium.">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li><li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering.">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+local+Ca(2+)+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca(2+)+indicator.">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li><li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux.">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li><li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+Ca2++signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2++channels.">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li><li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+high-affinity,+fast,+red+calcium+indicator+R-CaMP2.">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li><li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures.">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li><li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability.">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li><li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation.">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27 (2012).</li><li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+subtle,+transient,+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca(2+)+indicator.">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li><li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TI+Workbench,+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging.">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li><li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator.">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Olika biologiska utgångar initieras av Ca2 + signaler. Ca2 + är en mångsidig Intracellulär signalering budbärare. Avkodning Ca2 + signaler att framkalla specifika utgångar har varit en grundläggande biologisk fråga, och Ca2 + avbildningstekniker att beskriva mångfalden av Ca2 + signaler krävs. För närvarande detaljerad protokollet möjliggör upptäckt av distinkta Ca2 + signaler vid plasmamembranet och ER (figur 3 och figur 4) och lokala Ca2 + microdomains inuti en cell (figur 4 och figur 5). Detta bidrar till att beskriva mångfalden av intracellulära Ca2 + signaler. Den temporal upplösningen av Ca2 + signaler förbättrades också genom att rikta GECIs i plasmamembranet och ER eftersom det undviker effekten av ett tredimensionellt diffusion av Ca2 + och GECIs själva, och har potential att upptäcka den ögonblick av Ca2 + tillströmning eller Ca2 + release, vilket sker på membranet.
Protokollet har vissa begränsningar. Användare bör ha i åtanke att de upptäckta signalerna är summan av ”ögonblicket av Ca2 + tillströmning eller release” och ”Ca2 + sprids ut från den ursprungliga Ca2 + källan”, särskilt för stora Ca2 + signaler. Till exempel, även om hans stimulering i HeLa cells frammanar Ca släppa2 + från ER, dess resulterande Ca2 + signaler upptäcks inte bara av ER riktade OER-GCaMP6f utan också av plasma-membran-targeted Lck-RCaMP2 (figur 3). En annan begränsning är att spatiotemporal mönstret av Ca2 + signaler inte kan vara den enda faktorn av produktionen av Ca2 + signaler. Fördelningen av nedströms effektor proteiner (som Ca2 +-beroende kinaser och fosfataser) kan också vara en avgörande faktorn2. Avkoda helt de intracellulära Ca2 + signalerna genom är analys av nedströms enzym beteende, som inte omfattas av detta protokoll, absolut nödvändigt.
En av de mest kritiska aspekterna för framgångsrika Ca2 + imaging är tänkbar setup och bild förvärv förhållanden, såväl när det gäller andra live-imaging studier. Vi har tidigare visade att Ca2 + svaren i cellen är starkt beroende på varaktighet och intensitet av excitation och på bild förvärv villkor, inklusive exponering tid och förvärvet frekvens16. Magnetiseringen belysning makt är den mest kritiska faktorn, eftersom det kan orsaka lätta toxicitet och fotoblekning av GECIs. Inspelningsförhållandena för exponeringstid, inspelning frekvens, excitation ljus intensitet och varaktighet för inspelning bör optimeras enligt syftet med experimentet. Vi rekommenderar att minska exponeringstiden och excitation ljusintensiteten som möjligt att undvika fotoblekning och fototoxicitet till cellen. Inspelning frekvensen och varaktigheten av inspelning bör vara tillräckliga för att täcka de Ca2 + höjd händelserna av intresse men bör hållas så låg som möjligt för att undvika fotoblekning och fototoxicitet också. Vi rekommenderar att fastställa inspelning frekvensen och varaktigheten först och optimerar ljusintensiteten och exponeringstiden så att fotoblekning av GECIs minimeras. En annan viktig faktor är den uttryck i GECIs. GECIs har en Ca2 +-buffring effekten som de är Ca2 +-bindande proteiner. Därför resulterar i överuttryck av GECIs i buffringen av Ca2 +, vilket är fysiologiskt nödvändigt för cellerna. Mängden GECI uttryck bör minimeras för att undvika imaging celler som uttrycker stora mängder GECIs. 
  Sammanfattningsvis, är dissektion av Ca2 + signaler på en subcellulär resolution en av de viktigaste stegen för avkodning intracellulära Ca2 + signaler som avgör produktionen biologiska fenomen. Detta protokoll ger en ny metod för dissektion av Ca2 + signaler att beskriva mångfalden bland dessa signaler. För närvarande, är denna teknik begränsad för in vitro-försök. Dock Lck-GCaMP6f används redan för Invivo Ca2 + imaging i möss17och OER-GCaMP6f bekräftades för att övervaka Ca2 + signaler in vivo i de VD motoriska nervcellerna i C. elegans7. Inriktning GECIs i subcellulär facket har därför potential att utökas till i vivo imaging i framtiden, således möjliggör Ca2 + dissektion Invivo.

Ca2 + signaler representerar höjden av intracellulära Ca2 + koncentrationen. Ca2 + är universal andra messenger för eukaryota celler. Använda Ca2 +, celler fungera via olika intracellulära signalvägar och framkalla olika biologiska effekter. Till exempel i nervceller, synaptiskt vesikelprotein release i presynaptiska terminalen genuttryck i nucleus och induktion av synaptisk plasticitet vid postsynapse regleras av distinkta Ca2 + signaler som just aktiverar lämpliga nedströms enzymer på rätt platser och med exakt timing1.
Särskilda spatiotemporal mönster av Ca2 + signaler aktivera de specifika enzymerna som nedströms. Ca2 + signaler genereras av samordningen mellan två olika Ca2 + källor: Ca2 + tillströmning från den extracellulära och Ca2 + release från endoplasmatiska retiklet (ER), som fungerar som en intracellulära Ca2 + lagra. Meningsfull spatiotemporal Ca2 + signalering mönstret att framkalla en viss cellfunktion stöds också av nanodomains av 10-100 µM Ca2 + genereras i närheten av Ca2 + kanaler på plasmamembranet eller ER membran2. Viktigt, är källan till Ca2 + signaler en av de mest kritiska faktorer som avgör nedströms biologiska utdata. I nervceller har Ca2 + tillströmning och Ca2 + release motsatta effekter på klustring av gamma - aminosmörsyra (GABA)A receptorer (GABAAR) på GABAergic synapserna, som ansvarar för hämning av neuronal excitabilitet3. Ca2 + tillströmning åtföljs av massiva neuronala excitation inducerar spridningen av synaptic GABAAR-kluster, medan ihållande Ca2 + släppa från ER främjar den klustring av synaptic GABAARs. Andra grupper har också rapporterat att trim riktning mot tillväxt kottar är kritiskt beroende av källan till Ca2 + signalen: Ca2 + tillströmning inducerar repulsion, medan Ca2 + release guidar attraktion av neuronal tillväxt kon4. Därför, för att fullt ut förstå den Ca2 + signalering vägar underliggande specifika cellulära utgångar, det är viktigt att identifiera källan till Ca2 + signaler genom att beskriva Ca2 + signaler med subcellulär upplösning.
I detta protokoll beskriver vi en Ca2 + bildgivande metod för att rapportera Ca2 + signaler på subcellulär resolutionen, som tillåter skattning av de Ca2 + signalkällorna (figur 1). Ca2 + microdomains precis under plasmamembranet övervakas framgångsrikt av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) riktade till plasmamembranet via tillbehöret av plasmamembran-lokalisering signalen Lck inom Src Kinas till N-termini GECIs5. För att upptäcka mönster i närheten av ER en bättre rumsliga och temporal upplösning Ca2 + signal, utvecklade vi nyligen OER-GCaMP6f, i vilken GCaMP6f6 mål ER yttre membran, med ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan känsligt rapportera Ca2 + release från ER med bättre spatiotemporal upplösning än konventionella nontargeted GCaMP6f COS-7 celler7 och HEK293 celler8, genom att undvika diffusion av Ca2 + och GECIs . Vi bekräftade också att spontan Ca2 + höjden i odlade Hippocampus astrocyter som rapporterats av OER-GCaMP6f visade olika spatiotemporal mönster jämfört med som övervakas av plasmamembran-riktade GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, vilket indikerar att Ca2 + imaging med OER-GCaMP6f i kombination med Lck-GCaMP6f bidrar till dissektion av Ca2 + signaler med subcellulär upplösning att identifiera sina källor.
För närvarande detalj vi protokollet för dissekering i HeLa cells och neuron-astrocyten blandas kulturer pläterade på glas coverslips Ca2 + signal. Den Ca2 + bildteknik med GECIs anges här, Lck-GCaMP6f, plasma membran-riktade RCaMP210 (Lck-RCaMP2), och OER-GCaMP6f (figur 1) är tillämpliga på alla celler där dessa GECIs kan uttryckas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="692">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)</td>
			<td style="width:179px;">Tocris</td>
			<td style="width:97px;">#0342</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">0.5% DNase I stock solution</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#11284932001</td>
			<td>Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks&#39; Balanced Salt Solution&#160; supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 &#181;L aliquots and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">0.5% Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25300054</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM L-glutamine (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#25030081</td>
			<td style="width:211px;">Preparing small aliquots of 250--750 &#181;L and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">100 mM Sodium pyruvate (&#215;100 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11360070</td>
			<td style="width:211px;">Aliquots (10 mL) can be stored at -20&#176;C. After thawing, the solution can be maintained at 4&#176;C for 2 months.</td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:207px;">12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#353043</td>
			<td style="width:211px;">Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="74" style="height:75px;width:207px;">18-mm diameter circular coverslips</td>
			<td style="width:179px;">Karl Hecht &#34;Assistent&#34;</td>
			<td style="width:97px;">#41001118</td>
			<td style="width:211px;">Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15630080</td>
			<td style="width:211px;">pH 7.2 - 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="256">
			<td height="256" style="height:256px;width:207px;">2.5% Trypsin stock solution (&#215;20 stock)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#T4674</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 150 &#181;L aliquot and store at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="144">
			<td height="144" style="height:144px;width:207px;">50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P3143</td>
			<td style="width:211px;">Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (&#215;50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30&#176;C after preparing small aliquots of 250-750 &#181;L. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and&#160; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;">B-27 supplement (&#215;50 stock)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#17504044</td>
			<td style="width:211px;">This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:207px;">B57BL/6</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc.</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:207px;">Camera for microscopic image recording</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,&#160; ImagEM; Andor, iXon) or&#160; CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cell freezing container</td>
			<td style="width:179px;">Sarstedt K.K.</td>
			<td style="width:97px;">#95.64.253</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cell freezing container can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:179px;">Falcon</td>
			<td style="width:97px;">#352350</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:207px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Maintain at 37&#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Cryogenic tube</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:97px;">#430661</td>
			<td style="width:211px;">Alternative cryogenic tubes can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:207px;">Cryopreservation medium</td>
			<td style="width:179px;">Zenoaq</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">&#34;CELLBANKER1&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:207px;">Culture medium (for HeLa cells)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:95px;width:207px;">Dissection medium&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Alternative DMEM can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM</td>
			<td style="width:179px;">Nacalai</td>
			<td style="width:97px;">#08456-65</td>
			<td style="width:211px;">Low glucose</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">DNA transfection reagent</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#6366244001</td>
			<td style="width:211px;">&#34;X-tremegene HP DNA transfection reagent&#34; 
			Alternative transfection reagents can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:207px;">Glass jar with a lid</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:207px;">HBSS</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#14170161</td>
			<td style="width:211px;">HBSS free of calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Heat inactivated bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#10100147</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:207px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:179px;">RIKEN BioResource Center</td>
			<td style="width:97px;">#RCB0007</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Histamine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:97px;">#H7125</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:207px;">Image splitting optics</td>
			<td style="width:179px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:97px;">#A12801-01</td>
			<td style="width:211px;">W-view GEMINI</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Image splitting optics dichroic mirror</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF560-FDi01-25&#215;36</td>
			<td style="width:211px;">For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein&#160; (GFP/RFP) signal</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:207px;">Image splitting optics emission filters</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td>
			<td style="width:211px;">For emission of GFP/RFP signal, respectively</td>
		</tr>
		<tr height="164">
			<td height="164" style="height:164px;width:207px;">Imaging medium and buffer</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Incubation saline&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as IX73 (Olympus) or&#160; Eclipse TI (Nikon Instech)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:179px;">Pfizer</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="130">
			<td height="130" style="height:131px;width:207px;">Maintenance medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 &#181;L of L-glutamine stock and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:207px;">Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 &#215; 12 well dishes)&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 &#181;L B-27, 125 &#181;L of L-glutamine stock and 6.2 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">MEM (Minimum Essential Medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#11090-081</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:207px;">Microscope filter set for GCaMP6f imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for GFP (excitation, 480 &#177; 10 nm; emission, 530 &#177; 20 nm)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:207px;">Microscope filter set for RCaMP2 imaging</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Appropriate filter for RFP (excitation, 535 &#177; 50 nm; emission, 590 nm long pass)</td>
		</tr>
		<tr height="216">
			<td height="216" style="height:216px;width:207px;">Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f</td>
			<td style="width:179px;">Semrock</td>
			<td style="width:97px;">#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&#215;36, #FF01-512/630-25</td>
			<td style="width:211px;">Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope heating system</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">A heating system to maintain cells at 37&#176;C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.</td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:207px;">Microscope light source for excitation</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:207px;">Microscope objective lens</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Neurobasal plus medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#A3582901</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="174">
			<td height="174" style="height:175px;width:207px;">Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#10888022</td>
			<td style="width:211px;">Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:159px;width:207px;">PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td>
			<td style="width:97px;">#164-23551</td>
			<td style="width:211px;">The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:207px;">PC and image acquisition software</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15140122</td>
			<td style="width:211px;">Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 &#181;g/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:207px;">Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="280">
			<td height="280" style="height:280px;width:207px;">Plating medium (for 4 &#215; 12 well dishes)</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 &#181;L L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 &#181;L of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 &#181;L Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 &#181;g/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of&#160; the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">Recording chamber</td>
			<td style="width:179px;">Elveflow</td>
			<td style="width:97px;">Ludin Chamber</td>
			<td style="width:211px;">This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Reduced serum media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td style="width:97px;">#11058021</td>
			<td style="width:211px;">Opti-MEM</td>
		</tr>
		<tr height="272">
			<td height="272" style="height:272px;width:207px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.</td>
		</tr>
		<tr height="220">
			<td height="220" style="height:220px;width:207px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,&#160; 3 forceps with fine tips&#160; (Dumont Inox #5)</td>
		</tr>
		<tr height="197">
			<td height="197" style="height:197px;width:207px;">Transfection reagent for neuron</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#L3000008</td>
			<td style="width:211px;">&#34;Lipofectamine 3000&#34; reagent. 
			It is composed of the the &#34;supplement (P3000)&#34; that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the &#34;transfection reagent (lipofectamine 3000)&#34; used in the step 2.2.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypan blue (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:97px;">#15250061</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:207px;">Wash medium for frozen cortical cells&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">25 mL DMEM, supplemented with 250 &#181;L heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 &#181;L Penicillin Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Wistar rats</td>
			<td style="width:179px;">Japan SLC, Inc</td>
			<td style="width:97px;"></td>
			<td style="width:211px;">Pregnant rats (E18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of local ca2+ signals in cultured cells by membrane-targeted ca2+ indicators

Kalciumjon (Ca2 +) är en universal intracellulära budbärare molekyl som driver flera signalvägar, leder till olika biologiska utgångar. Samordning av två Ca2 + signalkällor — ”Ca2 + tillströmningen” från utanför cellen och ”Ca2 + release” från den intracellulära Ca2 + lagra endoplasmatiska nätverket (ER) — anses ligga till grund för de olika plats och tid mönster av Ca 2 + signaler som orsakar flera biologiska funktioner i celler. Syftet med detta protokoll är att beskriva en ny Ca2 + bildgivande metod som möjliggör övervakning av ögonblicket av ”Ca2 + tillströmning” och ”Ca2 + release”. OER-GCaMP6f är en genetiskt kodade Ca2 + indikator (GECI) bestående av GCaMP6f, vilken är måltavlan till ER yttre membranet. OER-GCaMP6f kan övervaka Ca2 + release på en högre temporal upplösning än konventionella GCaMP6f. Kombinerat med plasmamembranet-riktade GECIs, kan plats och tid Ca2 + signal mönstret beskrivas med en subcellulär upplösning. Subcellulär-riktade Ca2 + indikatorerna som beskrivs här är, i princip, tillgänglig för alla celltyper, även för de i vivo imaging Caenorhabditis elegans nervceller. I detta protokoll, vi införa Ca2 + imaging i celler från cellinjer, neuron och gliaceller i dissocierade primära kulturer och beskriva utarbetandet av fryst lager av råtta kortikala nervceller.

LCK-RCaMP2 och OER-GCaMP6f uttrycktes i HeLa cells och båda signalerna spelades in samtidigt med hjälp av bild-delning optik, 24 h efter transfection (figur 3A och Video 1). Bilderna har förvärvats på 10 Hz. histamin (hans, 1 µM), som inducerar Ca2 + release från Akuten, lades under inspelningen. Vid tillämpningen av hans ökas signal intensiteten av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f, vilket framgår av falsk visningen av ΔF/F0, vilket motsvarar ändringen från inledande fluorescensintensiteten (figur 3B). Tidsförlopp Ca2 + höjd (ΔF/F0) rapporterats av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f jämfördes i samma region av intresse (ROI) (figur 3 c). ΔF/F0 värdena var normaliserade till deras toppvärden aktivera tid kursen jämförelsen mellan de två olika GECIs, som har olika nivåer och distributioner. Båda sensorerna rapporterade en svängning-liknande Ca2 + höjd. LCK-RCaMP2 och OER-GCaMP6f visade samma tid kursen för Ca2 + höjd i två celler bland de fem celltyper undersökte (figur 3 c, ROI 1 och 3). Ca2 + höjder visas av Lck-RCaMP2 förblev dock på en högre nivå jämfört med som visas av OER-GCaMP6f (figur 3 C, ROI 2, 4 och 5). Resultaten indikerar att Ca2 + höjden är förlängd i närheten av plasmamembranet, medan det avslutas tidigare runt ER, som är källan till denna Ca2 + signal som induceras av hans stimulering.
Spontan Ca2 + signaler från astrocyter i de neuron-astrocyten blandad kultur från råtta hippocampi (figur 4A) och cortexes (figur 4B) visades av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f (figur 4, Video 2, Video 3 , Video 4och Video 5). Kortikala kulturer var återupplivas från fryst lager som förbereddes som beskrivs i detta protokoll. LCK-RCaMP2 och OER-GCaMP6f signaler registrerades sekventiellt vid 2 Hz från samma celler. Tre ROIs valdes i området som visade Ca2 + höjd av varje GECI, och tidsförloppet för ΔF/Fbas (dvs fluorescensintensiteten) ändras från genomsnittliga fluorescensintensiteten under hela inspelningen (Fbas ). När baslinjen fluorescensen är stabil och Ca2 + höjder är mindre frekventa, blir Fbas en användbar baslinje att upptäcka Ca2 + höjd händelser. Spontan Ca2 + höjder syntes bara på astrocytic processen, inte på cellkroppen. Detta resultat överensstämmer med tidigare rapporter på astrocytic spontana Ca2 + signaler av andra GECIs visualiserade in vitro-13 och Invivo14. I både hippocampus- och kortikal astrocyter var Ca2 + höjder visas av Lck-RCaMP2 (överst) mer frekvent än de som visas av OER-GCaMP6f. Detta resultat är förenligt med vår tidigare demonstration att Ca2 + förhöjningar av astrocyter på grund av Lck-GCaMP6f upptäcktes oftare än de på grund av OER-GCaMP6f7 och föreslår att detta begrepp även är tillämplig på den enskild cell nivå.
Spontan Ca2 + förhöjningar av Lck-GCaMP6f i omogna råtta Hippocampus nervceller (10 DIV) sågs vid 2 Hz (figur 5A och Video 6). Tidsförlopp av ΔF/F0 i fem olika ROIs föreslår att dessa Ca2 + förhöjningar är lokalt begränsade till subcellulär domäner. Figur 5B (Video 7) visar Ca2 + svaren i mogen mus Hippocampus nervceller (30 DIV) infekterade med OER-GCaMP6f-uttryck AAV vektorer. Nervceller stimuleras med 100 µM DHPG, som är en agonist för metabotropa glutamatreceptorer, förmå Ca2 + release. DHPG-inducerad Ca2 + release på grund av OER-GCaMP6f upptäcktes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Figur 1: diagrammet visar membran-riktade GECIs. Schematisk bild av plasmamembran-riktade GECIs (Lck-GCaMP6f och Lck-RCaMP2) och yttre ER membran-riktade GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Figur 2: flödesschema för hippocampus och kortikal cell förberedelse, plasmid transfection och AAV infektion. De mikroskopiska bilderna är representativa, nymalen guldpläterade DIV-6 kortikala celler (vänster) och återupplivade celler från fryst lager (höger). Skalstapeln = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Figur 3: exempel på den samtidiga imaging Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f i HeLa cells. (A) Schematisk bild av signal separation med bild-delning optik. Samma synfält för Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f projiceras samtidigt på kameran. En representativ inspelning vid 10 Hz förvärvats av en CMOS kamera finns i Video 1och en ram av den här inspelningen visas i panel A (höger). (B) pseudo färgbilder av ΔF/F0 för Lck-GCaMP2 (överst) och OER-GCaMP6f (nederst). Histamin (hans, 1 µM) lades på 0 s. (C) representant normaliserade ΔF/F0 tidsförloppet för Lck-GCaMP2 (magenta) och OER-GCaMP6f (grön). Data var normaliserade till ΔF/F0 maximivärdet för varje tomt. De grå staplarna visar tidpunkten för sin ansökan. Data analyserades med en skräddarsydd programvara TI Workbench15. Skalstapeln = 50 µm (Mikroskopisk bild).  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Figur 4: Spontan Ca2 + höjd i astrocyterna övervakas för Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f uttryck. (A) representant hippocampus och (B) kortikala astrocyter transfekterade med Lck-RCaMP2 (överst) och OER-GCaMP6f (nederst). Kortikala celler var återupplivas från fryst lager kulturer. LCK-RCaMP2 och OER-GCaMP6f bilder förvärvades sekventiellt i samma cell, vid 2 Hz, med en EM-CCD-kamera. Tomterna på vänstra Visa tiden jagar av ΔF/Fbase mätt i ROIs anges i mikroskopiska bilden. Data analyserades med TI Workbench. Riktiga filmer finns i Video 2 Video 3, Video 4och Video 5. Skalstapeln = 20 µm (Mikroskopisk bild). Baslinjen drivan föreslår förändringar i den globala Ca2 + nivån i cellen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Figur 5: Exempel på Ca2 + imaging i nervceller med Lck-GCaMP6f och OER-GCaMP6f. (A) representativa råtta Hippocampus nervceller att uttrycka Lck-GCaMP6f på DIV 10 (vänster) och tomter visar tiden jagar av ΔF/F0 mätt i ROIs (gula cirklar) har angivits i bilden (till höger). Siffrorna i tid kursen motsvarar ROI nummer i bilden. Observera att det tidsmässiga mönstret Ca2 + höjd är olika mellan olika regioner av intresse. Baslinjen drivan tyder ökningen av den globala Ca2 + nivån i detta neuron. (B) ett exempel på mogen mus Hippocampus nervceller (DIV 30) infekterade med OER-GCaMP6f uttryck AAV vektorer (vänster). Den tid kursen tomt på ΔF/F0 mätt visar Ca2 + svaret till 100 µM (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) tillämpas vid den tidpunkt som framgår av det grå fältet. Gula cirklarna visar positionen för ROIs där tidsförloppet erhölls. Bilderna var förvärvat vid 2 Hz med en kyld-CCD-kamera (panel A) eller en EM-CCD-kamera (panel B) och analyseras med TI Workbench. Skalstapeln = 20 µm (Mikroskopisk bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: exempel på samtidig avbildning av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f i HeLa cells. Representativa inspelning förvärvat vid 10 Hz och presenteras i figur 3. Skalstapeln = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontan Ca2 + övergående hos Hippocampus astrocyten i Lck-RCaMP2. Representativa inspelning förvärvat vid 2 Hz (figur 4A), inspelad i samma synfält som Video 3. Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontan Ca2 + övergående hos en Hippocampus astrocyten i OER-GCaMP6f. Representativa inspelning förvärvat vid 2 Hz (figur 4A), i samma synfält som Video 2. Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontan Ca2 + övergående observerats i Lck-RCaMP2 i en kortikal astrocyten representativa inspelning förvärvat vid 2 Hz (figur 4B), inspelad i samma synfält som Video 5. Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontan Ca2 + övergående hos en kortikal astrocyten i OER-GCaMP6f. Representativa inspelning förvärvat vid 2 Hz (figur 4B), i samma synfält som Video 4. Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Exempel på Ca2 + imaging i en råtta Hippocampus neuron (DIV 10) av Lck-GCaMP6f. Exempel på neuronal Ca2 + signaler registreras vid 2 Hz (figur 5A). Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + release i en mus Hippocampus neuron (DIV 30) uttrycker OER-GCaMP6f. Exempel på neuronala Ca2 + signaler in i en mus Hippocampus nervcell angripits OER-GCaMP6f uttryck AAV vektorer (figur 5B). Neuron stimulerades med 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) tillämpas 30 s att framkalla Ca2 + release från ER. Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">vänligen klicka här för att ladda ner denna video.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators at JoVE.com

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissektion av lokala Ca2 + signaler i odlade celler av membran-riktade Ca2 + indikatorer

Här presenterar vi ett protokoll för Ca2 + imaging i nervceller och stödjeceller, som gör dissektion av Ca2 + signaler på subcellulär upplösning. Denna process är tillämplig på alla typer av celler som tillåter uttrycket av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer.

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Dissektionen av Kalcium signaler på en sub-cellulär upplösning, är en av de viktigaste stegen för avkodning intra-cellulära kalcium signaler som bestämmer produktionen biologiska fenomen. Detta protokoll beskriver en ny kalciumavbildningsmetod som möjliggör övervakning av själva ögonblicket av kalciumtillströmningen och kalciumrelease. Detta protokoll är tillämpligt på alla celltyper som tillåter uttryck av genetiskt kodade kalciumindikatorer.Vi tror att vår metod har potential att utvidgas till dissekering av kalcium signaler vid sub-cellulära upplösning i levande djur i lab kultur. Att hjälpa till att demonstrera proceduren blir Matsumi Hirose, en tekniker från vårt laboratorium. För att börja detta förfarande, placera 18 millimeter diameter glaslock glida i varje brunn av en 12 brunnsplatta.Använd steriliserat vatten, och förbered 12,5 milliliter av en 0,4%PEI-lösning för varje 12 brunnsplatta som används. Tillsätt en milliliter av PEI-lösningen till varje brunn, och se till att det inte finns några bubblor under täcksliren. Inkubera över natten i en koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius.Nästa dag, använd en aspirator för att ta bort PEI-lösningen. Tillsätt en milliliter steriliserat vatten till varje brunn och skaka plattan så att PEI-lösningen mellan täckslien och plattan tvättas ut ordentligt. Upprepa denna tvättprocess två extra gånger med färskt steriliserat vatten.Efter den slutliga tvätten, aspirera vattnet från varje brunn helt. Inuti huven, använd ett ultraviolett ljus för att torka och sterilisera locket glider i minst 15 minuter. Pei-belagd maträtt kan förvaras vid fyra grader Celsius i upp till två månader.När du är redo att fortsätta, belysa disken med ultraviolett ljus i 15 minuter, strax före användning. Tillsätt fem milliliter sterilt destillerat vatten i utrymmet mellan brunnarna för att förhindra avdunstning av odlingsmediet. Tvätta först cortices med inkubation saltlösning.Därefter, inkubera cortices med Trypsin och DNAse i inkubation saltlösning i fem minuter vid 37 grader Celsius. Sedan tvätta cortices tre gånger med iskall inkubation saltlösning. Ta bort supernatanten och tillsätt två milliliter pläteringsmedium kompletterat med 150 mikroliter DNAse I-lager.Dissociate cellerna genom pipettering tjugo gånger eller mindre och filtrera cellerna genom en cell sil med en porstorlek på 70 mikrometer. Därefter tvätta cellsilen med 20 milliliter av pläteringsmediet. För beredning av fryst celllager, tvätta cellerna med 20 milliliter av tvättmediet.Späd de kortikala cellerna med pläteringsmedium till en densitet av 140 000 livskraftiga celler per milliliter. Tillsätt sedan en milliliter av den utspädda cellupphängningen till PEI-belagda täcksedlarna i de 12 brunnskulturplattorna. Underhåll cellerna vid 37 grader Celsius i en koldioxidinkubator i två till tre dagar.När cellerna är stabila, två till tre dagar efter plätering, ändra odlingsmediet till underhållsmediet. För beredning av frusen cell lager, snurra ner cellen, med hjälp av en svängrotor för att centrifugera cellerna på 187 gånger G i tre minuter. Aspirera supernatanten och tillsätt kryokonserveringsmediet, som hålls vid fyra grader Celsius, för att få en celltäthet på 10 miljoner celler per milliliter.Aliquot en milliliter av cellupphängningen i kryogena rör. Placera rören i en cell frysning behållare med en frysning på minus en grader Celsius per minut, tills en temperatur på minus 80 grader Celsius nås. Överför frysbehållaren till en frys vid minus 80 grader Celsius.För att återuppliva de frusna cellerna, förvarv tvättmediet och underhållsmediet för frysta kortikala celler. Därefter tina de frusna cellerna snabbt i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Späd cellerna försiktigt med förvättat tvättmedium och centrifug med svängrotor vid 187 gånger G i tre minuter.Åter upphäva pelleten i en milliliter av tvätt medium och mäta livskraftig celltäthet. Späd sedan cellerna med underhållsmediet för frysta kortikala celler, för att ge en celltäthet på 300 000 celler per milliliter. Cede en milliliter av denna cell suspension i brunnarna i PEI belagda 12 brunnsplattor.För transfection tre till åtta dagar efter plätering, etikett två rör, en för plasma-DNA och den andra för transfection reagens. Tillsätt 50 mikroliter av reducerat serummedium per brunn, till varje rör. Tillsätt 0,5 mikrogram plasma-DNA per täcksli och en mikroliter av tillägg åtföljd av transfektionsreagens för nervceller, per brunn till plasma-DNA-röret.För samtransfection av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f, blanda 0,5 mikrogram av varje plasmid och en mikroliter tillägg i 50 mikroliter av reducerat serummedium per brunn. Därefter lägger du till en mikroliter transfektionsreagens per brunn till transfektionsreagensröret. Vortex båda rören i en till två sekunder.Tillsätt sedan transfektionsreagensblandningen till DNA-blandningen. Försiktigt pipetter för att blanda och inkubera i rumstemperatur i fem minuter. Ladda denna blandning på cellerna på ett drop-vis sätt.Inkubera i en koldioxidinkubator i två till tre dagar tills markörproteinerna uttrycks. Blanda L och O för att göra AAC-infektionen. Lägg till tre mikroliter av AAC per brunn till den blandade neuron-astrocyte kultur.Försiktigt klippa skålen att blanda. Underhåll kulturen i en till två veckor tills GECIs uttrycks. Montera först täcksligen som innehåller cellerna transfected med Lck-RCaMP2 och OER-CaMPG6f i mikroskopets inspelningskammare.Tillsätt 400 mikroliter av bildmediet och placera ett lock ovanpå kammaren. Välj filteruppsättningen för GCaMP6f och ljuskällan. Lokalisera astrocyterna som uttrycker OER-GCaMP6f.Därefter väljer du en filteruppsättning och ljuskälla för RCaMP2 och bekräftar om Lck-RCaMP2 uttrycks i samma astrocyter. Registrera bilder av tidsförlopp av Lck-RCaMP2 vid två Hertz i två minuter och spara bilddata. Efter detta, ändra filter som tillbaka till det för GCaMP6f.Registrera bilder för tidsförlopp av OER-GCaMP6f vid två Hertz i två minuter och spara bilddata. I denna studie, Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f uttrycks i HeLa celler och båda signalerna spelades in samtidigt med hjälp av bild uppdelning optik, 24 timmar efter transfection. Vid tillägg av Histamin ökade signalintensiteten hos Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f.De tidskurser av kalciumjonförhöjning som rapporteras av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f jämförs i samma regioner av intresse. Båda sensorer rapporterar en svängning-liknande kalciumjon höjd. Och båda visar samma tidskurs i två av de fem undersökta cellerna.De kalciumjonförhöjningar som Lck-RCaMP2 visar ligger dock kvar på den högre nivån än OER-GCaMP6f i de andra cellerna. Dessa resultat indikerar att kalciumjonförhöjningen förlängs i plasmamembranets närhet, medan den avslutas tidigare runt ER, som är källan till denna kalciumjonsignal som induceras av Histaminstimulering. Spontana kalciumjonsignaler från astrocyter i neuron-astrocyter blandad kultur från råtta hippocampi och cortices visas av Lck-RCaMP2 och OER-GCaMP6f.Spontana kalciumjonförhöjningar syns endast vid den astrocytiska processen, inte vid cellkroppen vilket överensstämmer med tidigare rapporter. Spontana kalciumjon höjder av Lck-GCaMP6f i omogna råtta hippocampus nervceller ses på två Hertz. Tidskurserna för fem olika intresseregioner tyder på att dessa höjder är lokalt begränsade till domänerna för sub-cellular.Mogna mus hippocampus nervceller infekterade med OER-GCaMP6f-uttryck AAV vektorer visa kalcium jon svar som svar på tillägg av DHPG. För kalciumavbildning är magnetiseringens luminationskraft den mest kritiska faktorn. Vänligen håll excitationsljuset så lågt som möjligt för att undvika fotoblekning och foto-toxicitet.Källan av calciumsignalerna kan vidare bekräftas av Pomakorzi som använder specifika inhibitors till calcium kanaliserar. Avkodning kalciumsignaler för att framkalla specifik utgång har varit en grundläggande biologisk fråga. Denna kalcium imaging teknik banar väg för att beskriva mångfalden av intra-cellulära kalcium signaler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging intracellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaler i Striatal Astrocyter från vuxna möss använda genetiskt kodade kalcium indikatorer

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

In Situ Ca 2 + avbildning av det enteriska nervsystemet

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation of Local CA1 ÃƒÅ½Ã‚Â³ Oscillations by Tetanic Stimulation

Generation av lokala CA1 γ Svängningar från tetanisk Stimulering

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...