Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Vi parlamentsarbejdet Lydia Sorokin, der har delt sin oprindelige in situ zymography protokol10 med os.

Alle undersøgelser blev gennemført under retningslinjerne efter den schweiziske lovgivning om beskyttelse af dyr og blev godkendt af Veterinærkontoret i kanton Bern, Schweiz (tilladelse numre: BE 31/17 og være 77/18).
1. boliger af C57BL/6 mus i specifikke patogen gratis (SPF) betingelser
<ol><li>Hus mus i individuelle ventileret bure med en 12/12 h lys-mørke cyklus. Leverer mad og vand ad libidum. For at overvåge mikrobiologiske kvalitet af mus, undergik den eksperimentelle kohorte k...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Vi præsenterer her, en protokol for at fremkalde og overvåge EAE i C57BL/6 hunmus. Hunnerne er fortrinsvis valgt, og der er en forekomst af kvinder: mænd 3:1 i MS. For at vurdere sværhedsgraden af EAE, vi har gjort brug af en 3-punkts scoring ark. EAE sværhedsgraden er generelt scorede med hensyn til sværhedsgraden af motor dysfunktioner. Mus med avancerede stadier af EAE, dvs udstiller en score over 2 må ofres for at undgå unødvendige lidelser for dyrene. Derfor anbefales det at score mus med tætte mellemrum f...

Det centrale nervesystem (CNS) koordinerer alle krop og mentale funktioner i hvirveldyr, og CNS homeostase er afgørende for en korrekt kommunikation af neuroner. CNS homeostase er berettiget af den neurovaskulære enhed (NVU), som beskytter CNS fra blodet skiftende miljø. NVU er sammensat af CNS mikrovaskulære endotelceller, som er biokemisk unikke og etablere blod - hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig krydstale med pericytes, astrocytter, neuroner og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, oprettelse af to særskilte kælderen membraner1. I endothelial basalmembranen at ensheathes abluminal aspekt i endothelial celler, BBB havne et stort antal af pericytes og er sammensat af laminin α4 og laminin α5, ud over andre ECM proteiner2. Derimod parenkymalt basalmembranen består af laminin en1 og laminin en2 og omfavnet af astrocytic end-fødder. Parenkymalt basalmembranen sammen med astrocyte ende-fødder komponerer glia limitans, der udskiller CNS neuronal netværk fra cerebrospinalvæsken fyldt perivascular eller subarachnoidale rum3. På grund af den unikke arkitektur af NVU er immun celle indsmugling til CNS adskiller sig fra, at i perifere væv som det kræver en totrinsproces med immunceller, først misligholdelse i endothelial BBB og efterfølgende glia limitans for at nå CNS parenkym.
Multipel sklerose (MS) er en fælles neuroinflammatory sygdom i CNS, hvor et stort antal cirkulerende immunceller Angiv CNS og forårsage neuroinflammation, demyelinering og fokale tab af BBB integritet4. Tab af BBB integritet er en tidlige kendetegnende for MS, som angivet ved tilstedeværelsen af gadolinium kontrast styrke læsioner i CNS som visualiseret ved magnetisk resonans imaging (MR)5. Leukocyt ekstravasation i CNS opstår på niveau med postcapillary venules; de præcise mekanismer involveret i immun celle diapedesis på tværs af BBB basalmembranen og efterfølgende glial barriere er dog stadig at blive udforsket. Eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerer som en dyremodel for MS og har bidraget betydeligt til vores nuværende viden om MS patogenese. For eksempel, er ved hjælp af EAE model det blevet opdaget at leukocyt ekstravasation opstår i en omstændelig proces, herunder en indledende tilfangetagelse og rullende trin medieret af selectins og mucin-lignende molekyler såsom P-selectin glycoprotein ligand (PSGL) -1, efterfulgt af integrin-afhængige fast anholdelse og kravler af T-celler på BBB endotelceller til eftergivende sider til diapedesis6.
Når T-celler har passeret i endothelial BBB og i endothelial basalmembranen, de har brug at støde deres beslægtet antigen på makrofager og dendritiske celler strategisk lokaliseret i leptomeningeal eller perivascular mellemrummene. Denne interaktion inducerer fokale produktion af pro-inflammatoriske mediatorer der udløser de efterfølgende mekanismer kræves for CNS væv invasion af immunceller via glia limitans7,8,9. Fokale aktivering af matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 ændrer chemokine aktivering og inducerer nedbrydning af ekstracellulære matrix receptorer på astrocyte ende-fødder, hvilket er en forudsætning for immun celle migration på tværs af glia limitans ind i den CNS parenkym og til at fremkalde den kliniske symptomdebut EAE10,11.
Kombinere påvisning af CNS infiltrerer immun celle med BBB giver lækage og gelatinase aktivitet i CNS væv sektioner værdifulde oplysninger om funktionelle integritet i endothelial og glial barrieren i forbindelse med neuroinflammation. For eksempel, vi for nylig undersøgt de konstitutive tab i endothelial tight junction molekyle junctional vedhæftning molekyle (JAM)-B i immun celle indsmugling til CNS i forbindelse med EAE. I forhold til sund vildtype C57BL/6 mus, sund JAM-B-mangelfuld littermates viste ingen forringelse af BBB integritet, som det fremgår af in vivo permeabilitet vurdering ved hjælp af endogene samt eksogene røbestoffer12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfuld C57BL/6 mus viste afhjælpes sygdomssymptomer, som var forbundet med inflammatoriske celle diffusering i leptomeningeal og perivascular rum12. For at undersøge dette fænomen vi anvendte i situ zymography, så identifikation af gelatinase aktivitet for at teste, hvis manglende gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfuld mus kan være ansvarlig for den reducerede antallet af immunceller stand til at bryde den glia limitans12.
Givet tilgængeligheden af genmodificerede forskellige mus modeller mangler, fx forskellige BBB tight junction molekyler, der kan forårsage ændringer i BBB funktion, metoder til at undersøge BBB integritet er vigtigt. Derudover kan nyudviklede stoffer indvirke på NVU barrierer. Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplet Freund adjuvanser. Vi så forklare hvor hen til lokalisere immun celle infiltration over i endothelial og glial barrierer af NVU og hvordan at studere in vivo endotel og glial barriere integritet af in situ påvisning af eksogene roebestoffer og gelatinase aktivitet, henholdsvis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

Den neurovaskulære enhed (NVU) er sammensat af mikrovaskulære endotelceller danner blod - hjerne barrieren (BBB), en endotel basalmembranen med integreret pericytes, og glia limitans sammensat af parenkymalt basalmembranen og astrocytic ende-feed omfavne abluminal aspekt af centralnervesystemet (CNS) microvessels. Ud over at opretholde CNS styrer homøostase i NVU immun celle indsmugling til CNS. Under immunosurveillance af CNS kan lave antal aktiverede lymfocytter krydser i endothelial barriere uden at forårsage BBB dysfunktion eller klinisk sygdom. Derimod under neuroinflammation som i multipel sklerose eller dens dyremodel kan eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) et stort antal af immunceller krydse BBB og efterfølgende glia limitans nåede til sidst CNS parenkym fører til klinisk sygdom. 
Immun celle migration i CNS parenkym er således en to-trins proces, der involverer en sekventiel migration over endotel og glial barrieren af NVU ansætte forskellige molekylære mekanismer. Hvis efter deres passage på tværs i endothelial barriere, T-celler støder deres beslægtet antigen på perivascular antigen-præsenterer celler deres lokale reaktivering vil indlede efterfølgende mekanismer fører til fokale aktivering af gelatinases, som vil sætte T-celler til at krydse den glial barriere og Indtast CNS parenkym. Herigennem, vurdering af både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i rumlige korrelationen til immun celle ophobning i CNS under EAE tillader for at angive tab af integritet i endothelial og glial hindringer af NVU. 
Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering og efterfølgende analysere BBB permeabilitet in vivo, ved hjælp af en kombination af eksogene fluorescerende sporstoffer. Yderligere viser vi, hvordan man visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjerner af in situ zymogaphy koblet til immunfluorescent stainings BBB kælderen membraner og CD45 + invaderende immunceller.

Vurdering af det kliniske forløb af EAE i C57BL/6 mus bør resultere i en sygdom kurven som afbilledet i figur 2A og ændringer i kropsvægt mus som præsenteret i figur 2B. C57BL/6 mus immuniseret med MOGaa35-55 normalt begynde at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10-12 efter aktiv immunisering (figur 1A). Typisk, immuniserede mus viser et forbigående fald i kropsvægt dagen efter injektion af emulsion og den første dosis af ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisere værdiforringelse af endotel og Glial barrierer af neurovaskulære enhed under eksperimentelle Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Vi præsenterer her, protokoller for at undersøge værdiforringelse af neurovaskulære enhed under eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis in vivo. Vi behandle specifikt, hvordan du bestemme blod - hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involveret i leukocyt migration på tværs af glia limitans.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

De metoder, der præsenteres her giver os mulighed for at studere de molekylære mekanismer immuncelle migration på tværs af hjernen barrierer i eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis, en dyremodel for multipel sklerose. Ved at undersøge blod- og hjernebarrieren permeabilitet og matrix-metalloprotease aktivitet på samme tid i rumlig korrelation til immuncelleinfiltration i hjernevæv sektioner, kan vi præcist knytte disse neuroinflammatoriske hændelser til de kliniske tegn på EAE. Professionel håndtering af syge mus kræver dybdegående træning samt korrekt scoring af de kliniske tegn på EAE.Således er den visuelle demonstration gavnlig. Begynd denne procedure med bedøvelse af C57-Black/6 mus, der har været anbragt i specifikke-patogen-fri betingelser som beskrevet i tekstprotokollen. Fastgør den bedøvede mus i den ene hånd, og indsprøjt 30 mikroliter mog peptid og komplet Freund's adjuvans emulsion subkutant i hver af de bageste ben flanker, i nærheden af de lyskelymfeknuder.Nu placere musen på maven, og injicere 20 mikroliter af MOG-peptid emulsion i det bløde fedtvæv på både venstre og højre ved halen roden. Også injicere en lille dråbe af emulsionen i halsen på musen. Injicer 100 mikroliter pertussis toksinopløsning intraperitoneally i musen.Hold hovedet af musen under kroppen center for at undgå injektion i tarmen. Udskift vedligeholdelseskosten til avlskosten for at forsyne musene med fødevarer med højere energiindhold før og under den forventede kliniske sygdom. Gentag pertussis toksininininjektionen 48 timer efter den første behandling.Tjek EAE-musenes helbredstilstand hver morgen ved at kigge ind i burene. Score EAE mus hver eftermiddag. Tag hver enkelt mus, der er inkluderet i EAE-eksperimentet, ud af buret, og kontroller, om halen har tonus.Flyt halen opad med en finger. En sund mus vil holde halen op. Hvis klinisk EAE er startet, vil hale tonus være lavere, synlig ved en gradvis dråbe af halen.Til sidst vil musen ikke være i stand til at løfte halen på alle. Placer hver enkelt mus, der er inkluderet i EAE-eksperimentet, på den rene bænk for at observere og dokumentere gangadfærden. Se teksten for pointkriterier for vurdering af sygdommens sværhedsgrad, som er EAE-scoren.Vurder og dokumenter vægten af hver mus, der indgår i eksperimentet. Til fremstilling af dextran lageropløsninger opløses 10 mg tre kilodalton Dextran Texas Red i 500 mikroliter af 0,9% natriumchloridopløsning og fem milligram 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 i 250 mikroliter 0,9% natriumchloridopløsning. Til dextran-arbejdsløsningen, lige før injektionen, pipettes 55 mikroliter af 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 lageropløsning på et stykke tætningsfilm.Derefter tilsættes 55 mikroliter af tre kilodalton Dextran Texas Red stock løsning. Bland og opsam 100 mikroliter i en engangsfin fin sprøjte. Dernæst placere en bedøvet mus i den laterale position på bordet.Intravenøst injicere 100 mikroliter af fluorescerende sporstoffer i musen, før musen vågner op. Lad sporstof cirkulere i 15 minutter, før der udføres perfusion af mus som beskrevet i tekstprotokollen. Fyld en flad dewar beholder med knust tøris, og tilsæt 2-methylbutan, indtil væsken når omkring en centimeter over den tørre ispose.Dæk med et løst låg, såsom et isspandsdæksel. Efter klipning fra hovedet af perfused musen med skarpe saks, fjerne hud og ører ved hjælp af et mindre sæt saks. Forsigtigt dissekere kalot ved at skære fra foramen magnum mod forsiden i venstre og højre side, at tillade upfolding af kalot over hjernen.Løft derefter forsigtigt den intakte hjerne ud fra bunden af kraniet, mens de optiske nerver afskæres ved hjælp af en flad metalspatel. Placer hjernen på aluminiumsfolie. Skær hjernen i tre stykker ved at placere to koronale nedskæringer.De tre stykker repræsenterer den frontale hjerne, midterste hjerne, og lillehjernen med hjernestamme. Fyld en Cryomold til første kvartal med optimal temperatur skærematrix. Derefter placere hjernen skiver i Cryomold, med den forreste side af hver hjerne stykke vender nedad.Dæk vævet helt med matrix. Placer Cryomold med vævet i en vandret orientering i 2-methylbutanbadet. Sørg for, at vævet fryser fra bunden til toppen inden for et minut ved at undgå at dyppe hele vævsblokken i badet.Overfør det frosne væv til minus 80 grader Celsius til opbevaring. Se tekstprotokollen for udarbejdelse af de frosne vævssektioner. Hent seks mikron, ikke-faste hjernevævssektioner, der var fremstillet af EAE-mus.I en røghætte optø sektionerne inde i plastfrysningsboksen, der indeholder silicagel i låget, for at undgå at holde vand i vævet. Adskaf to vævssektioner på et dias ved at tegne linjer med en vandafvisende pen. Centrifuge reaktionsopløsninger i fem minutter ved 13, 300 gange g ved stuetemperatur og forvard til 37 grader Celsius ved hjælp af et vandbad.Derefter rehydrere væv sektioner i fem minutter ved 37 grader Celsius ved hjælp af 1X reaktion buffer. Efter fem minutter hældes 1X-reaktionsbufferen af. Tilføj reaktionsopløsning på vævssektionerne, og inkuber i fire timer ved 37 grader Celsius.Vask derefter rutsjebanerne fem gange i dobbeltdestilleret vand. Nu fastgør sektionerne i fem minutter med iskold methanol ved minus 20 grader Celsius, før du vasker dem én gang med PBS ved stuetemperatur. Tilføj 1%BSA i PBS til sektionen, og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.Kassér derefter bufferen fra sektionen ved at vende diaset på et væv. Tilføj primære antistof cocktail til afsnittet, og inkubere i en time ved stuetemperatur. Efter vask af sektionerne to gange med PBS tilsættes sekundær antistofcocktail og inkuberes i en time ved stuetemperatur.Vask derefter sektionerne to gange med PBS, og monter diasene med indlejringsløsning. Efter at have ladet de monterede sektioner tørre natten over ved stuetemperatur, analysere farvede væv sektioner ved hjælp af en fluorescerende mikroskop. Sværhedsgraden af EAE-sygdommen stiger indtil sygdommens højdepunkt, hvilket kan forventes mellem dag 16 og 20 efter EAE-induktion.På toppen af klinisk EAE viste mus også den laveste kropsvægt, hvilket øger korrelationen med forbedringen af EAE i remissionsfasen af sygdommen. Vist her er et repræsentativt billede af choroid plexus og den tilstødende hjerne parenkym af en C57-Black/6 mus, der lider af EAE. Musen blev intravenøst injiceret 15 minutter før ofret.Sporstoffer let diffuse på tværs af fenestrated mikrovessels i stomien af choroid plexus, mens blod - hjerne barrieren ikke tillader diffusion af cirkulerende sporstoffer i hjernen parenkym, som således er blottet for nogen fluorescerende signal. Disse billeder viser repræsentative utætte blodkar i lillehjernen af en C57-Black/6 mus, der lider af EAE. Pilespidser angiver sporstoffer spredt over hele hjernen mikrolæller i CNS parenkym, hvilket tyder på, at blod - hjerne barrieren funktion er svækket i disse fartøjer.I CNS parenkym, grøn og rød fluorescerende signal er synlig uden for blodkar vægge. Korrekt subkutan placering af MOG-CFA-emulsionen er afgørende for at montere den passende immunrespons, der fører til EAE. Intraperitoneal og intramuskulær injektion bør undgås.Forbered CFA under en røghætte for at undgå indånding af det svækkede Mycobakteriium. Undgå også ens selvinjektion med MOG-CFA-emulsionen, da dette kan forårsage kondyloma eller endda føre til EAE hos personer, der er genetisk disponerede. Hjerneinfilterende immunceller kan isoleres fra CNS af mus, der lider af EAE, for at kvantificere infiltrerende immuncelleundergrupper under neuroinflammation ved flowcytometri.Vurdering af integriteten af endotel og glia hjerne barrierer kan oversættes til analyse af genetisk modificerede musemodeller eller til modeller af andre neurologiske lidelser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinde unresponsiveness i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) Resistente musestammer ved adoptiv overførsel og antigenudfordring

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin oligodendrocyt Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i C57BL / 6 mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion af Experimental Autoimmune Encephalomyelitis i mus og evaluering af sygdommen-afhængige Fordeling af immunceller i forskellige væv

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Bestemmelse immunsystemsuppression versus CNS Beskyttelse for farmakologisk intervention i Autoimmune Demyelinisering

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel og effektiv produktion og oprensning af Mouse Myelin oligodendrocyt Glycoprotein for Eksperimentel Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere virkningerne af sputum på Biofilm Development Ved hjælp af en Chambered dækglas Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

En hurtig, enkel og standardiseret homogeniseringsmetode til fremstilling af antigen / adjuvansemulsioner til inducering af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...