Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Noi riconosciamo con gratitudine Lydia Sorokin, che ha condiviso il suo originale in situ zymography protocollo10 con noi.

Tutti gli studi sono stati condotti sotto la Guida di riferimento secondo la legislazione svizzera sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall'ufficio veterinario del Cantone di Berna, in Svizzera (numeri di autorizzazione: BE 31/17 ed essere 77/18).
1. alloggiamento dei topi C57BL/6 in condizioni di agente patogeno specifico gratuite (SPF)
<ol><li>Ciclo di casa topi in gabbie individuali ventilate con un 12/12 h chiaro-scuro. Fornire cibo e acqua ad libidum. Per sorvegliare ...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e monitorare EAE in topi femminili C57BL/6. Le femmine sono preferenzialmente scelti, e c'è un'incidenza delle donne: gli uomini di 3:1 in MS. Per valutare la severità di EAE, abbiamo fatto uso di un foglio di Punteggio 3 punti. Gravità EAE è generalmente segnato per quanto riguarda la gravità delle disfunzioni motore. Topi con fasi avanzate di EAE, vale a dire che esibiscono un punteggio superiore a 2 dovrebbe essere sacrificata per evitare inutili sofferenze degli animali...

Il sistema nervoso centrale (SNC) coordina tutto il corpo e funzioni mentali nei vertebrati, e l'omeostasi del CNS è essenziale per una corretta comunicazione dei neuroni. Omeostasi del CNS è garantito dall'unità neurovascolare (NVU), che protegge il sistema nervoso centrale da milieu cambiamento del flusso sanguigno. Il NVU è composto di cellule endoteliali microvascolari CNS, che sono biochimicamente unici e stabilire l'emato - encefalica (BBB) continuo crosstalk con periciti, astrociti, neuroni e componenti della matrice extracellulare (ECM), che istituisce due distinta delle membrane dello scantinato1. La membrana basale endoteliale che ensheathes l'aspetto abluminale delle cellule endothelial BBB ospita un elevato numero di periciti e si compone di laminina α4 e laminin α5, oltre ad altre proteine ECM2. Al contrario, la membrana basale parenchimatica consiste di laminina α1 e α2 laminina ed è abbracciata dai puntali astrocytic. La membrana basale parenchimatica insieme con i puntali Astrocita compone il limitans glia che segrega la rete neuronale CNS dal liquido cerebrospinale riempito perivascolare o spazi subaracnoidei3. Dovuto l'architettura unica del NVU, delle cellule immuni traffico nello SNC sono distinta da che nei tessuti periferici come richiede un processo in due fasi con le cellule immunitarie, violazione prima endothelial BBB e successivamente il limitans glia al fine di raggiungere il parenchima di CNS.
Sclerosi multipla (SM) è una malattia comune neuroinfiammatorie dello SNC, in cui un gran numero di cellule immuni circolanti immettere il CNS e causare neuroinfiammazione, demielinizzazione e perdita focale di BBB integrità4. Perdita di integrità BBB è un precoce segno distintivo della MS, come indicato dalla presenza di contrasto gadolinio aumentando le lesioni del SNC come visualizzati da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)5. Diapedesi nello SNC avviene a livello delle venule post-capillari; Tuttavia, i meccanismi precisi coinvolti nel processo di diapedesi delle cellule immuni attraverso la membrana dello scantinato BBB e successivamente la barriera glial rimangono per essere esplorato. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) serve come modello animale per MS e ha contribuito in modo significativo alla nostra attuale conoscenza sulla patogenesi della SM. Per esempio, utilizzando il modello di EAE è stato scoperto che lo stravaso del leucocita si verifica in un processo a più fasi, tra cui un'acquisizione iniziale e rotolamento passaggio mediato da selectine e mucina-come molecole come ligando di glicoproteina P-selectina (PSGL) -1, seguita da arresto ferma integrina-dipendente e scansione di cellule T su cellule endoteliali BBB ai lati permissivi per diapedesi6.
Una volta che le cellule di T hanno attraversato il BBB endoteliale e la membrana basale endoteliale, hanno bisogno di incontrare il loro antigene cognate su macrofagi o cellule dendritiche strategicamente localizzate negli spazi leptomeningeal o perivascolare. Questa interazione induce focale produzione di mediatori pro-infiammatori che attivano i meccanismi successivi necessari per invasione del tessuto CNS di cellule del sistema immunitario tramite il glia limitans7,8,9. Attivazione focale di metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9 altera l'attivazione delle chemochine e induce la degradazione dei recettori di matrice extracellulare Astrocita fine-piedi, che è un prerequisito per immunitario cellulare migrazione attraverso il limitans glia nella Parenchima di CNS e per indurre l'insorgenza di sintomi clinici di EAE10,11.
La combinazione di rilevamento del sistema nervoso centrale di infiltrazione delle cellule immuni con BBB perdite e gelatinasi attività in sezioni di tessuto di CNS fornisce preziose informazioni circa l'integrità funzionale della barriera endoteliale e gliale nel contesto del neuroinflammation. Per esempio, abbiamo recentemente studiato la perdita costitutiva della molecola di adesione giunzionale del molecola endoteliale stretta della giunzione (marmellata)-B delle cellule immuni traffico nello SNC nel contesto di EAE. Non rispetto ai topi C57BL/6 di selvaggio-tipo sani, sani littermates JAM-B-carente ha mostrato alcuna compromissione dell'integrità BBB come mostrato dalla valutazione di permeabilità in vivo mediante traccianti endogeni come pure esogeno12. Nel contesto di EAE, topi C57BL/6 JAM-B-carente ha mostrato sintomi di malattia migliorata, che è stato associato con intrappolamento delle cellule infiammatorie negli spazi leptomeningeal e perivascolare12. Per esaminare questo fenomeno abbiamo applicato in situ zymography, che consenta l'identificazione dell'attività della gelatinasi al fine di verificare se la mancanza di attività della gelatinasi in topi carenti-marmellata-B può essere responsabile per la riduzione del numero di cellule del sistema immunitario in grado di violare il glia limitans12.
Data la disponibilità di diversi geneticamente modificati del mouse modelli manca, ad esempio, diverse molecole di giunzione stretta BBB che potrebbero causare cambiamenti nella funzione BBB, metodologie per l'analisi di integrità BBB sono importanti. Inoltre, recentemente sviluppati farmaci potrebbero influire sugli ostacoli NVU. Qui vi mostriamo come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva con la glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG)-peptide aa35-55 a coadiuvanti di Freund completo. Spieghiamo quindi come localizzare l'infiltrazione delle cellule immuni attraverso le barriere endoteliali e gliali la NVU e come studiare l'integrità della barriera endoteliale e gliali in vivo di rilevazione in situ di traccianti esogeni e attività della gelatinasi, rispettivamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

L'unità neurovascolare (NVU) è composto da cellule endoteliali microvascolari formando l'emato - encefalica (BBB), una membrana basale endoteliale con periciti incorporati, e la limitans glia composto da membrana dello scantinato parenchimatica e astrocitari alimentazione di testata che abbracciano l'aspetto abluminale di microvasi del sistema nervoso centrale (SNC). Oltre a mantenere CNS omeostasi il NVU controlla delle cellule immuni traffico nello SNC. Durante immunosorveglianza dello SNC basso numero di linfociti attivati può attraversare la barriera endoteliale senza causare BBB disfunzione o malattia clinica. Al contrario, durante la neuroinfiammazione come nella sclerosi multipla o il modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) un gran numero di cellule del sistema immunitario può attraversare la BBB e, successivamente, la glia limitans raggiungendo alla fine il parenchima di CNS che conducono alla malattia clinica. 
Migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS è dunque un processo in due fasi che comporta una migrazione sequenza attraverso la barriera endoteliale e gliale di NVU che impiegano meccanismi molecolari distinti. Se dopo il loro passaggio attraverso la barriera endoteliale, cellule T incontrano loro antigene cognate su cellule presentanti l'antigene perivascolare loro riattivazione locale avvierà successivi meccanismi che portano all'attivazione focale della gelatinasi, che consentirà le cellule di T di attraversare la barriera glial e immettere il parenchima di CNS. Così, valutazione, permeabilità BBB e attività MMP in correlazione spaziale per accumulo di cellule immuni nel SNC durante EAE permette di specificare perdita di integrità delle barriere endoteliali e gliali la nvu. 
Mostriamo qui come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva e come analizzare successivamente permeabilità BBB in vivo usando una combinazione di traccianti fluorescenti esogeni. Più ulteriormente indichiamo, come visualizzare e localizzare attività della gelatinasi nei cervelli EAE in situ zymogaphy accoppiato al immunofluorescente stainings di membrane dello scantinato BBB e CD45 + cellule immunitarie invasori.

Valutazione del decorso clinico di EAE in topi C57BL/6 dovrebbe risultare in una curva di malattia come raffigurato in Figura 2A e cambiamenti nel peso corporeo del mouse come presentato nella Figura 2B. C57BL/6 topi immunizzati con MOGaa35-55 solitamente iniziano a sviluppare i sintomi della malattia circa 10-12 giorno dopo immunizzazione attiva (Figura 1A). In genere, topi immunizzati mostrano un calo transitorio del peso corporeo...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

I metodi qui presentati ci permettono di studiare i meccanismi molecolari della migrazione delle cellule immunitarie attraverso le barriere cerebrali nell'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale per la sclerosi multipla. Studiando la permeabilità della barriera emato-encefalica e l'attività matrice-metalloproteasi allo stesso tempo nella correlazione spaziale con l'infiltrazione delle cellule immunitarie nelle sezioni del tessuto cerebrale, possiamo associare con precisione questi eventi neuroinfiammatori ai segni clinici dell'EAE. La manipolazione professionale dei topi masi richiede un allenamento approfondito, nonché il corretto punteggio dei segni clinici dell'EAE.Pertanto, la dimostrazione visiva è benefica. Iniziare questa procedura con l'anestesia di topi C57-Black/6 che sono stati ospitati in condizioni specifiche esenti da agenti patogeni come descritto nel protocollo di testo. Fissare il topo anestetizzato in una mano e iniettare 30 microlitri di peptide MOG e completare l'emulsione adiuvante di Freund sottocutaneamente in ciascuno dei fianchi della gamba posteriore, in prossimità dei linfonodi inguinali.Ora, posizionare il topo sulla pancia e iniettare 20 microlitri dell'emulsione mog-peptidica nel tessuto adiposo molle sia a sinistra che a destra nella radice della coda. Inoltre, iniettare una piccola goccia dell'emulsione nel collo del mouse. Iniettare 100 microlitri di soluzione di tossina pertosse intraperitonealmente nel topo.Tenere la testa del topo sotto il centro del corpo per evitare l'iniezione nell'intestino. Sostituire la dieta di mantenimento alla dieta riproduttiva al fine di fornire ai topi cibo con un contenuto energetico più elevato prima e durante la malattia clinica prevista. Ripetere l'iniezione di tossina pertosse 48 ore dopo il primo trattamento.Controlla lo stato di salute dei topi EAE ogni mattina dai un'occhiata all'interno delle gabbie. Segna topi EAE ogni pomeriggio. Togliere dalla gabbia ogni singolo topo incluso nell'esperimento EAE e verificare se la coda ha il tonus.Spostare la coda verso l'alto con un dito. Un topo sano manterrà la coda alta. Se l'EAE clinico è iniziato, il tono della coda sarà più basso, visibile da una graduale caduta della coda.Alla fine, il topo non sarà in grado di sollevare affatto la coda. Posizionare ogni singolo mouse incluso nell'esperimento EAE sul banco pulito per osservare e documentare il comportamento di camminata. Vedere il testo per i criteri di punteggio per la valutazione della gravità della malattia, che è il punteggio EAE.Valutare e documentare il peso di ogni mouse incluso nell'esperimento. Per preparare soluzioni stock di dextran, sciogliere 10 milligrammi di tre kilodalton Dextran Texas Red in 500 microlitri di soluzione di cloruro di sodio 0,9% e cinque milligrammi di 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 in 250 microlitri di soluzione di cloruro di sodio 0,9%. Per la soluzione di lavoro dextran, poco prima dell'iniezione, pipetta 55 microlitri di soluzione stock Dextran Alexa Fluor 488 da 10 kilodalton su un pezzo di pellicola di tenuta.Quindi, aggiungere 55 microlitri di soluzione stock di tre kilodalton Dextran Texas Red. Mescolare e raccogliere 100 microlitri in una siringa fine usa e getta. Quindi, posizionare un mouse anestetizzato nella posizione laterale sul tavolo.Iniettare per via endovenosa 100 microlitri di traccianti fluorescenti nel mouse prima che il mouse si svegli. Lasciare circolare il tracciante per 15 minuti prima di eseguire la perfusione di topi come descritto nel protocollo di testo. Riempire un contenitore di dewar piatto con ghiaccio secco schiacciato e aggiungere 2-metilbutano fino a quando il liquido raggiunge circa un centimetro sopra la confezione di ghiaccio secco.Coprire con un coperchio sciolto, come una copertura del secchio di ghiaccio. Dopo aver tagliato la testa del topo perfuso con forbici affilate, rimuovere la pelle e le orecchie usando un set più piccolo di forbici. Sezionare con cura la calotta cranica tagliando dal forame magnum verso la parte anteriore a sinistra e sul lato destro, per consentire l'upfolding della calotta cranica sul cervello.Quindi, sollevare con cura il cervello intatto dalla base del cranio mentre si tagliano i nervi ottici usando una spatola metallica piatta. Posizionare il cervello su un foglio di alluminio. Tagliare il cervello in tre pezzi posizionando due tagli coronali.I tre pezzi rappresentano il cervello frontale, il cervello medio e il cervelletto con tronco encefalico. Riempire un Cryomold al primo trimestre con una matrice di taglio a temperatura ottimale. Quindi, posizionare le fette cerebrali nel Cryomold, con il lato anteriore di ogni pezzo cerebrale rivolto verso il basso.Coprire completamente il tessuto con matrice. Posizionare il Cryomold con il tessuto in orientamento orizzontale nel bagno a 2 metilbutano. Assicurarsi che il tessuto si congeli dal basso verso l'alto entro un minuto evitando di immergere l'intero blocco tissutale nel bagno.Trasferire il tessuto congelato a meno 80 gradi Celsius per la conservazione. Vedi il protocollo di testo per la preparazione delle sezioni di tessuto congelato. Recupera sezioni di tessuto cerebrale non fisse da sei micron che erano state preparate da topi EAE.In una cappa aspirante, scongelare le sezioni all'interno della scatola di congelamento della plastica contenente gel di silice nel coperchio per evitare la ritenzione di acqua nel tessuto. Separare due sezioni di tessuto su una diapositiva disegnando linee con una penna che respinge l'acqua. Soluzioni di reazione di centrifugazione per cinque minuti a 13, 300 volte g a temperatura ambiente e pre-calde a 37 gradi Celsius utilizzando un bagno d'acqua.Quindi, reidratare le sezioni tissutali per cinque minuti a 37 gradi Celsius utilizzando un buffer di reazione 1X. Dopo cinque minuti, versare il tampone di reazione 1X. Aggiungere la soluzione di reazione sulle sezioni tissutali e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius.Quindi, lavare gli scivoli cinque volte in acqua doppia distillata. Ora, fissare le sezioni per cinque minuti con metanolo ghiacciato a meno 20 gradi Celsius prima di lavarle una volta con PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 1%BSA in PBS alla sezione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.Quindi, scartare il buffer dalla sezione capovolgendo la diapositiva su un tessuto. Aggiungere un cocktail di anticorpi primari alla sezione e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le sezioni due volte con PBS, aggiungere un cocktail di anticorpi secondari e incubare per un'ora a temperatura ambiente.Quindi, lavare le sezioni due volte con PBS e montare le diapositive con la soluzione di incorporamento. Dopo aver lasciato asciugare le sezioni montate durante la notte a temperatura ambiente, analizzare le sezioni di tessuto macchiato utilizzando un microscopio fluorescente. La gravità della malattia EAE aumenta fino al picco della malattia, che può essere previsto tra i giorni 16 e 20 dopo l'induzione delle EAE.Al culmine dell'EAE clinico, i topi hanno anche mostrato il peso corporeo più basso, che aumenta in correlazione con il miglioramento delle EAE nella fase di remissione della malattia. Ecco un'immagine rappresentativa del plesso coroideo e del parenchima cerebrale adiacente di un topo C57-Black/6 affetto da EAE. Il topo è stato iniettato per via endovenosa 15 minuti prima di sacrificarsi.I traccianti si diffondono facilmente attraverso i microvessi fenestrati nello stoma del plesso coroideo, mentre la barriera ematico-encefalica non consente la diffusione dei traccianti circolanti nel parenchima cerebrale, che è quindi privo di qualsiasi segnale fluorescente. Queste immagini mostrano vasi sanguigni rappresentativi che perdono nel cervelletto di un topo C57-Black/6 affetto da EAE. Le punte di freccia indicano traccianti diffusi attraverso i microvessel cerebrali nel parenchima del SNC, suggerendo che la funzione di barriera emato-encefalica è compromessa in questi vasi.Nel parenchima del SNC, il segnale fluorescente verde e rosso è visibile al di fuori delle pareti dei vasi sanguigni. Il corretto posizionamento sottocutaneo dell'emulsione MOG-CFA è essenziale per montare l'appropriata risposta immunitaria che porta all'EAE. L'iniezione intraperitoneale e intramuscolare deve essere evitata.Preparare il CFA sotto una cappa aspirante per evitare l'inalazione del Mycobacterium attenuato. Inoltre, evitare l'autointesi con l'emulsione MOG-CFA, in quanto ciò può causare condiloma o persino portare all'EAE in individui geneticamente predisposti. Le cellule immunitarie infiltrazioni cerebrali possono essere isolate dal SNC dei topi affetti da EAE per quantificare i sottoinsiemi di cellule immunitarie infiltrate durante la neuroinfiammazione per citometria del flusso.La valutazione dell'integrità dell'endoteliale e delle barriere cerebrali gliali può essere tradotta nell'analisi di modelli di topi geneticamente modificati o in modelli di altri disturbi neurologici.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l&#39;induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Potenziamento dell'immunogenicità da parte di Mycobacterium paratuberculosis nell'encefalomielite autoimmune

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Autore in primo piano: Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale  

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...