Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Vi erkjenner takknemlig Lydia Sorokin, som delte hennes opprinnelige i situ zymography protokollen10 med oss.

Alle studier ble utført under retningslinjene ifølge den sveitsiske lovgivningen om beskyttelse av dyr og ble godkjent av veterinær kontor Kantonen Bern, Sveits (tillatelse tall: være 31-17 og være 77/18).
1. boliger C57BL/6 mus i bestemte patogen gratis (SPF) forhold
<ol><li>Huset mus i individuelle ventilert bur med en 12/12 h lys og mørke syklus. Skaffe mat og vann ad libidum. For å overvåke mikrobiologisk kvalitet av mus, gjennomgikk eksperimentelle kohort kvartalsvise helseover...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Her presenterer vi en protokoll for å indusere og overvåke EAE i kvinnelige C57BL/6 mus. Kvinner er preferentially valgt, og det er en forekomst av kvinner: menn 3:1 i MS. For å vurdere alvorlighetsgraden av EAE, vi gjort bruk av et 3-punkts scoring ark. EAE alvorlighetsgraden er generelt scoret med hensyn til alvorlighetsgraden av motor dysfunksjoner. Mus med avanserte stadier av EAE, dvs viser en score over 2 skal bli ofret for å unngå unødvendig lidelse av dyrene. Derfor er det anbefalt å score mus med like int...

Sentralnervesystemet (CNS) koordinerer alle kropp og mentale funksjoner i virveldyr CNS homeostase er avgjørende for riktig kommunikasjon av neurons. CNS homeostase er garantert av nevrovaskulære enhet (NVU), som beskytter CNS fra blodet endring miljøet. NVU består av CNS mikrovaskulær endotelceller, som er biokjemisk unike og etablere blod - hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig crosstalk med pericytes, astrocyttene, nerveceller og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, etablere to forskjellige kjelleren membraner1. Endothelial kjelleren membranen som ensheathes abluminal aspekt av BBB endotelceller havner mange pericytes og består av laminin α4 og laminin α5, i tillegg til andre ECM proteiner2. Derimot parenchymal kjelleren membranen består av laminin α1 og laminin α2 og blir omfavnet av astrocytic slutten-fot. Den parenchymal kjelleren membranen med astrocytter slutten-føttene komponerer den glia limitans som segregerer CNS neuronal nettverket fra Cerebrospinalvæske fylt perivascular eller subarachnoid mellomrom3. På grunn av den unike arkitekturen i NVU er immun celle menneskehandel i CNS forskjellig fra at i perifere vev som det krever en prosess med immunceller, første brudd endothelial BBB og senere glia limitans for å nå CNS parenchyma.
Multippel sklerose (MS) er en vanlig neuroinflammatory sykdom i CNS, der et stort antall sirkulerende immunceller angi CNS og forårsake neuroinflammation, demyelinisering og fokal tap av BBB integritet4. Tap av BBB integritet er en tidlig kjennetegner MS, som indikert av tilstedeværelsen av gadolinium motsetning styrke lesjoner i CNS som visualisert av magnetisk resonans imaging (MRI)5. Leukocytter bloduttredelse til CNS oppstår på nivået av postcapillary venules; men gjenstår nøyaktig mekanismer involvert i immun celle diapedesis over BBB kjelleren membranen og glial barrieren å bli utforsket. Eksperimentell autoimmune immunsviktvirus (EAE) fungerer som en dyremodell for MS og har bidratt betydelig til vår nåværende kunnskap om MS patogenesen. For eksempel har bruker EAE modellen det blitt oppdaget at leukocytter bloduttredelse oppstår i en må prosess, inkludert en første fangst og rullende steg formidlet av selectins og mucin-lignende molekyler som P-selectin glykoprotein ligand (PSGL) -1, etterfulgt av integrin-avhengige fast arrestasjon og gjennomgang av T-celler på BBB endotelceller ettergivende sidene i diapedesis6.
Når T celler har krysset endothelial BBB og endothelial kjelleren membranen, trenger de å møte deres beslektet antigen på makrofager eller dendrittiske celler strategisk lokalisert i leptomeningeal eller perivascular mellomrommene. Dette samspillet induserer fokal produksjon av pro-inflammatoriske mediatorer den utløseren ytterligere mekanismer kreves for CNS vev invasjonen av immunceller via glia limitans7,8,9. Fokal aktivering av matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 endrer chemokine aktivisering og induserer nedbrytning av ekstracellulær matrix reseptorer på astrocytter slutten-fot, som er en forutsetning for immun celle migrasjon over den glia limitans i den CNS parenchyma og å indusere utbruddet av kliniske symptomer EAE10,11.
Kombinere påvisning av CNS infiltrere immun celle med BBB gir lekkasje og gelatinase aktivitet i CNS vev delene verdifull informasjon om funksjonelle integriteten av endothelial og glial barrieren i sammenheng med neuroinflammation. For eksempel, vi nylig undersøkt konstituerende tap av endothelial tett krysset molekyl junctional vedheft molekyl (SYLTETØY)-B i immun celle menneskehandel i CNS i sammenheng med EAE. Sammenlignet med sunn vill-type C57BL/6 mus, sunn JAM-B-mangelfull littermates viste ingen nedskrivning av BBB integritet som vist i vivo permeabilitet vurdering ved hjelp av endogene samt eksogene tracers12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfull C57BL/6 mus viste ameliorated sykdomssymptomer, som var forbundet med inflammatorisk celle overlapping i leptomeningeal og perivascular mellomrom12. Undersøke fenomenet vi brukt i situ zymography, slik at ID gelatinase aktivitet for å teste om mangelen på gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfull mus kan være ansvarlig for redusert antall immunceller klarte å bryte den glia limitans12.
Ettersom finnes endret ulike genetisk musen modeller mangler, f.eks forskjellige BBB tett krysset molekyler som kan forårsake endringer i BBB funksjon, metoder for å undersøke BBB integritet er viktig. I tillegg kan nyutviklet narkotika påvirke NVU barrierer. Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i fullstendig Freund adjuvans. Deretter forklarer vi hvordan å lokalisere immun celle infiltrasjon over endothelial og glial barrierer av NVU og studien i vivo endothelial og glial barriere integritet i situ påvisning av eksogene tracers og gelatinase aktivitet, henholdsvis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

Nevrovaskulære enheten (NVU) består av mikrovaskulær endotelceller danner blod - hjerne barrieren (BBB), en endothelial kjelleren membran med innebygd pericytes, og glia limitans består av parenchymal kjelleren membranen og astrocytic slutten-feed omfavner abluminal aspekt av sentralnervesystemet (CNS) microvessels. Tillegg til å opprettholde CNS styrer homeostase NVU immun celle menneskehandel i CNS. Under immunosurveillance av CNS kan lave antall aktivert lymfocytter krysse endothelial barrieren uten å forårsake BBB dysfunksjon eller kliniske sykdommen. Derimot under neuroinflammation som multippel sklerose eller dyr modell kan eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE) et stort antall immunceller krysse BBB og senere glia limitans eventuelt nå CNS parenchyma fører til kliniske sykdommen. 
Immun celle migrasjon i CNS parenchyma er en prosess som involverer en sekvensiell overføring over endothelial og glial barrieren for NVU ansette distinkte molekylære mekanismer. Hvis etter deres passasje over endothelial barrieren, T celler møte deres beslektet antigen på perivascular antigen presentere celler deres lokale reaktivering starte etterfølgende mekanismer fører til fokal aktivering av gelatinases, som gjør de T-cellene til å krysse glial barrieren og angi CNS parenchyma. Derfor kan vurdere både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i romlig sammenheng med immun celle akkumulering i CNS under EAE angi tap av integriteten til endotelial og glial barrierer av NVU. 
Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering og deretter analysere BBB permeabilitet i vivo bruke en kombinasjon av eksogene fluorescerende tracers. Vi ytterligere vise, hvordan å visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjernen av i situ zymogaphy koblet til immunofluorescent stainings av BBB kjelleren membraner og CD45 + invaderende immunceller.

Vurdering av klinisk selvfølgelig EAE i C57BL/6 mus skal resultere i en sykdom kurve som avbildet i figur 2A og endringer i kroppsvekt mus som presentert i figur 2B. C57BL/6 mus vaksinert med MOGaa35-55 vanligvis begynne å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10-12 etter aktiv immunisering (figur 1A). Vanligvis viser vaksineres mus en forbigående dråpe kroppsvekt dagen etter injeksjon av emulsjonen og den første dosen av kikhoste...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisere nedsatt Endothelial og Glial barrierer av nevrovaskulære under eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus i Vivo

Her presenterer vi for å undersøke svekkelse av nevrovaskulære under eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus i vivo. Vi adresse spesielt hvordan du fastslår blod - hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involvert i leukocytter migrasjon over glia-limitans.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Metodene som presenteres her tillater oss å studere molekylære mekanismer for immuncellemigrasjon over hjernebarrierene i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, en dyremodell for multippel sklerose. Ved å undersøke blod-hjernebarriere permeabilitet og matrise-metalloprotease aktivitet samtidig i romlig korrelasjon til immuncelleinfiltrasjon i hjernevevsseksjoner, kan vi nettopp knytte disse nevroinflammatoriske hendelsene til de kliniske tegnene på EAE. Profesjonell håndtering av syke mus trenger grundig opplæring, samt riktig scoring av de kliniske tegnene på EAE.Dermed er den visuelle demonstrasjonen gunstig. Begynn denne prosedyren med bedøvelse av C57-Black/6-mus som har blitt plassert under spesifikke patogenfrie forhold som beskrevet i tekstprotokollen. Fest den bedøvede musen i den ene hånden, og injiser 30 mikroliter av MOG peptid og fullfør Freunds adjuvante emulsjon subkutant inn i hver av bakbenflankene, i nærheten av inngangslymfeknuter.Plasser nå musen på magen, og injiser 20 mikroliter av MOG-peptidemulsjonen i det myke fettvevet på både venstre og høyre ved haleroten. Injiser også en liten dråpe emulsjon i musens hals. Injiser 100 mikroliter kikhostetoksinoppløsning intraperitoneally i musen.Hold musens hode under kroppssenteret for å unngå injeksjon i tarmen. Erstatt vedlikeholdsdietten til avlsdietten for å gi musene mat med høyere energiinnhold før og under den forventede kliniske sykdommen. Gjenta kikhostetoksininjeksjonen 48 timer etter første behandling.Sjekk helsestatusen til EAE-mus hver morgen ved å ta en titt inne i burene. Score EAE-mus hver ettermiddag. Ta hver enkelt mus som er inkludert i EAE-eksperimentet ut av buret, og sjekk om halen har tonus.Flytt halen oppover med en finger. En sunn mus vil holde halen oppe. Hvis klinisk EAE har startet, vil haletnus være lavere, synlig av en gradvis dråpe av halen.Til slutt vil musen ikke være i stand til å løfte halen i det hele tatt. Plasser hver enkelt mus som er inkludert i EAE-eksperimentet på den rene benken for å observere og dokumentere gangatferden. Se teksten for å score kriterier for vurdering av sykdomsalvorlighetsgrad, som er EAE-poengsummen.Vurder og dokumenter vekten av hver mus som er inkludert i eksperimentet. For å forberede dextran lagerløsninger, oppløs 10 milligram tre kilodalton Dextran Texas Red i 500 mikroliter på 0,9% natriumkloridoppløsning og fem milligram 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 i 250 mikroliter på 0,9% natriumkloridløsning. For dextran arbeidsløsning, like før injeksjon, pipette 55 mikroliter av 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 lagerløsning på et stykke forsegling film.Deretter legger du til 55 mikroliter tre kilodalton Dextran Texas Red stock-løsning. Bland og samle 100 mikroliter i en engangs fin sprøyte. Deretter plasserer du en bedøvet mus i sidestilling på bordet.Injiser intravenøst 100 mikroliter av fluorescerende sporstoffer i musen før musen våkner. La tracer sirkulere i 15 minutter før du utfører perfusjon av mus som beskrevet i tekstprotokollen. Fyll en flat dewar beholder med knust tørris, og tilsett 2-metylbutan til væsken når omtrent en centimeter over tørrispakken.Dekk med et løst lokk, for eksempel et isbøttedeksel. Etter å ha klippet av hodet på den perfused musen med skarp saks, fjern hud og ører ved hjelp av et mindre sett med saks. Disseker skallen forsiktig ved å kutte fra foramen magnum mot forsiden til venstre og høyre side, for å tillate oppfolding av hodeskallen over hjernen.Deretter løfter du forsiktig ut den intakte hjernen fra bunnen av skallen mens du kutter de optiske nervene ved hjelp av en flat metallspatel. Plasser hjernen på aluminiumsfolie. Skjær hjernen i tre stykker ved å plassere to koronar kutt.De tre stykkene representerer frontal hjerne, mellomhjerne og lillehjernen med hjernestammen. Fyll en Cryomold til første kvartal med optimal temperatur kutte matrise. Deretter plasserer du hjerneskivene i Cryomold, med den fremre siden av hvert hjernestykke vendt nedover.Dekk vevet helt med matrise. Plasser Cryomold med vevet i horisontal orientering i 2-metylbutanbadet. Sørg for at vevet fryser fra bunnen til toppen innen ett minutt ved å unngå å dyppe hele vevsblokken i badekaret.Overfør det frosne vevet til minus 80 grader Celsius for lagring. Se tekstprotokollen for fremstilling av de frosne vevsseksjonene. Hent seks mikron, ikke-faste hjernevevsseksjoner som var utarbeidet fra EAE-mus.I en røykhette tiner du seksjonene inne i plastfryseboksen som inneholder silikagel i lokket for å unngå oppbevaring av vann i vevet. Skill to vevsseksjoner på ett lysbilde ved å tegne linjer med en vannavstøtende penn. Sentrifugereaksjonsløsninger i fem minutter ved 13, 300 ganger g ved romtemperatur, og forvarmende til 37 grader Celsius ved hjelp av et vannbad.Deretter rehydrerer vevsseksjonene i fem minutter ved 37 grader Celsius ved hjelp av 1X reaksjonsbuffer. Etter fem minutter, hell av 1X reaksjonsbufferen. Legg reaksjonsløsning på vevsseksjonene, og inkuber i fire timer ved 37 grader Celsius.Vask deretter skliene fem ganger i dobbeltdestillert vann. Nå, fikse seksjonene i fem minutter med iskald metanol på minus 20 grader Celsius før du vasker dem en gang med PBS ved romtemperatur. Legg til 1% BSA i PBS i delen, og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.Deretter kaster du bufferen fra delen ved å vende lysbildet på et vev. Legg til primær antistoffcocktail i seksjonen, og inkuber i en time ved romtemperatur. Etter å ha vasket seksjonene to ganger med PBS, legg til sekundær antistoffcocktail og inkuber i en time ved romtemperatur.Vask deretter seksjonene to ganger med PBS, og monter lysbildene med innebyggingsløsning. Etter å ha latt de monterte seksjonene tørke over natten ved romtemperatur, analyser fargede vevsseksjoner ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Alvorlighetsgraden av EAE-sykdommen øker til toppen av sykdommen, som kan forventes mellom dag 16 og 20 etter EAE-induksjon.På toppen av klinisk EAE viste mus også den laveste kroppsvekten, noe som øker i korrelasjon til forbedring av EAE i remisjonsfasen av sykdommen. Vist her er et representativt bilde av choroid plexus og tilstøtende hjerneparenchyma av en C57-Black / 6 mus som lider av EAE. Musen ble intravenøst injisert 15 minutter før han ofret.Tracers lett diffus over fenestrated mikrovessler inn i stomien av choroid plexus, mens blod-hjernebarrieren ikke tillater diffusjon av sirkulerende tracers inn i hjernen parenchyma, som dermed er blottet for noen fluorescerende signal. Disse bildene viser representative lekkede blodkar i lillehjernen til en C57-Black/6-mus som lider av EAE. Pilspisser indikerer tracers spredt over hjernen mikrovessels inn i CNS parenchyma, noe som tyder på at blod-hjerne barriere funksjonen er svekket i disse fartøyene.I CNS parenchyma er grønt og rødt fluorescerende signal synlig utenfor blodkarveggene. Riktig subkutan plassering av MOG-CFA-emulsjonen er avgjørende for å montere riktig immunrespons som fører til EAE. Intraperitoneal og intramuskulær injeksjon bør unngås.Forbered CFA under en røykhette for å unngå innånding av det dempede Mycobacterium. Unngå også ens selvinjeksjon med MOG-CFA-emulsjonen, da dette kan forårsake kondylom eller til og med føre til EAE hos personer som er genetisk disponert. Hjerneinfiltrerende immunceller kan isoleres fra CNS hos mus som lider av EAE for å kvantifisere infiltrerende immuncelleundergrupper under nevroinflammasjon ved strømningscytometri.Vurdering av integriteten til endotelet og glialhjernebarrierene kan oversettes til analyse av genmodifiserte musemodeller eller til modeller av andre nevrologiske lidelser.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin oligodendrocyte Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induced Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i C57BL / 6 Mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

En rask, enkel og standardisert homogeniseringsmetode for å fremstille antigen / adjuvante emulsjoner for å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Immunogenisitetsforsterkning av Mycobacterium paratuberculosis ved autoimmun encefalomyelitt

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Forfatter Spotlight: Adjuvant aktivitet av Mycobacterium paratuberculosis for å forbedre immunogenisiteten til autoantigener under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt  

Adjuvant aktivitet av Mycobacterium paratuberculosis ved å øke immunogeniteten til autoantigener under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...