Name: visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Reconhecemos com gratidão Lydia Sorokin, quem tem compartilhado seu original em situ zimografia protocolo10 conosco.

Todos os estudos foram conduzidos sob as diretrizes de acordo com a legislação Suíça relativa à protecção dos animais e foram aprovados pelo Instituto veterinário no Cantão de Berna, Suíça (números de permissão: BE 31/17 e ser 77/18).
1. habitação de camundongos C57BL/6 em condições (SPF) livre de patógeno específico
<ol><li>Ciclo de casa os ratos em gaiolas ventiladas individuais com 12/12 h claro-escuro. Providenciar comida e água ad libidum. Para supervisionar a quali...

<ol>
	<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers:+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions.">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+basement+membrane+laminin+alpha5+selectively+inhibits+T+lymphocyte+extravasation+into+the+brain.">Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain.</a> Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).</li><li>Hannocks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+perivascular+drainage+pathways+in+the+murine+brain.">Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 38, 669-686 (2018).</li><li>Kermode, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+precedes+symptoms+and+other+MRI+signs+of+new+lesions+in+multiple+sclerosis.+Pathogenetic+and+clinical+implications.">Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications.</a> Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).</li><li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimaging+techniques+to+assess+inflammation+in+Multiple+Sclerosis.">Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. , (2017).</li><li>Lopes Pinheiro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+trafficking+across+the+barriers+of+the+central+nervous+system+in+multiple+sclerosis+and+stroke.">Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).</li><li>Bartholomaus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+T+cell+interactions+with+meningeal+vascular+structures+in+nascent+autoimmune+CNS+lesions.">Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions.</a> Nature. 462, 94-98 (2009).</li><li>Kyratsous, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).</li><li>Lodygin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+fluorescent+NFAT+and+H2B+sensors+uncovers+dynamics+of+T+cell+activation+in+real+time+during+CNS+autoimmunity.">A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity.</a> Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).</li><li>Agrawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan+is+selectively+cleaved+at+the+parenchymal+basement+membrane+at+sites+of+leukocyte+extravasation+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+MMP-2+and+MMP-9+activity+at+the+blood-brain+barrier+promotes+chemokine-induced+leukocyte+migration.">Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration.</a> Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).</li><li>Tietz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+junctional+adhesion+molecule+(JAM)-B+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).</li><li>Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).</li><li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+(MOG35-55)+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+in+C57BL/6+mice.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> Journal of Visual Experiments. , (2014).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+clinical+scoring+in+comparative+EAE+studies+does+not+enhance+the+chance+to+observe+statistically+significant+differences.">Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences.</a> European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Miller, S. D., Karpus, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+mouse.">Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse.</a> Current Protocols in Immunology. 15, (2007).</li><li>Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL/J+mice+induced+by+a+synthetic+peptide+of+myelin+proteolipid+protein.">Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).</li><li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease.">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li><li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-H1+shapes+T-cell-mediated+brain+endothelial+cell+dysfunction+and+regional+encephalitogenicity+in+spontaneous+CNS+autoimmunity.">B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).</li><li>Tietz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MK2+and+Fas+receptor+contribute+to+the+severity+of+CNS+demyelination.">MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination.</a> PLoS One. 9, e100363 (2014).</li><li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li><li>Korner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+points+of+tumor+necrosis+factor+action+in+central+nervous+system+autoimmune+inflammation+defined+by+gene+targeting.">Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting.</a> Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).</li><li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia.">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li><li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption.">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li><li>Graesser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+vascular+permeability+and+early+onset+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+PECAM-1-deficient+mice.">Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+spaces+and+the+two+steps+to+neuroinflammation.">Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).</li><li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+laminin+isoforms,+laminins+8+and+10,+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li><li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li></ol>

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir e monitorar EAE em camundongos C57BL/6 fêmeas. As fêmeas são preferencialmente escolhidas, e há uma incidência de mulheres: os homens de 3:1 em MS. Para avaliar a gravidade da EAE, fizemos uso de uma folha de Pontuação de 3 pontos. Severidade da EAE geralmente é marcada em relação a gravidade das disfunções motor. Ratos com avançados estágios da EAE, ou seja, exibir uma pontuação acima de 2 deve ser sacrificado para evitar o sofrimento desnecessário dos animai...

Sistema nervoso central (SNC) coordena todas as funções mentais em vertebrados e corpo, e homeostase do CNS é essencial para uma comunicação adequada dos neurônios. Homeostase do CNS é garantido pela unidade neurovascular (NVU), que protege o CNS de meio de mudança do fluxo de sangue. O NVU é composto de CNS microvascular em células endoteliais, que são bioquimicamente únicos e estabelecer a barreira hemato - encefálica (BBB) em interferência contínua com pericitos, astrócitos, neurônios e componentes da matriz extracelular (ECM), que estabelece dois membranas de porão distintas1. A membrana basal endotelial que ensheathes o aspecto abluminal das células endoteliais BBB abriga um número elevado de pericitos e é composto de laminina α4 e α5 laminina, além de outras proteínas de ECM2. Em contraste, a membrana basal parenquimatosa consiste de laminina α1 e α2 laminina e é abraçada por hamartomas ponta-pés. A membrana basal parenquimatosa juntamente com os fim de astrocyte-pés compõe o limitans glia que segrega a rede neuronal CNS do líquido cefalorraquidiano preenchido perivascular ou espaços subaracnoideo3. Devido a arquitetura original do NVU, célula imune ao tráfico para o CNS é distinta do que em tecidos periféricos como requer um processo de duas etapas com as células do sistema imunológico, primeiro violar o BBB endotelial e, posteriormente, o limitans glia a fim de alcançar o parênquima do CNS.
Esclerose múltipla (em) é uma doença comum do MPTP do SNC, em que um grande número de células do sistema imunológico em circulação Insira o CNS e causar neuroinflammation, desmielinização e perda focal de integridade BBB4. Perda de integridade BBB é uma marca início do MS, conforme indicado pela presença de contraste gadolínio realçando lesões no SNC como visualizado por ressonância magnética (MRI)5. Extravasamento de leucócitos para o CNS ocorre ao nível da postcapillary vênulas; no entanto, os precisos mecanismos envolvidos na diapedese de células imunes através da membrana basal do BBB e, posteriormente, a barreira glia permanecem para ser explorado. Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) serve como um modelo animal para MS e tem contribuído significativamente para o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da MS. Por exemplo, usando o modelo de EAE foi descoberto que o extravasamento de leucócitos ocorre em um processo de várias etapas, incluindo uma captura inicial e rolamento passo mediada por selectinas e mucina-como moléculas como ligante de glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido de prisão firme integrina-dependente e um rastreamento de células T em células endoteliais BBB aos lados permissivos para diapedese6.
Uma vez que as células T cruzaram o BBB endotelial e a membrana basal endotelial, eles precisam encontrar seu cognato antígeno macrófagos ou células dendríticas estrategicamente localizadas nos espaços leptomeníngeo ou perivascular. Essa interação induz a produção focal de mediadores pró-inflamatórios esse gatilho os subsequentes mecanismos necessários para invasão de tecido do CNS de células do sistema imunológico através da glia limitans7,8,9. Ativação focal de matrix-metaloproteinases (MMP) -2 e MMP-9 altera chemokine ativação e induz a degradação dos receptores de matriz extracelular em astrocyte ponta-pés, que é um pré-requisito para imunológico migração de células através da glia limitans para o Parênquima do CNS e induzir o aparecimento de sintomas clínicos de EAE10,11.
Combinando a deteção do CNS, infiltrando-se imune celular com BBB escapamento e gelatinase atividade em cortes de tecido do CNS fornece informações valiosas sobre a integridade funcional da barreira endotelial e glia no contexto de neuroinflammation. Por exemplo, recentemente investigamos a perda constitutiva da molécula de adesão endotelial junção apertada molécula (JAM)-B em células imunes ao tráfico para o CNS no contexto da EAE. Comparado ao saudáveis camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, saudáveis littermates JAM-B-deficiente mostraram sem comprometimento da integridade do BBB, como demonstrado pela avaliação de permeabilidade in vivo usando marcadores endógenos como exógenos12. No contexto da EAE, JAM-B-deficientes C57BL/6 ratos mostraram sintomas de doença melhorou, que foi associado com interceptação de células inflamatórias na leptomeníngeo e perivascular espaços12. Para examinar este fenômeno aplicamos em situ zimografia, permitindo a identificação de gelatinase atividade para testar se a falta de atividade de gelatinase em camundongos JAM-B-deficiente pode ser responsável para o número reduzido de células do sistema imunológico capazes de romper a glia limitans12.
Dada a disponibilidade de diferentes geneticamente modificada do mouse modelos faltando, por exemplo, moléculas de junção apertada BBB diferentes que podem causar alterações na função do BBB, metodologias para investigar a integridade do BBB são importantes. Além disso, recentemente desenvolvidas drogas poderiam impactar sobre os obstáculos do NVU. Aqui nós mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa com a glicoproteína do oligodendrocyte mielina (MOG)-peptídeo aa35-55 em adjuvantes de Freund completo. Explicamos como localizar infiltração de células imunes em toda as barreiras endoteliais e gliais o NVU e como estudar a integridade da barreira endotelial e gliais in vivo por detecção in situ de marcadores exógenos e atividade de gelatinase, respectivamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >AMCA anti-rabbit antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-045</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-CD45 Antibody (30F11)</td>
			<td >Pharmingen</td>
			<td >07-1401</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Laminin Antibody</td>
			<td >DAKO</td>
			<td >Z0097</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Breeding food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3336</td>
			<td ></td>
		</tr>
			<tr >
			<td >Individually ventilated cages, Blue line Type II or III</td>
			<td >e.g. Tecniplast	</td>
			<td >1145T, 1285L</td>
			<td ></td>
		</tr>	
		<tr >
			<td >BSA fraction V</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1391</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cold gelatine</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G 9391</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin jar + rack</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >H554.1; H552.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 anti-rat antibody</td>
			<td >Jackson ImmunoResearch</td>
			<td >111-156-144</td>
			<td >Store at 4 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover slips 24 x 40 mm # 1</td>
			<td >e.g. Thermo Scientific</td>
			<td >85-0186-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td>
			<td >e.g. Molecular probes</td>
			<td >D22910</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dextran Texas Red (3000 MW)</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D3328</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific; EnzCheck</td>
			<td >E12055</td>
			<td >Store at -20 &#176;C; protect form light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)</td>
			<td >e.g. Janvier Labs</td>
			<td ></td>
			<td >Females, 8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freezing box for histology slides</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >2285.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18G x 1&#189;&#8217;&#8217; (1.2mm x 40mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304622</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >27G x &#190;&#8217;&#8217; &#8211; Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >302200</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30G x &#189;&#8217;&#8217; (0.3 mm x 13 mm) injection needle</td>
			<td >e.g. BD, BD Microlance 3</td>
			<td >304000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td >e.g. Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-24648</td>
			<td >Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Maintenance food</td>
			<td >e.g. PROVIMI KLIBA SA</td>
			<td >3436</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MOGaa35-55 peptide</td>
			<td >e.g. GenScript</td>
			<td ></td>
			<td >Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microscope slides (Superfrost Plus )</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >J1800AMNZ</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mycobacterium tuberculosis H37RA</td>
			<td >e.g. BD</td>
			<td >231141</td>
			<td >Store at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl 0.9 %</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >3535789</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >O.C.T. compound (Tissue-Tek )</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Omnican 50 30G x &#189;&#8217;&#8217;</td>
			<td >B. Braun</td>
			<td >9151125S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Merck</td>
			<td >30525-89-4</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pertussis toxin</td>
			<td >e.g. List biological laboratories, Inc.</td>
			<td >180</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >81381</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protease Inhibitor EDTA free (Roche)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >4693132001</td>
			<td >Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >repelling pen e.g. DAKO Pen</td>
			<td >e.g. DAKO</td>
			<td >S2002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sealing film e.g. Parafilm M</td>
			<td >e.g Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7793</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silica gel</td>
			<td >e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td >9351.1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stitch scissor</td>
			<td >F.S.T</td>
			<td >15012-12</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 1 ml</td>
			<td >e.g. PRIMO</td>
			<td >62.1002</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe 10 ml</td>
			<td >e.g. CODAN Medical ApS</td>
			<td >2022-05</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vaporizer system Univentor 400</td>
			<td >UNO.BV</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing impairment of the endothelial and glial barriers of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo

A unidade neurovascular (NVU) é composta por células endoteliais microvasculares, formando a barreira hemato - encefálica (BBB), uma membrana basal endotelial com pericitos incorporados, e o limitans glia composta pela membrana basal parenquimatosa e hamartomas final-feed abraçando o aspecto abluminal do microvessels do sistema nervoso central (SNC). Além de manter o CNS homeostase o NVU controla tráfico de células imunes para o CNS. Durante immunosurveillance do SNC baixos números de linfócitos ativados podem atravessar a barreira endotelial sem causar disfunção BBB ou doença clínica. Em contraste, durante neuroinflammation tais como esclerose múltipla ou seu modelo animal encefalomielite auto-imune experimental (EAE) um grande número de células do sistema imunológico pode atravessar o BBB e, posteriormente, o limitans de glia eventualmente alcançando o parênquima do CNS levando a doença clínica. 
Migração de células imunes para o parênquima do CNS é, portanto, um processo de duas etapas que envolve uma migração sequencial através da barreira endotelial e glia do NVU empregando mecanismos moleculares distintos. Se após a sua passagem através da barreira endotelial, células T encontram seu antígeno cognato em células apresentadoras de perivascular sua reativação local irá iniciar mecanismos subsequentes, levando à ativação focal de gelatinases, que permitirá que as células T para atravessar a barreira glia e insira o parênquima do CNS. Assim, avaliar tanto, permeabilidade BBB e atividade da MMP na correlação espacial ao acúmulo de células imunes no SNC durante EAE permite especificar a perda da integridade das barreiras endoteliais e gliais do NVU. 
Aqui mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa e como analisar posteriormente permeabilidade BBB in vivo usando uma combinação de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos ainda mais, como Visualizar e localizar gelatinase atividade no cérebro de EAE por zymogaphy in situ, acoplada à imunofluorescência citológicas de membranas de porão do BBB e CD45 + invadindo as células imunes.

Avaliação do curso clínico da EAE em camundongos C57BL/6 deve resultar em uma curva de doença, conforme representado na Figura 2A e mudanças no peso do corpo do mouse conforme apresentado na Figura 2B. C57Bl/6 ratos imunizados com MOGaa35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença em torno de 10 a 12 dias após a imunização ativa (figura 1A). Normalmente, ratos imunizados mostram uma queda transitória de peso c...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo at JoVE.com

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Os métodos aqui apresentados permitem estudar os mecanismos moleculares da migração de células imunes através das barreiras cerebrais em encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal para esclerose múltipla. Ao investigar a permeabilidade da barreira hematoencefálica e a atividade de desoproteporase matricial ao mesmo tempo em correlação espacial com a infiltração de células imunes em seções de tecido cerebral, podemos associar precisamente esses eventos neuroinflamatórios aos sinais clínicos da EAE. O manuseio profissional de camundongos doentes precisa de treinamento aprofundado, bem como a pontuação correta dos sinais clínicos da EAE.Assim, a demonstração visual é benéfica. Inicie este procedimento com a anestesia de camundongos C57-Black/6 que foram alojados em condições específicas sem patógenos, conforme descrito no protocolo de texto. Corrija o rato anestesiado em uma mão, e injete 30 microliters de peptídeo MOG e complete a emulsão de Freund subcutânea em cada um dos flancos da perna traseira, perto dos linfonodos inguinais.Agora, coloque o rato em sua barriga, e injete 20 microliters da emulsão mog-peptídeo no tecido gorduroso macio tanto na esquerda quanto na direita na raiz da cauda. Além disso, injete uma gota da emulsão no pescoço do mouse. Injete 100 microliters de solução de toxina de coqueluche intraperitoneally no camundongo.Segure a cabeça do rato abaixo do centro do corpo para evitar a injeção no intestino. Substitua a dieta de manutenção da dieta de reprodução, a fim de fornecer aos camundongos alimentos de maior teor energético antes e durante a doença clínica esperada. Repita a injeção de toxina da coqueluche 48 horas após o primeiro tratamento.Verifique o estado de saúde dos ratos EAE todas as manhãs, dando uma olhada dentro das gaiolas. Marque ratos EAE todas as tardes. Tire cada rato incluído no experimento EAE da gaiola e verifique se a cauda tem tonus.Mova a cauda para cima com um dedo. Um rato saudável manterá a cauda para cima. Se a EAE clínica tiver começado, o tonus da cauda será menor, visível por uma queda gradual da cauda.Eventualmente, o mouse não será capaz de levantar sua cauda em tudo. Coloque cada rato incluído no experimento EAE no banco limpo para observar e documentar o comportamento de caminhada. Consulte o texto para critérios de pontuação para avaliação da gravidade da doença, que é o escore da EAE.Avalie e documente o peso de cada rato incluído no experimento. Para a preparação de soluções de estoque de dextran, dissolva 10 miligramas de três quilodalton Dextran Texas Red em 500 microliters de 0,9% solução de cloreto de sódio e cinco miligramas de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 em 250 microliters de 0,9% de solução de cloreto de sódio. Para a solução de trabalho dextran, pouco antes da injeção, pipeta 55 microliters de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solução de estoque em um pedaço de filme de vedação.Em seguida, adicione 55 microliters de três quilodalton Dextran Texas Red solução de estoque. Misture e colete 100 microliters em uma seringa fina descartável. Em seguida, coloque um rato anestesiado na posição lateral sobre a mesa.Injete por via intravenosa 100 microlitros de rastreadores fluorescentes no mouse antes que o rato acorde. Deixe o rastreador circular por 15 minutos antes de realizar a perfusão de ratos conforme detalhado no protocolo de texto. Encha um recipiente de de guerra plano com gelo seco esmagado e adicione 2-metilbutano até que o líquido atinja cerca de um centímetro acima da bolsa de gelo seca.Cubra com uma tampa solta, como uma tampa de balde de gelo. Depois de cortar a cabeça do rato perfusado com uma tesoura afiada, remova a pele e as orelhas usando um conjunto menor de tesouras. Disseca cuidadosamente a tampa do crânio cortando do forame magnum em direção à frente à esquerda e ao lado direito, para permitir o alongamento da tampa do crânio sobre o cérebro.Em seguida, retire cuidadosamente o cérebro intacto da base do crânio enquanto corta os nervos ópticos usando uma espátula de metal plano. Coloque o cérebro na folha de alumínio. Corte o cérebro em três pedaços colocando dois cortes coronais.As três peças representam o cérebro frontal, cérebro médio e cerebelo com tronco cerebral. Encha um Cryomold até o primeiro trimestre com uma matriz de corte de temperatura ideal. Em seguida, coloque as fatias cerebrais no Cryomold, com o lado anterior de cada peça cerebral voltada para baixo.Cubra o tecido completamente com matriz. Coloque o Cryomold com o tecido em uma orientação horizontal no banho de 2-metilbutano. Certifique-se de que o tecido congela da parte inferior para cima dentro de um minuto, evitando mergulhar todo o bloco de tecido no banho.Transfira o tecido congelado para menos 80 graus Celsius para armazenamento. Consulte o protocolo de texto para elaboração das seções de tecido congelado. Recuperar seções de tecido cerebral não fixa de seis mícrons que foram preparadas de camundongos EAE.Em um capô de fumaça, descongele as seções dentro da caixa de congelamento plástico contendo gel de sílica na tampa para evitar a retenção de água no tecido. Separe duas seções de tecido em um slide desenhando linhas com uma caneta repelente de água. Soluções de reação centrífuga por cinco minutos a 13.300 vezes g à temperatura ambiente, e pré-quente a 37 graus Celsius usando um banho de água.Em seguida, reidratar as seções teciduais por cinco minutos a 37 graus Celsius usando tampão de reação 1X. Após cinco minutos, despeje o tampão de reação 1X. Adicione a solução de reação nas seções teciduais e incubar por quatro horas a 37 graus Celsius.Em seguida, lave os slides cinco vezes em água duplamente destilada. Agora, conserte as seções por cinco minutos com metanol gelado a menos 20 graus Celsius antes de lavá-las uma vez com PBS em temperatura ambiente. Adicione 1%BSA em PBS à seção e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, descarte o tampão da seção invertendo a lâmina em um tecido. Adicione coquetel de anticorpos primários à seção e incubar por uma hora em temperatura ambiente. Depois de lavar as seções duas vezes com PBS, adicione coquetel de anticorpos secundários e incubar por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, lave as seções duas vezes com PBS e monte os slides com a solução de incorporação. Depois de deixar as seções montadas secarem durante a noite à temperatura ambiente, analise seções de tecido manchado usando um microscópio fluorescente. A gravidade da doença de EAE aumenta até o pico da doença, que pode ser esperada entre os dias 16 e 20 após a indução da EAE.No auge da EAE clínica, os camundongos também apresentaram o menor peso corporal, o que aumenta em correlação com a amenização da EAE na fase de remissão da doença. Mostrado aqui é uma imagem representativa do plexo coroide e do parênquim cerebral adjacente de um rato C57-Black/6 que sofre de EAE. O rato foi injetado por via intravenosa 15 minutos antes de se sacrificar.Os rastreadores prontamente se difundem através dos microvessels fenestrados no estoma do plexo coroóide, enquanto a barreira hematoencefálica não permite a difusão de rastreadores circulantes no parenchyma cerebral, que é, portanto, desprovido de qualquer sinal fluorescente. Estas imagens mostram vasos sanguíneos com vazamento representativo no cerebelo de um rato C57-Black/6 que sofre de EAE. Pontas de flecha indicam rastreadores difundidos através dos microvessels cerebrais no parênquim CNS, sugerindo que a função de barreira hematoencefálica é prejudicada nesses vasos.No parênquimo CNS, o sinal fluorescente verde e vermelho é visível fora das paredes dos vasos sanguíneos. A colocação subcutânea correta da emulsão MOG-CFA é essencial para montar a resposta imune apropriada que leva à EAE. A injeção intraperitoneal e intramuscular deve ser evitada.Prepare o CFA sob um capô de fumaça para evitar a inalação do Mycobacterium atenuado. Além disso, evite a autoinjeção com a emulsão MOG-CFA, pois isso pode causar condiloma ou até mesmo levar à EAE em indivíduos geneticamente predispostos. Células imunes infiltradas no cérebro podem ser isoladas do CNS de camundongos que sofrem de EAE para quantificar subconjuntos de células imunes infiltrados durante a neuroinflamação por citometria de fluxo.Avaliar a integridade da endotelial e das barreiras cerebrais gliais pode ser traduzido para a análise de modelos de camundongos geneticamente modificados ou para modelos de outras doenças neurológicas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Imunologia e Infecção

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superando indiferença em Encefalomielite autoimune experimental (EAE) linhagens mais resistentes por transferência adotiva e desafio antigênico

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzida Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) em murganhos C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualizando os Efeitos de escarro no desenvolvimento de biofilmes usando um modelo Chambered lamela

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...